裙帶菜蛋白的提取工藝研究

馮建嶺，劉海燕，王麗麗，韓晴，李迎秋

（1．威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東威海264210；2．威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東威海264210；3．齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

裙帶菜蛋白的提取工藝研究

馮建嶺1，劉海燕2，王麗麗1，韓晴3，李迎秋3

（1．威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東威海264210；2．威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東威海264210；3．齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

以裙帶菜為原料，采用堿提法對(duì)裙帶菜蛋白的提取工藝進(jìn)行研究。通過(guò)控制單因素如料液比、pH、浸提溫度、浸提時(shí)間，尋找合適的試驗(yàn)條件，并在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析不同因素對(duì)裙帶菜蛋白提取的影響，確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時(shí)間3.5h，pH9。提取率可達(dá)84.85%。

裙帶菜；蛋白；提取工藝

裙帶菜（Undaria pinnatifida）又名海芥菜、裙帶，主要生長(zhǎng)在暖溫帶海洋中，美味可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，被稱為微量元素和礦物質(zhì)的“天然寶庫(kù)”［1］。此外，裙帶菜能幫助人體清除腸道內(nèi)的毒素，有助于人體的正常發(fā)育，提高免疫功能，還具有降低血壓和增強(qiáng)血管彈性等作用［2-3］。日本是世界公認(rèn)的長(zhǎng)壽國(guó)，其中主要原因之一就是裙帶菜每天必上餐桌，裙帶菜目前已成為日本、韓國(guó)兒童和學(xué)生營(yíng)養(yǎng)配餐的必備菜肴。在我國(guó)，雖然裙帶菜分布廣、產(chǎn)量高、資源豐富，但是利用率比較低。

裙帶菜中含有人體必需的八種氨基酸［4］，是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)來(lái)源，但目前在加工過(guò)程中，裙帶菜蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，為充分利用裙帶菜中營(yíng)養(yǎng)成分，提高裙帶菜蛋白提取率，本研究采用堿提法，對(duì)裙帶菜蛋白的提取工藝進(jìn)行探索，并做正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化［5］。這將有助于加深人們對(duì)裙帶菜的了解，同時(shí)有助于研究裙帶菜的活性成分及其藥理活性構(gòu)效關(guān)系，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

裙帶菜：購(gòu)買(mǎi)于威海寶河海藻生物有限公司；

氫氧化鈉（分析純）：購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶科技有限公司；

牛血清蛋白：購(gòu)買(mǎi)于上海伯奧生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LG10-2.4A型高速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10型酸度計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DK-98-ⅡA數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金南儀器廠；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Kjeltec 8100凱氏定氮儀：瑞典福斯分析儀器廠。

1.3方法

1.3.1裙帶菜的預(yù)處理

首先用清水將新鮮的裙帶菜沖洗干凈，去除相應(yīng)雜質(zhì)，然后用電熱鼓風(fēng)干燥箱（45℃）進(jìn)行干燥，經(jīng)粉碎機(jī)打碎，最后過(guò)100目篩制成裙帶菜粉，備用。

1.3.2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定［6-7］

采用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。取9支干凈的試管，編號(hào)為1～9，分別向其中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，再加入去離子水4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL，混合均勻。選用光程1 cm的適應(yīng)比色杯，在278 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各試管溶液的吸光度（A278nm）。

1.3.3裙帶菜蛋白提取率的計(jì)算［8］

蛋白質(zhì)提取率/%=m0/m1×100

式中：m0為上清液中蛋白質(zhì)的含量=（v×y×n）/ 1 000，單位為g；m1為裙帶菜粉中蛋白質(zhì)的含量（17.957 6%，由凱氏定氮法而得，本部分略），g；y= 0.576 9x+0.001 8（由標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線所得）；v為裙帶菜溶液體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.4裙帶菜蛋白的提取

1.3.4.1單因素試驗(yàn)

1）料液比對(duì)裙帶菜蛋白提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份裙帶菜粉各2 g，分別加入5個(gè)250 mL的燒杯中，配制成料液比為1∶10、1∶15、1∶ 20、1∶25、1∶30（g/mL）的樣液，調(diào)節(jié)pH值為8.5，置于50℃水浴3 h，6 000 r/min離心10 min。分別取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量吸光度（278 nm），計(jì)算裙帶菜蛋白提取率，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2）pH對(duì)裙帶菜蛋白提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份裙帶菜粉各2 g，分別加入5個(gè)250 mL燒杯中，配成料液比為1∶20（g/mL）的樣液，分別將樣液的pH值調(diào)至7、7.5、8、8.5、9、9.5，然后在50℃條件下水浴浸提3 h，配平后離心10 min（6 000 r/min）。分別取1 mL上清液，在278 nm波長(zhǎng)下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度，計(jì)算裙帶菜蛋白提取率，做3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

3）浸提溫度對(duì)裙帶菜蛋白提取的影響

準(zhǔn)確稱取6份裙帶菜粉各2 g，加入6個(gè)250 mL燒杯中，配成料液比為1∶20（g/mL）的樣液，調(diào)節(jié)pH值為9.5，分別在30、35、40、45、50、55℃條件下水浴3 h，于6 000 r/min離心10 min。分別取1 mL上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度（278 nm），計(jì)算裙帶菜蛋白提取率，試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

4）浸提時(shí)間對(duì)裙帶菜蛋白提取的影響

準(zhǔn)確稱取8份裙帶菜粉各2 g，分別加入8個(gè)250 mL燒杯中，配成料液比為1∶20（g/mL）的樣液，調(diào)節(jié)pH值至9.5，在50℃水浴條件下，分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h后配平離心10 min（6 000 r/min），再各取1 mL上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量278 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算裙帶菜蛋白質(zhì)提取率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4.2工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（正交試驗(yàn)）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響裙帶菜蛋白提取的料液比、pH值、浸提溫度、浸提時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　試驗(yàn)因素與水平Table 1Levels and factors of experiment

其中料液比分別取1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），pH值取8、8.5、9，浸提溫度取40、50、55℃，浸提時(shí)間取2.5、3、3.5 h。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在278 nm波長(zhǎng)的吸光度，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得線性公式y(tǒng)=0.576 9x+ 0.001 8，R2=0.999 9。

圖1　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of protein

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1料液比對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響

保持其他條件不變，不同料液比對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2　料液比對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響Fig.2Effects of ratio of solid to liquidon on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，最初隨著料液比的減小，蛋白質(zhì)提取率增加，當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，蛋白質(zhì)提取率是69.29%，料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，提取率上升至77.22%。再往后，隨著料液比的減小，提取率又發(fā)生下降，從1∶25（g/mL）～1∶30（g/mL），裙帶菜蛋白質(zhì)提取率基本在71%左右。而在食品工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，如果料液比降低，酸沉蛋白時(shí)乳清中溶解的球蛋白量會(huì)增大［9］，蛋白的損失量也就增加，成品的得率反而下降，并且料液比太小會(huì)增加后處理的負(fù)擔(dān)，使產(chǎn)品成本增大，因此堿液提取裙帶菜蛋白時(shí)，較適宜的料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.2pH值對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響

pH值對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

由圖3可知，隨pH值的增大，裙帶菜蛋白的提取率先變大后減小。在pH值從7增加到8.5時(shí)，蛋白質(zhì)提取率從54.11%增加到79.55%，而當(dāng)pH值大于8.5時(shí)，蛋白質(zhì)提取率卻呈下降趨勢(shì)，pH值為9時(shí)，蛋白提取率下降至73.35%，可能原因是在受到強(qiáng)堿影響后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此，最佳pH值應(yīng)該控制在8.5，此時(shí)蛋白提取率高而且不會(huì)影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。

圖3　pH值對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響Fig.3Effects of pH on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

2.2.3浸提溫度對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響

以裙帶菜蛋白提取率為指標(biāo)，保持其他條件不變，浸提溫度對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4　浸提溫度對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響Fig.4Effects of leaching temperature on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

從圖4可以看出，浸提溫度的高低對(duì)裙帶菜蛋白提取率有較大影響，在一定階段，隨著溫度的升高，裙帶菜蛋白就越容易溶解出來(lái)，提取率就越高。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，蛋白提取率為71.99%，40℃時(shí)提取率已上升至75.77%，當(dāng)溫度升至50℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到80.01%，而當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，蛋白提取率又迅速下降，55℃時(shí)，提取率已降為75.54%，溫度過(guò)高，蛋白開(kāi)始發(fā)生變性。因此，應(yīng)將浸提溫度控制在50℃，才能得到最佳裙帶菜蛋白提取率。

2.2.4浸提時(shí)間對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，浸提時(shí)間對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5　浸提時(shí)間對(duì)裙帶菜蛋白提取率的影響Fig.5Effects of leaching time on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

由圖5得知，在一定范圍內(nèi)，堿提時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率越高，達(dá)到一定時(shí)間后，提取率變得基本平穩(wěn)。其中，浸提時(shí)間在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h時(shí)，蛋白提取率分別為65.13%、66.46%、67.35%、70.44%、77.08%、78.22%、77.85%、77.56%。另外，在較高pH值或溫度下提取蛋白質(zhì)，延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)使裙帶菜蛋白的水解程度加深，而且會(huì)增加成本，所以對(duì)于提取時(shí)間要綜合考慮。因此，選擇浸提時(shí)間在3 h時(shí)，便可以得到較高的蛋白提取率。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以裙帶菜蛋白提取率為指標(biāo)，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件如表2所示。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Design and result of the orthogonal experiment

由表2可以看出，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)和極差分析，各因素對(duì)裙帶菜蛋白提取率影響的主次關(guān)系依次為A＞C＞D＞B，即料液比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間＞pH值，最優(yōu)組合是A2C2D3B3，從而得出裙帶菜蛋白最佳提取工藝條件：料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時(shí)間3.5 h， pH 9。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)正交試驗(yàn)得知，最佳工藝條件A2C2D3B3不在正交實(shí)驗(yàn)的9組實(shí)驗(yàn)中，因此在A2C2D3B3（料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時(shí)間3.5 h，pH 9）條件下進(jìn)行一次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得裙帶菜蛋白提取率可達(dá)84.85%。

3結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)裙帶菜蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果表明，影響裙帶菜蛋白的提取率的因素的主次關(guān)系依次為料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間、pH值，堿溶法提取裙帶菜蛋白的最佳工藝條件為：料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時(shí)間3.5 h，pH 9。在此條件下，裙帶菜蛋白的提取率可以達(dá)到84.85%，大大提高資源利用率，能夠拓展裙帶菜蛋白在產(chǎn)品中的應(yīng)用。

［1］劉元林.水產(chǎn)世界［M］.山東科學(xué)技術(shù)出版社，2007：114-115

［2］朱艷梅，王一飛，張美英，等.褐藻裙帶菜孢子葉粗提物體外抗單純皰疹病毒Ⅱ型活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18（1）：32-35

［3］王彩，施松善，王順春.裙帶菜多糖研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，16（1）：206-208

［4］蘇秀榕，李太武，丁明進(jìn).裙帶菜孢子葉營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1994，16（2）：236-238

［5］扶慶權(quán)，華春，陳全戰(zhàn).正交試驗(yàn)法優(yōu)化紅小豆蛋白提取工藝［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：248-250

［6］代增英.豆粕中堿性多肽的分離提取及抑菌特性的研究［D］.齊魯工業(yè)大學(xué)，2014

［7］陳婉玉，林洪平.紫外分光光度法測(cè)定蜂王漿中粗蛋白含量的探討［J］.中國(guó)蜂業(yè)，2011，62（1）：56-58

［8］吳鳳娜.海帶蛋白提取及理化性質(zhì)的研究［D］.濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012

［9］韓麗華.堿溶酸沉法生產(chǎn)大豆分離蛋白及影響質(zhì)量、出率的主要因素［J］.中國(guó)油脂，1998，23（6）：29-31

Study on the Extraction Process of Undaria pinnatifida Protein

FENG Jian-ling1，LIU Hai-yan2，WANG Li-li1，HAN Qing3，LI Ying-qiu3
（1.Weihai Center for Food and Drug Inspection，Weihai 264210，Shandong，China；2.Product Quality Supervision and Inspection of Weihai，Weihai 264210，Shandong，China；3.College of Food Science& Engineering，Qilu University Of Technology，Jinan 250353，Shandong，China）

Undaria pinnatifida as raw material，this experiment adopted alkali formulation to study extraction process of Undaria pinnatifida protein.Suitable experimental conditions were found by controlling single factors，such as ratio of solid to liquid，pH，leaching temperature，and leaching time.Moreover，orthogonal experiment was in process on the basis of single factors to analyze the effects of different factors on extraction of Undaria pinnatifida protein.The optimal process conditions were ratio of solid to liquid 1∶20（g/mL），leaching temperature 50℃，leaching time 3.5h，pH 10，and extraction ratio was 84.85%.

Undariapinnatifida；protein；extractionprocess

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.013

2015-05-03

馮建嶺（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。