靈芝孢子多糖含量不同方法測定的比較※

羅愛勤　陳　亮　李　菁

（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司/中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州510240）

靈芝孢子多糖含量不同方法測定的比較※

羅愛勤陳亮李菁

（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司/中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州510240）

目的比較3種不同方法測定靈芝孢子中多糖的含量。方法采用2015版《中國藥典》一部靈芝藥材項下收載的多糖含量測定方法，《保健食品功效成分檢測方法》（白鴻主編）中粗多糖的苯酚-硫酸分光光度測定法和葡聚糖的分光光度測定法測定靈芝孢子中多糖含量。結(jié)果10批靈芝孢子中，藥典蒽酮硫酸法測得的多糖百分含量均值為2.05%；苯酚-硫酸法測得的多糖百分含量均值為2.72%；葡聚糖分光光度法測得的多糖百分含量均值為1.09%。結(jié)論3種不同測定方法測定靈芝孢子的多糖含量存在較大的差異。

靈芝孢子；多糖；含量測定

靈芝是多孔菌科靈芝屬的一種藥用真菌，在我國具有悠長的藥用歷史［1］，靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從菌蓋彈射出來的極其細小的卵狀生殖孢子，靈芝孢子含有豐富的多糖、三萜、脂肪酸以及多種氨基酸及微量元素，在調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖方面有明顯作用［2-6］。近年來，靈芝孢子相關保健食品等產(chǎn)品發(fā)展迅速，市場上含靈芝孢子的產(chǎn)品繁多，但是，各類靈芝孢子產(chǎn)品的多糖含量卻參差不齊。目前，《中國藥典》（2015版）一部僅收錄了靈芝標準，規(guī)定靈芝的多糖含量測定法［7］，但靈芝孢子未載入藥典，尚未有靈芝孢子多糖含量測定法的國家標準。市售的靈芝孢子相關產(chǎn)品的多糖含量測定法，主要是企業(yè)根據(jù)中國藥典或《保健食品功效成分檢測方法》制定的企業(yè)標準，不同方法測得多糖含量的差異較大。本文采用三種測定法分別對十批靈芝孢子進行多糖含量測定，比較不同方法的差異［8，9］，為標準化靈芝孢子多糖含測的必要性提供了依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器BS210S型電子天平（德國Sartorius）、SHIMADZU UV-2550（島津杭州）、HHS型電熱恒溫油浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、W201B恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）、LXJ-IIB低速大容量多管離心機（上海棱譜儀器儀表有限公司）

1.2試藥靈芝孢子（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司）；D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院）；相對分子質(zhì)量5×105的葡聚糖對照品（Sigama公司）；銅試劑溶液（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司）；乙醇、蒽酮、苯酚、硫酸、氫氧化鈉等均為分析純；水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1藥典法測定靈芝孢子中多糖含量

2.1.1對照品溶液的制備取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.114 mg的溶液，即得。

2.1.2標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL，分別置10mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15分鐘，取出，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質(zhì)量為橫坐標，繪制標準曲線，見表1、圖1。

表1　葡萄糖標準曲線

圖1　葡萄糖標準曲線

2.1.3供試品溶液的制備取靈芝孢子，破壁，精密稱取破壁孢子粉2 g，置圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用水2.5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇37.5 mL，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液2 mL置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4樣品測定精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。計算公式：多糖含量=（A樣品-0.05）÷5.3238× 312.5÷M樣品÷1000×100%；其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱樣量（g）。結(jié)果見表2。

表2　靈芝孢子粉的多糖含量測定結(jié)果

從表2結(jié)果可知，藥典蒽酮硫酸法測得10批靈芝孢子的多糖含量均值為2.05%。

2.2苯酚硫酸分光光度法測定靈芝孢子中多糖的含量［10］（1）對照品溶液的制備取無水葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.03648 mg的溶液，即得。

（2）標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0分別置于25 mL比色管中，補加水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入硫酸10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱2分鐘，取出，冷卻至室溫，用分光光度計在485 nm波長處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，見表3和圖2。

表3　葡萄糖標準曲線

圖2　葡萄糖標準曲線

（3）供試品溶液的制備。取靈芝孢子，破壁，精密稱取破壁孢子粉1.2 g，置100 mL錐形瓶中，加水約80 mL，于沸水浴中加熱1 h，冷卻至室溫，濾過。濾液置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，準確吸取稀釋液2.0 mL，加入無水乙醇8.0 mL，混勻，于4℃冰箱靜置4 h以上，以4000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘渣用80%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心棄去上清液，反復操作3次。殘渣用水溶解并定容10 mL，搖勻，即得。

（4）樣品測定。精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL比色管中，照標準曲線制備項下的方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。計算公式：

其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱樣量（g）。結(jié)果見表4。

表4　靈芝孢子粉中多糖的含量

從表4結(jié)果可知，苯酚硫酸法測得10批靈芝孢子的多糖含量均值為2.72%。

2.3葡聚糖分光光度法測定靈芝孢子中多糖的含量［10］（1）葡聚糖標準儲備液配制準確稱取相對分子量5×105已干燥至恒重的葡聚糖標準品0.10225 g，加水溶解，并定容至10 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.225 mg葡聚糖。

（2）葡聚糖標準使用液配制吸取葡聚糖標準儲備液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖0.10225 mg。

（3）標準曲線制備。準確吸取葡聚糖標準使用液0、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 ml，分別置25 ml比色管中，準確補水至2.0ml，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，快速搖勻，快速加入濃硫酸10.0 ml，快速搖勻，置沸水浴中煮2 min，冷卻后用分光光度計在485 nm波長處以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測定吸光度值，以葡聚糖量（mg）為橫坐標，吸光度值（Au）為縱坐標，繪制標準曲線，見表5和圖3。

表5　葡聚糖標準曲線

圖3　葡聚糖標準曲線

（4）供試品溶液的制備。取靈芝孢子，破壁，精密稱取破壁孢子粉18 g，加水100 mL，于沸水浴上加熱2 h，取出，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，加水稀釋至100 mL，搖勻，準確吸取稀釋液2.0 mL置離心管中，加入無水乙醇8.0 mL，混勻5 min后，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘渣用80%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去清液，反復操作3～4次，殘渣用水溶解并定容至5.0 mL，搖勻，準確吸取定容后溶液2.0 mL置離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘渣用洗滌液洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%（體積分數(shù)）硫酸溶液2.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

（5）樣品測定。精密吸取供試品溶液2.0mL置25mL比色管中，照標準曲線制備項下的方法，自“加入50g/L苯酚溶液1.0mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中葡聚糖的含量，計算，即得。計算公式：

其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱樣量（g）。結(jié)果見表6。

表6　靈芝孢子粉中多糖含量測定

從表6結(jié)果可知，葡聚糖分光光度法測得10批靈芝孢子的多糖含量均值為1.09%。

3　討論

本文采用蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法和葡聚糖分光光度法測定十批靈芝孢子的多糖含量，發(fā)現(xiàn)不同測定方法測得的結(jié)果相差很大。廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊是在不添加任何輔料下，把破壁靈芝孢子粉加乙醇濕法制粒、干燥和填充所得的膠囊，其標示的粗多糖含量大于0.6%，而保健食品數(shù)據(jù)庫中其他已有保健食品批文的同類產(chǎn)品均標示多糖含量較高，但這些產(chǎn)品的多糖測定方法未有公開。廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊的多糖含量是采用葡聚糖分光光度法測定，所測得的是相對分子量較大的多糖，因此粗多糖的含量較低，但是筆者研究發(fā)現(xiàn)采用蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法測定廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊的多糖含量均大于2.0%。因此，筆者認為為了讓消費者能選擇到真正質(zhì)量更好的靈芝孢子系列產(chǎn)品，在規(guī)定多糖含量時，應該標準化多糖含量的測定方法。

［1］郭春沅.靈芝的藥理研究綜述［J］.中國食用菌，1998，17（3）：34-35.

［2］鄧海林，吳佩穎，王建新.靈芝的研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16（2）：141-143.

［3］李抒詩，于麗薇.靈芝中的化學成分及其藥物作用和保健價值［J］.中國醫(yī)藥指南，2009，7（4）：108-109.

［4］唐柳，張志軍，魏雪生，等.靈芝孢子粉藥理作用研究進展［J］.天津農(nóng)業(yè)科學，2011，17（3）：25-28.

［5］王衛(wèi)霄，呂艷茹，姚苗苗，等.靈芝孢子粉抗腫瘤活性的研究進展［J］.河北醫(yī)藥，2015，37（1）：105-107.

［6］周素娟，張曉娜.食用菌保健功能及保健食品應用與開發(fā)［J］.中國食用菌，2015，34（1）：4-6.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：188-189.

［8］陳永剛，劉曉涵，區(qū)計明，等.不同測定方法測定淫羊藿中總黃酮含量的比較［J］.食品科技，2009，34（5）：291-294.

［9］王香祖，吳建平，韓學平，等.苜蓿芽多糖含量不同測定方法的比較研究［J］.甘肅科技，2006，22（1）：174-175.

［10］白鴻.保健食品功效成分檢測方法［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011（5）：73-76，82-85.

Comparison of Different Methods for Determination of Polysaccharide in Ganoderma Lucidum Spore

LUO Aiqin，CHEN Liang，LI Jing
（Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.，Ltd./National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of TCM，Guangzhou 510240，China）

Objective To compare three different methods for the determinationof polysaccharides in Ganoderma lucidum spore. Methods Determination methods in the 2015 edition of"China Pharmacopeia"and"Phenol-sulfuric acid spectrophotometric method for the determination of crude polysaccharide"and"Spectrophotometric Determination of dextran"of"Health food efficacy component detection method（Bai Hong）"were applied to assay Ganoderma lucidum spore polysaccharide content.Results The experiment results showed that the average percent contents of polysaccharide with determine methods of"China Pharmacopeia"，" Phenol-sulfuric acid spectrophotometric method for the determination of crudepolysaccharide"and"Spectrophotometric Determination of dextran"were 2.05%，2.72%and 1.09%，respectively，in the 10 batchs of Ganoderma lucidum spore.Conclusion There is a big difference among three different methods for the determination of Ganoderma lucidum spore polysaccharide content.

Ganoderma lucidum spore；polysaccharide；determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.19.058

1672-2779（2016）-19-0132-03

：李海燕本文校對：蔣兆健

2016-06-14）

廣州市科技惠民專項對口科技幫扶專題（No：2014Y2-00539）