清腦滴丸對大鼠腦缺血再灌注后炎性因子動態(tài)變化的影響

劉雪梅　王建偉　趙珈藝　王鳳麗　梁　曉

(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京，100078)

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清腦滴丸對大鼠腦缺血再灌注后炎性因子動態(tài)變化的影響

劉雪梅王建偉趙珈藝王鳳麗梁曉

(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京，100078)

目的：觀察清腦滴丸對大鼠急性腦缺血再灌注腦梗死面積，皮層腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-10(IL-10)改變，探討淸腦滴丸治療急性腦梗死的可能機制。方法：線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型(MCAO)，隨機分為正常組，假手術(shù)組，模型缺血1.5 h分別再灌注6 h、24 h、48 h、72 h、7 d，清腦滴丸各相應時間點治療組。TTC染色腦片計算梗死面積。酶聯(lián)免疫法檢測皮層IL-1β、TNF-α和IL-10。結(jié)果：腦組織TTC染色顯示模型各組均出現(xiàn)明顯梗死灶，在再灌24～72 h梗死面積最大(P<0.01)，清腦滴丸治療組的梗死面積明顯縮減，再灌24～72 h梗死面積減小最為明顯(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，再灌注6 h時IL-1β、TNF-α、IL-10出現(xiàn)升高，再灌注48～72 h達高峰(P<0.01)，至再灌注7 d仍有明顯升高。與各模型組比較，清腦滴丸治療組明顯下調(diào)IL-1β和TNF-α(P<0.01)；且能明顯上調(diào)IL-10(P<0.05～0.01)。結(jié)論：清腦滴丸能夠顯著下調(diào)腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β，上調(diào)IL-10，縮小腦梗死面積，減輕腦損傷，提示清腦滴丸治療急性腦梗死機制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子，促炎因子與抗炎因子達到動態(tài)平衡有關(guān)。

急性腦缺血再灌注；清腦滴丸；TNF-α；IL-1β；IL-10

腦缺血再灌注損傷可繼發(fā)性引起炎性反應，產(chǎn)生的一系列炎性細胞因子在腦缺血中發(fā)揮著雙重作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)是公認的炎性介質(zhì)，可以促進腦缺血損傷區(qū)黏附分子的表達和炎性細胞的浸潤[1]。白細胞介素-10(IL-10)作為抑炎細胞因子，可通過抑制炎性因子合成，受體表達等途徑起到保護腦組織的作用[2]。炎性反應的作用與急性腦缺血再灌注算上時間與程度密切相關(guān)。前期實驗發(fā)現(xiàn)清腦滴丸能夠使腦缺血再灌注大鼠的行為學神經(jīng)功能評分升高，腦組織病理損傷減輕。本研究動態(tài)觀察急性腦缺血再灌注不同時間引發(fā)不同程度腦損傷，檢測皮層TNF-α、IL-1β與IL-10，探討清腦滴丸治療急性腦梗死的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠168只，體重(220±20)g，購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2004-0003；清腦滴丸，由北京同仁堂藥業(yè)提供。IL-1β、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩公司生物科技有限公司。

1.2分組與給藥方法健康雄性SD大鼠，每組14只。分為：1)正常對照組：正常大鼠不手術(shù)。2)假手術(shù)組：大鼠麻醉后暴露頸總動脈，栓線從左側(cè)頸總動脈僅插入10 mm，未阻斷大腦中動脈；灌胃等體積生理鹽水。3)模型組：分為腦缺血1.5 h后再灌6 h模型組(Ischemia 1.5 h/Reperfusion 6 h，R6 h)、再灌24 h模型組(R24 h)、再灌48 h模型組(R48 h)、再灌72 h模型組(R72 h)，再灌7 d模型組(R7 d)。大鼠給予線栓法阻斷左側(cè)大腦中動脈1.5 h后拔出栓線，0.5 h后灌胃生理鹽水一次，以后每隔12 h灌胃1次，模型組各組分別在拔出栓線6 h、24 h、48 h、72 h、7 d后處死。4)清腦滴丸組：分為清腦滴丸(Q)6 h組、Q24 h組、Q48 h組、Q72 h組、Q7 d組。造模方法同模型組，術(shù)后0.5 h予灌胃清腦滴丸配制溶液(90 mg/kg)1次，以后每隔12 h給藥1次，各組分別在拔出栓線6 h、24 h、48 h、72 h、7 d后處死，與模型組在時間點上一一對應。

1.3腦缺血再灌注模型(MCAO)的建立參照Zea Longa[3]的方法加以改良，SD大鼠采用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切開，逐層分離組織，暴露左側(cè)頸總動脈(Common Carotid Artery，CCA)、頸外動脈(External Carotid Artery，ECA)、頸內(nèi)動脈(Internal Carotid Artery，ICA)，永久結(jié)扎CCA近心端、ECA根部，微動脈夾暫時夾閉CCA的遠心端，在CCA結(jié)扎處遠心端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入頂端光滑成球面的直徑0.24 mm的尼龍線，經(jīng)CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動脈(Anterior Cerebral Artery，ACA)的起始部，從而閉塞了大腦中動脈(Middle Cerebral Artery，MCA)的起始部，造成了MCA供血相關(guān)區(qū)的梗死。尼龍線平均插入深度為(18.5±0.5)mm，結(jié)扎CCA遠心端以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合皮膚，尼龍線末端暴露在體外。栓塞3 h、6 h、24 h、48 h、72 h后，拔出尼龍線，模擬急性腦缺血。假手術(shù)組除插線10 mm外，其余步驟同模型組。采用Zea Longa神經(jīng)癥狀評分，選1～3分的大鼠進行正式實驗。

表1　Zea Longa 5分制評分標準

1.4實驗方法

1.4.1每個時間點結(jié)束后，取7只大鼠新鮮腦組織去除嗅球，小腦和低位腦干，冠狀面均勻切5片，將切片放入1%TTC染液中，37℃水浴30 min，梗死部位呈白色，正常腦組織呈紅色。將切片依次擺好，拍照，采用Image-pro Plus 5.0軟件計算梗死面積。

1.4.2酶聯(lián)免疫法檢測IL-1β、IL-10、TNF-α濃度：每組取7只新鮮缺血側(cè)大腦皮層，按重量體積比加冰冷生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，ELISA試劑盒檢測。

2　結(jié)果

2.1腦缺血面積檢測TTC染色，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色。正常組和假手術(shù)組：大腦紅染，未發(fā)現(xiàn)任何白色梗死區(qū)域；再灌6～7 d模型各組均出現(xiàn)不同面積的白色梗死灶，再灌24～72 h梗死面積最大(P<0.01)，給予清腦滴丸治療后，各組白色梗死灶面積減小，再灌24～72 h梗死面積減小最為明顯(P<0.01)。結(jié)果見表2，圖1。

2.2IL-1β、TNF-α、IL-10濃度假手術(shù)組與正常對照組大鼠相比較，IL-1β、TNF-α、IL-10無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組再灌注6 h出現(xiàn)IL-1β升高，再灌注48 h達高峰(P<0.01)，至再灌注7 d仍有處于高值，統(tǒng)計學具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，在相應各時間點，清腦滴丸治療后，IL-1β在再灌注24 h開始出現(xiàn)降低，再灌注48～72 h降低最明顯(P<0.01)，在再灌注7 d仍有下降趨勢(P<0.01)。再灌注6 h時TNF-α出現(xiàn)明顯升高，再灌注48 h達到高峰，至7 d仍處于明顯升高狀態(tài)，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P<0.01)；與模型組比較，在相應各時間點，清腦滴丸治療后，TNF-α在再灌注6 h～7 d均有明顯降低(P<0.01)。再灌注6 h時IL-10出現(xiàn)升高，再灌注24～72 h升高達到頂峰，至再灌注7 d仍明顯高于假手術(shù)組，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，在相應各時間點，清腦滴丸治療后，IL-10升高明顯(P<0.05～0.01)，再灌注7 d無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

圖1　TTC染色

組別(Group)腦梗死面積(%)Control0Sham0R6h20.60±4.34**R24h31.43±2.78**R48h26.98±2.09**R72h29.84±3.84**R7d16.37±4.55**Q6h17.49±6.31△Q24h18.98±3.40△△Q48h17.56±2.54△△Q72h15.87±5.53△△Q7d12.32±3.48△

注：*P<0.05，**P<0.01與相同時間點假手術(shù)組比較；△P<0.05，△△P<0.01與相同時間點模型組比較。

表3　IL-1β、TNF-α、IL-10變化

注：*P<0.05，**P<0.01與相同時間點假手術(shù)組比較；△P<0.05，△△P<0.01與相同時間點模型組比較。

3　討論

正常情況下TNF、IL-1、IL-10等炎性因子的表達水平非常低，當發(fā)生急性腦缺血后，諸多炎性細胞因子的大量表達，可加重損傷腦組織。當發(fā)生急性腦缺血再灌注損傷，首先誘導前炎癥因子IL-1β、TNF-α大量產(chǎn)生，繼而刺激抗炎因子IL-10產(chǎn)生，促炎因子與抗炎因子之間的平衡失調(diào)，促進了炎性反應過程的發(fā)生發(fā)展。腦缺血再灌注后，細胞受到損傷，各種神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元和血管周圍的炎性細胞被激活，分泌大量的IL-1β，過多的、持續(xù)表達的IL-1β可以誘導黏附分子的表達，導致大量中性粒細胞在血管上黏附，釋放有害的炎性介質(zhì)，引起腦組織的損傷；同時IL-1β還可以激活內(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，導致腦缺血程度加重[4-5]。TNF-α是由多種細胞分泌的一類多向性細胞因子。腦缺血后，TNF-α有加重局部腦損傷的作用，其機制可能為：增加毛細血管通透性和開放血腦屏障；損傷神經(jīng)髓鞘和少突膠質(zhì)細胞；促進更多促炎細胞因子釋放，加重腦缺血后炎性反應等[6]。IL-10是一種抗炎細胞因子，可以抑制IL-1β和TNF-α產(chǎn)生，也可抑制細胞因子受體表達和激活。IL-10可通過抑制誘導型NO合成酶產(chǎn)生，減輕遲發(fā)性腦損傷，減少缺血后期NO生成，也可減少自由基產(chǎn)生，抑制細胞凋亡，發(fā)揮保護神經(jīng)作用[2]。急性腦卒中患者初期IL-10即可升高，且IL-10水平與病情嚴重程度呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后IL-10變化晚于TNF-α、IL-1β等，且隨著IL-10的升高，TNF-α、IL-1β明顯降低[7]，證實急性腦缺血再灌注損傷后促炎和抗炎是一個相互作用的過程，抗炎和促炎作用處于動態(tài)的非平衡狀態(tài)，導致?lián)p傷加重。

急性腦缺血屬中醫(yī)“中風病”范疇。自內(nèi)經(jīng)對中風病就有所描述，在“外風”“內(nèi)風”立論的基礎(chǔ)上，逐漸形成了基于風、火、痰、瘀、虛等主因的辨證體系，其中“火、瘀”作為主要的致病因素，已被歷代醫(yī)家所認可。王永炎院士提出“毒損腦絡”學說，認為臟腑功能和氣血運行失常，使體內(nèi)的病理或生理產(chǎn)物蘊積過多，以致邪氣亢盛敗壞形體而轉(zhuǎn)化為毒,強調(diào)瘀毒、痰毒、熱毒互結(jié),損傷腦絡的理論觀點[8]。清腦滴丸來源于王永炎院士的臨床經(jīng)驗方，由三七、梔子、冰片組成，梔子味苦，性寒，瀉火解毒，主要針對由火致毒，是解火毒的主要藥物，三七味甘辛，氣微寒，長于活血化瘀之功效，冰片味苦，性微寒，香竄善走，清熱瀉火，醒腦開竅。三藥合用共奏清熱解毒，活血宣竅之功效。本團隊前期臨床工作采用清腦滴丸用于治療腔隙性腦梗死之風火上擾兼瘀血證患者，發(fā)現(xiàn)其明顯改善患者的神經(jīng)功能缺損程度，尤其治療“善忘遲鈍、頭痛、眩暈、口苦咽干、大便秘結(jié)、舌苔黃”等火熱、血瘀的癥狀效果顯著。實驗研究也發(fā)現(xiàn)清腦滴丸可明顯減輕急性局灶性腦缺血大鼠腦組織病理損害，減輕酸中毒、抑制自由基損傷、恢復自由基代謝平衡，抑制黏附分子表達，調(diào)節(jié)炎性因子保護受損的腦組織[9-10]。從藥代動力學角度也發(fā)現(xiàn)急性腦缺血模型對清腦滴丸有效組分的生物利用度最高[11]。本研究證實清腦滴丸能夠顯著下調(diào)腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β，上調(diào)IL-10，縮小腦梗死面積，減輕腦損傷，提示清腦滴丸治療急性腦梗死可能與調(diào)節(jié)炎性因子，促炎因子與抗炎因子達到動態(tài)平衡有關(guān)，為該藥臨床治療提供了科研依據(jù)。

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(2015-12-28收稿責任編輯：洪志強)

Effects of Qingnao Dripping Pills on Dynamic Changes of Inflammatory Factors after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

Liu Xuemei, Wang Jianwei, Zhao Jiayi, Wang Fengli, Liang Xiao

(Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China)

Objective:To observe the cerebral infarct area and contents of tumor Necrosis Factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) and interleukin-10(IL-10) in rats with acute cerebral infarction, and discuss the mechanism of Qingnao dripping pills in treating such diseases. Methods:The rat models of focal cerebral ischemia and reperfusion were made by thread occlusion technique induced middle cerebral artery occlusion. Rats were randomly divided into 12 groups: control group, sham group, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h reperfusion respectively after 1.5 h ischemia by MCAO, and Qingnao dripping pills groups. Using TTC staining brain to measure infarction area, ELISA to measure IL-1β, TNF-α and IL-10. Results:TTC staining display model group had obvious infarcts, and the infarction area was the largest during 24 h to 72 h reperfusion(P<0.01); while after giving Qingnao dripping pills, the infarction area was significantly reduced(P<0.01). Compared with sham group, IL-1β, TNF-α and IL-10 appeared to rise at 6 h, and at 48 h and 72 h reached reperfusion peak (P<0.01). There was an increasing rise at 7d reperfusion. Compared with the model groups, IL-1β and TNF-α in the Qingnao dripping pills treatment group significantly decreased(P<0.01) and IL-10 obviously increased(P<0.05 ～ 0.01). Conclusion:Qingnao dripping pills can significantly decrease TNF-a and IL-1β and increase IL-10; thus reducing cerebral infarction area and improve brain damage. This may due to that it can modulate inflammatory factor, pro-inflammatory factor and anti-inflammatory factor to achieve dynamic balance.

Acute cerebral ischemia-Reperfusion; Qingnao dripping pills; TNF-α;IL-1β; IL-10

國家自然科學基金項目資助(編號：81202683)；北京中醫(yī)藥大學研究創(chuàng)新團隊項目(編號:2011-CXTD-23)

劉雪梅(1979.1—)，女，博士，副研究員，研究方向：中醫(yī)藥防治中風病機制研究，E-mail:liuxuemei04@126.com

R544+.9

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.007