水產(chǎn)品中喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留檢測(cè)方法的建立

金鑰，孫延斌，崔進(jìn)，梅連瑞，趙瑞，閆師杰，4，*，劉祥，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300308；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

水產(chǎn)品中喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留檢測(cè)方法的建立

金鑰1，2，孫延斌1，崔進(jìn)2，梅連瑞2，趙瑞3，閆師杰3，4，*，劉祥2，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300308；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

建立了水產(chǎn)品中24種獸藥殘留的QuEChERS結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定的分析方法。樣品經(jīng)1%醋酸乙腈提取離心后，加入到無水硫酸鈉的離心管中，上清液旋蒸至近干，甲醇溶解，經(jīng)C18填料凈化，氮吹濃縮，初始流動(dòng)相定容，0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。流動(dòng)相為水、乙腈（均含有0.1%甲酸），色譜柱為WatersBEHC181.7μm，2.1mm×100mm。在1μg/kg～20 μg/kg范圍內(nèi)，目標(biāo)獸藥的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，定量下限范圍為0.5μg/kg～1μg/kg。目標(biāo)化合物的回收率為69%～124%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%～19%。

UPLC-MS/MS；QuEChERS；水產(chǎn)品；喹諾酮類；磺胺類

磺胺類藥物和喹諾酮類藥物作為兩種廉價(jià)有效的人工合成抗菌藥物被廣泛大量的應(yīng)用于我國(guó)的高密度集約化養(yǎng)殖中，不當(dāng)超量的使用及不遵守休藥期造成該兩種藥物在動(dòng)物體內(nèi)積蓄殘留，會(huì)對(duì)人們的身體造成潛在的危害［1］。就此，許多國(guó)家及國(guó)際組織對(duì)不同基質(zhì)（豬、牛、羊、水產(chǎn)等）中的獸藥殘留制定了最大允許殘留限量（MRLs）［2-3］，如日本制定MRLs的獸藥和添加劑種類多達(dá)231種，歐盟為121種，CAC為57種，美國(guó)為87種，加拿大為85種，中國(guó)為134種。因此，建立一種靈敏、可靠、同時(shí)檢測(cè)技術(shù)十分必要。

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）［4-5］技術(shù)無需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)目標(biāo)物，具有高選擇性、高靈敏度、高通量的優(yōu)勢(shì)，使得該技術(shù)在食品安全分析中得到廣泛應(yīng)用。QuEChERS（一種新型前處理技術(shù)，快速Q(mào)uick、簡(jiǎn)單Easy、價(jià)廉Cheap、高效Effective、耐用Rugged、安全Safe的縮寫）［6-7］自問世以來被廣泛的應(yīng)用在農(nóng)藥殘留檢測(cè)的樣品處理中；由于其相對(duì)傳統(tǒng)獸藥殘留處理方法有諸多明顯優(yōu)勢(shì)，并逐步的應(yīng)用到獸藥的殘留分析［8］之中。目前，檢測(cè)方法已有報(bào)道，GABOR BALIZS等使用LC-MS檢測(cè)肉中的磺胺獸藥殘留［9］；Hubert Po-on Tang等建立了同時(shí)檢測(cè)4種大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、交沙霉素、北里霉素、泰樂菌素）、6種喹諾酮類（環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氟甲喹、惡喹酸、沙拉沙星）和林可霉素、維及霉素M1、三甲氧芐二氨嘧啶共13種殘留物的在線固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［4］以及孫偉紅等用HPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中18種磺胺類藥物殘留量［10］，但可以看出，同時(shí)檢測(cè)此兩類藥物的前處理通常較繁瑣，檢測(cè)成本高，而本文采用QuEChERS結(jié)合UPLCMS/MS對(duì)水產(chǎn)品中12種喹諾酮類和12種磺胺類獸藥同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，通過優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件及色譜、質(zhì)譜條件，建立了一次同時(shí)提取正離子模式測(cè)定喹諾酮類和磺胺類種藥物殘留的新方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司，AB Triple Quad 6500；美國(guó)安捷倫公司，Agilent 1290）；天平（Mettler-Toledo公司，ML204/02）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司，RV10）；離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司，PICOZ1）；氮吹濃縮儀（美國(guó)Organomation公司，OA-SYS）；超純水（屈臣氏蒸餾水）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；甲酸（ACS純，美國(guó)Sigma公司）；C18填料（天津博納-艾杰爾公司）；醋酸為優(yōu)級(jí)純；無水硫酸鈉為分析純。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：吡哌酸（CAS：51940-44-4）、西諾沙星（CAS：28657-80-9）、萘啶酸（CAS：389-08-2）、諾氟沙星（CAS：70458-96-7）、氧氟沙星（CAS：82419-36-1）、依諾沙星（CAS：74011-58-8）、單諾沙星（CAS：119478-55-6）、環(huán)丙沙星（CAS：93107-08-5）、洛美沙星（CAS：98079-52-8）、氟甲喹（CAS：42835-25-6）、恩諾沙星（CAS：93106-60-6）、沙拉沙星（CAS：91296-87-6）、磺胺嘧啶（CAS：68-35-9）、磺胺噻唑（CAS：72-14-0）、磺胺甲基嘧啶（CAS：127-79-7）、磺胺二甲嘧啶（CAS：57-68-1）、磺胺甲氧噠嗪（CAS：80-35-3）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉（CAS：18179-67-4）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（CAS：1037-50-9）、磺胺氯噠嗪（CAS：80-32-0）、磺胺多辛（CAS：2447-57-6）、磺胺甲惡唑（CAS：723-46-6）、磺胺異惡唑（CAS：127-69-5）、磺胺地索辛（CAS：122-11-2）均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；D8環(huán)丙沙星、D3磺胺鄰二甲氧嘧啶、D6磺胺間甲氧嘧啶均購(gòu)于德國(guó)Witega公司；D5恩諾沙星購(gòu)于加拿大TRC公司；D5諾氟沙星購(gòu)于加拿大C/D/N公司。各標(biāo)準(zhǔn)品純度均99.0%以上。

標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制：以乙腈為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度范圍在0.2 mg/mL～1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置棕色容量瓶避光4℃或-18℃保存，保存期為3個(gè)月；中間標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，保存期為1個(gè)月；用時(shí)根據(jù)需要，用初始流動(dòng)相對(duì)中間液進(jìn)行稀釋，稀釋成適當(dāng)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)工作液，保存期為1周。

1.2樣品前處理

取代表性背脊部分魚肉進(jìn)行破碎，其余貝類、蝦類取可食用部分進(jìn)行破碎，置于-18℃冰箱保存。稱取2 g（精確到0.01 g）破碎好的魚肉樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入10 ng的內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL 1%醋酸乙腈，勻漿混勻；5 000 r/min，離心5 min，上清液置于另一離心管中，重復(fù)提取2次，合并提取液；提取液加入裝有5 g無水硫酸鈉的離心管中，離心后上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在40℃、60 r/min減壓的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5mL甲醇，轉(zhuǎn)移至裝有C18填料的離心管中，用8 mL甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌圓底燒瓶，同樣轉(zhuǎn)移至裝有C18填料的離心管中，收集上清液，氮吹至近干；用2 mL流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS上機(jī)分析檢測(cè)。

1.3色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件

色譜柱為Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A為水，B為乙腈（均含有0.1%甲酸），梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1Program of gradient elution

分析時(shí)間為30 min，后運(yùn)行時(shí)間為5 min；流速為300 μL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

正離子模式掃描（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集方式（MRM）；霧化氣壓力（GS1）：413.7 kPa；輔助氣壓力（GS2）：413.7 kPa；氣簾氣壓力（CUR）：206.8 kPa；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；各化合物的碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2　24種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

續(xù)表2 24種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)Continue table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1提取劑的選擇

對(duì)于水產(chǎn)品中獸藥多殘留的同時(shí)測(cè)定，提取方式是關(guān)鍵，常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，以乙酸乙酯、甲醇溶液提取時(shí)，油脂等雜質(zhì)不易去除，而且對(duì)蛋白的沉積效果也一般。乙腈可避免從組織中提取出過多的脂肪，同時(shí)具有很好的蛋白沉積效果，因此，確定采用乙腈作為提取溶劑［11］。之后又對(duì)提取劑的酸度進(jìn)行優(yōu)化，考慮了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，用1%醋酸乙腈提取時(shí)，各藥物回收率大多數(shù)均在80%～120%之間，純乙腈的回收率只有60%在范圍內(nèi)，5%醋酸乙腈提取的藥物時(shí)，干擾物較多，回收率不穩(wěn)定。因此，本方法選擇1%醋酸乙腈作為提取劑。

2.1.2QuEChERS方法鹽析劑和吸附劑的選擇

鹽析劑在樣品提取時(shí)起到了重要的作用，可以防止樣品中的水分及水溶性雜質(zhì)進(jìn)入提取液，達(dá)到脫水和鹽析作用，還可促使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取效率［12-13］。分別比較了無水硫酸鈉、無水硫酸鎂，無水硫酸鎂和無水硫酸鈉混合鹽3種鹽析劑。無水硫酸鈉的雜峰少而且響應(yīng)最低，確定以無水硫酸鈉為鹽析劑。

吸附劑比較了C18、PSA及C18與PSA的混合物對(duì)水產(chǎn)品基質(zhì)的凈化效果及回收率。從得出結(jié)果顯示，C18的凈化效果和回收率較好。其他2種吸附劑凈化的樣品在過濾膜后均呈渾濁狀態(tài)。分析原因?yàn)镃18主要吸附的雜質(zhì)是脂類化合物，而PSA主要吸附脂肪酸、有機(jī)酸和色素等，而魚肉樣品的主要雜質(zhì)為脂類，正適合用C18去除雜質(zhì)。因此，選取C18作為試驗(yàn)的凈化吸附劑。

2.2質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

2.2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件中的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）的大小影響離子的豐度，與方法的靈敏度密切相關(guān)［14］。本文用乙腈配制的大約濃度為25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，以不連接液相，直接針泵進(jìn)樣的方式對(duì)24種組分以及5種內(nèi)標(biāo)物的去簇電壓及碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.2色譜條件的優(yōu)化

比較了Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse Plus C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱，結(jié)果顯示，Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）對(duì)24種化合物的分離情況及響應(yīng)值均高于其他，峰型尖銳且無漂移現(xiàn)象，對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)適用性更好，最終選擇Waters BEH C18色譜柱。

在液質(zhì)檢測(cè)中，甲醇、乙腈常作為流動(dòng)相，考慮乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，峰形較尖銳，較好定量，選擇乙腈作為流動(dòng)相［15］；甲酸有增強(qiáng)離子化的作用，提高方法的靈敏度，故本試驗(yàn)在水相和有機(jī)相中分別加入0.05、0.1、0.2%的甲酸進(jìn)行試驗(yàn)，從回收率方面看，當(dāng)添加0.1%甲酸時(shí)，回收率最高。根據(jù)以上優(yōu)化所得到的條件，24種獸藥及5種內(nèi)標(biāo)分離譜圖見圖1。

圖1　24種組分及5種內(nèi)標(biāo)組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1MRM chromatogram of 24 analytes and 5 internal standards mixed standard solution

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限采用魚肉（天津養(yǎng)殖的鯉魚、鰱魚、石斑魚，以及南美白對(duì)蝦、毛蛤、扇貝）陰性樣品進(jìn)行5點(diǎn)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制［15-16］，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以10倍信噪比計(jì)算24種獸藥的檢定量下限（LOQ）為0.5 μg/kg或1.0 μg/kg，各種藥物均低于我國(guó)規(guī)定的MRLs，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，24種獸藥在質(zhì)量濃度為1 ng/mL～20 ng/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。

表3　24種獸藥的定量下限、回歸方程、線性系數(shù)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3Limits of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 24 veterinary drugs（n=5）

3結(jié)論

本研究以鯉魚、鰱魚、石斑魚等作為樣本，采用1%醋酸乙腈提取，以QuEChERS方法為前處理方法，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）為流動(dòng)相，建立了UPLCMS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中24種獸藥殘留的分析方法。該方法目標(biāo)獸藥的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，定量下限范圍為0.5 μg/kg～1 μg/kg，回收率為69%～124%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%～19%。本方法檢測(cè)周期短、前處理技術(shù)簡(jiǎn)單，無需特殊實(shí)驗(yàn)裝置，實(shí)驗(yàn)成本低，為大批量水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便可靠的篩查方法。

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Establishment of Detection Method of Quinolones and Sulfonamides in Aquatic Products

JIN Yue1，2，SUN Yan-bin1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，ZHAO Rui3，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1.College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

A method was developed for the simultaneous determination of 24 veterinary residues by QuEChERS and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The sample was extracted with 1% acetonitrile acetic acid and centrifuged with centrifugal machine.The supernatant liquid was directly passed with anhydrous sodium sulfate.Then，the extract was evaporated under rotary evaporator，dissolved in methanol，passed with C18，the extract was evaporated under nitrogen stream and redissolved with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）.The HPLC separation was performed on Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm× 100 mm by gradient elution with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）as mobile phase.Under the optimal conditions，the veterinaries were larger than 0.99 in the linear range of 1 μg/kg-20 μg/kg，the limits of quantitation ranged from 0.5 μg/kg to 1 μg/kg.The recoveries of 24 veterinary at three spiked levels were between 69%and 124%，their relative standard deviations were in the range of 1%-19%.

UPLC-MS/MS；QuEChERS；aquatic products；quinolones；sulfonamides

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.029

2015-11-18

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2013YQ510391）

金鑰（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物性食品安全與營(yíng)養(yǎng)方面的研究。

閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究與教學(xué)。劉祥（1976—），男（漢），正高級(jí)工程師，博士，主要從事食品安全檢測(cè)與分析。