死亡谷芽孢桿菌NBIF-001防治灰霉病研究

黃大野周 婷姚經(jīng)武劉曉艷*曹春霞*楊妮娜胡洪濤龍 同楊自文

（1湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢430064；2武漢商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，湖北武漢430205）

死亡谷芽孢桿菌NBIF-001防治灰霉病研究

黃大野1周 婷2姚經(jīng)武1劉曉艷1*曹春霞1*楊妮娜1胡洪濤1龍 同1楊自文1

（1湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢430064；2武漢商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，湖北武漢430205）

為明確死亡谷芽孢桿菌NBIF-001菌株對(duì)灰霉病的防治效果，采用平板對(duì)峙結(jié)合顯微觀察確定其對(duì)灰霉病菌的抑菌活性，并采用離體組織試驗(yàn)研究其對(duì)黃瓜葉部灰霉病及貯藏期番茄果實(shí)灰霉病的防治效果。結(jié)果表明，在平板對(duì)峙條件下NBIF-001對(duì)灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，顯微鏡下觀察到菌絲發(fā)生扭曲、腫脹和變形；離體試驗(yàn)結(jié)果表明NBIF-001對(duì)灰霉病具有良好的生防效果，對(duì)黃瓜葉片灰霉病和番茄果實(shí)灰霉病的防效分別達(dá)到85.91%和72.52%。

死亡谷芽孢桿菌；NBIF-001菌株；灰霉?。簧佬Ч?/p>

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的作物灰霉病是一種為害嚴(yán)重的世界性病害，其寄主非常廣泛，可以侵染許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如蔬菜、水果和花卉等（Nambeesan et al.，2012），造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于缺少相應(yīng)的抗性品種，目前灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主。然而，灰霉病菌具有繁殖較快、適應(yīng)性強(qiáng)和遺傳變異較快等特點(diǎn)，極易產(chǎn)生抗藥性，已有灰霉病菌對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類、甲氧基丙烯酸酯類（Q0Is）及琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHIs）等類型殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道（Myresiotis et al.，2007；Banno et al.，2009；Kretschmer et al.，2009；Leroux et al.，2010）。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的使用也會(huì)造成農(nóng)藥殘留，危害人體健康，污染環(huán)境?；谏鲜鲈颍叫韪鼮榘踩行У姆乐畏椒?。近年來生物防治已經(jīng)成為替代傳統(tǒng)化學(xué)防治方法的有效手段（Ilhan & Karabulut，2013；Wei et al.，2014；Ge et al.，2015）。

死 亡 谷 芽 孢 桿 菌（Bacillus vallismortis）NBIF-001是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存的具有高殺線蟲活力的菌株（中國(guó)典型培養(yǎng)物中心保存號(hào)為CCTCC NO：M2015087），前期研究表明其對(duì)多種植物病原菌有良好的抑制作用（劉曉艷 等，2015），本試驗(yàn)研究死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)灰霉病的防治效果，旨在為生物防治灰霉病的田間示范和應(yīng)用推廣提供新的參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株：死亡谷芽孢桿菌NBIF-001，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離自云南香格里拉的土壤，并保存于本中心鏈霉菌資源庫(kù)；灰霉病菌也由本中心分離保存。供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑，由江蘇百靈農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)。供試作物為黃瓜，品種為中農(nóng)8號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015年9～12月在湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心試驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1平板對(duì)峙試驗(yàn) 接種NBIF-001于LB培養(yǎng)基中，24 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h備用。在PDA平板中央接種直徑為4 mm的灰霉菌菌餅，距離菌餅25 mm處4點(diǎn)接種NBIF-001發(fā)酵液，每個(gè)點(diǎn)5 μL；以不接種NBIF-001作為對(duì)照。25 ℃培養(yǎng)6 d，觀察抑菌效果。刮取抑菌帶邊緣灰霉病菌菌絲，在40倍顯微鏡（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）下觀察其與對(duì)照菌絲的區(qū)別。

1.2.2死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)量的影響 采用液體培 養(yǎng)法，在100 mL的PD培養(yǎng)基中分別加入體積不等的上述1.2.1中制備的NBIF-001發(fā)酵液，經(jīng)孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾除菌，濾液分別稀釋為1/200、1/100和1/20，以加入等量的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照，然后在每個(gè)搖瓶中接入4個(gè)直徑為4 mm的灰霉病菌菌碟，在20 ℃、180 r·min-1條件下光照搖培96 h，用干凈的紗布過濾獲得菌絲，之后放在80 ℃的烘箱中干燥約24 h，至菌絲完全干燥，再測(cè)定菌絲的干質(zhì)量，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)3個(gè)搖瓶。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=〔（對(duì)照菌絲干質(zhì)量-發(fā)酵濾液處理后的菌絲干質(zhì)量）/對(duì)照菌絲干質(zhì)量〕×100%

1.2.3死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)黃瓜葉部灰霉病的防治 按照NY/T 1156.9—2008，采集葉齡一致、充分展開、帶有1～2 cm葉柄的健康黃瓜葉片，用濕棉球包裹葉柄放置在培養(yǎng)皿中，保濕備用。按照1.2.1制備NBIF-001發(fā)酵液，芽孢濃度為1×108cfu·mL-1，將其噴施于葉片背面至葉面藥液飽和，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10片葉。以供試50%多菌靈可濕性粉劑為對(duì)照藥劑，稀釋至50 μg·mL-1，噴施至葉面飽和?？瞻讓?duì)照為噴施清水，噴施至葉面飽和。待藥液風(fēng)干后接種一個(gè)直徑為4 mm的灰霉病菌菌餅于葉片背面，在23 ℃、相對(duì)濕度90%條件下培養(yǎng)，待對(duì)照充分發(fā)病后統(tǒng)計(jì)病斑直徑，并計(jì)算防效。

防效=（對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑）/對(duì)照病斑直徑×100%

1.2.4死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)貯藏期番茄果實(shí)灰霉病的防治 按照Z(yǔ)hang等（2013）的方法，灰霉菌在PDA平板25 ℃培養(yǎng)14 d，之后用無(wú)菌水刷取并制備孢子懸浮液，將其混入0.05%的吐溫80，隨后用紗布過濾，使用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)到5×104個(gè)·mL-1。從市場(chǎng)購(gòu)買生長(zhǎng)一致、外皮沒有破損的番茄。在番茄中部相對(duì)應(yīng)的兩側(cè)用接種針打取3 mm×3 mm孔，滴入10 μL NBIF-001發(fā)酵液（芽孢濃度為1×108cfu·mL-1），風(fēng)干后滴入10 μL灰霉孢子懸浮液，25 ℃保濕培養(yǎng)6 d，對(duì)照藥劑和空白對(duì)照同1.2.3，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10個(gè)番茄果實(shí)。

2　結(jié)果與分析

2.1死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)灰霉病菌的離體抑制效果

平板對(duì)峙培養(yǎng)6 d后可以觀察到灰霉病菌和NBIF-001之間有明顯抑菌帶（圖1），在光學(xué)顯微鏡下，與對(duì)照菌絲相比，抑菌帶邊緣灰霉病菌菌絲發(fā)生扭曲、腫脹和變形（圖2）。

圖1　平板對(duì)峙培養(yǎng)　

圖2　顯微鏡下NBIF-001對(duì)灰霉病菌菌絲形態(tài)的影響（40×）

2.2死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

不同濃度NBIF-001發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)都有很強(qiáng)烈的抑制作用（表1），發(fā)酵濾液稀釋20倍時(shí)，菌絲干質(zhì)量為對(duì)照的1/23，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果高達(dá)95.71%；隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加，其抑制效果呈明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵濾液稀釋100倍時(shí)，菌絲干質(zhì)量為對(duì)照的1/3，其抑制效果為69.29%；當(dāng)發(fā)酵濾液稀釋200倍時(shí)，菌絲干質(zhì)量不到對(duì)照的2/3，仍有42.14%的菌絲生長(zhǎng)抑制效果。

表1　NBIF-001對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)黃瓜葉部灰霉病的防治效果

如表2所示，1×108cfu·mL-1死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)黃瓜葉部灰霉病具有良好的防治作用，發(fā)酵液對(duì)其防治效果達(dá)到了85.91%，與對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑相當(dāng)。

表2　NBIF-001對(duì)黃瓜葉部灰霉病的防效

2.4死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)貯藏期番茄果實(shí)灰霉病的防治效果

如表3所示，25℃、儲(chǔ)存6 d，死亡谷芽孢桿菌在濃度為1×108cfu·mL-1條件下能有效防止番茄灰霉病的發(fā)生，防效達(dá)到72.52%，與對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑相當(dāng)。

表3　NBIF-001對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防效

3　結(jié)論與討論

Zhao等（2010）研究表明，死亡谷芽孢桿菌ZZ185對(duì)一些植物病原真菌如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、 立 枯 絲 核菌（Rhizoctonia solani）、栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、稻瘟病菌（Magnaporthe grise）等具有良好的抑制效果，本試驗(yàn)結(jié)果表明，死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)灰葡萄孢也有較好的抑制效果。

離體試驗(yàn)結(jié)果表明，死亡谷芽孢桿菌NBIF-001對(duì)貯藏期果實(shí)和葉部灰霉病具有良好的防治效果，田間防治效果需要進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)定。死亡谷芽孢桿菌能分泌桿菌霉素D（Bacillomycin D）、表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin A）、豐原素（fengycin）等抑菌活性物質(zhì)（Park et al.，2006；Zhao et al.，2010；Kaur et al.，2015），本試驗(yàn)中，NBIF-001菌株發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，分泌可溶性抑菌物質(zhì)可能是其防治灰霉病菌的一個(gè)關(guān)鍵因子，其分泌抑菌物質(zhì)的種類需要進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。Ann等（2013）之前研究表明死亡谷芽孢桿菌EXTN-1菌株產(chǎn)生小分子化合物3-羥基-2丁酮，具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、防治病害發(fā)生、促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的作用。小分子物質(zhì)誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性在NBIF-001菌株防治灰霉病中的作用需要進(jìn)一步探究。另外，NBIF-001菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化和劑型也需進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期為今后田間的應(yīng)用與推廣奠定基礎(chǔ)。

劉曉艷，程賢亮，張光陽(yáng)，鄭明川，劉翠君，江愛兵，饒犇，方偉，楊自文，閔勇，黃大野.2015.一種死亡谷芽孢桿菌NBIF-001及發(fā)酵方法和應(yīng)用.專利：中國(guó)CN105018391A.

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Studies on Controlling Effect of Bacillus vallismortis NBIF-001 on Gray Mold

HUANG Da-ye1，ZHOU Ting2，YAO Jing-wu1，LIU Xiao-yan1*，CAO Chun-xia1*，YANG Ni-na1，HU Hong-tao1，LONG Tong1，YANG Zi-wen1
（1Biopesticide Engineering Research Center of Hubei Province，Wuhan 430064，Hubei，China；2Wuhan Trade Vocational College，Wuhan 430205，Hubei，China）

In order to evaluate control effect of Bacillus vallismortis on gray mold of antagonistic bacterium strain NBIF-001，this paper determined its inhibition activity to the pathogen of Botrytis cinerea by dual culture method combined with optical microscope observation；and studied its controlling effects on cucumber leaf grey mold and tomato fruit grey mold by in vitro tissue test.The results showed that the strain NBIF-001 had high inhibition activity in dual culture.Optical microscope study revealed deformation of hyphal and enlargement of cytoplasmic vacuoles.In vitro tissue test shew that NBIF-001 exhibited better biological control effect on cucumber and tomato gray mold.The control effect reached 85.91% and 72.52%， respectively.

Bacillus vallismortis；NBIF-001；Gray mold；Biological control effect

黃大野，男，博士，助理研究員，專業(yè)方向：作物病害生物防治，E-mail：xiaohuangdaye@126.com

（

s）：曹春霞，女，碩士，研究員，專業(yè)方向：農(nóng)藥劑型研究，E-mail：Caochunxia@163.com；劉曉艷，女，博士，副研究員，專業(yè)方向：土傳性病害生物防治，E-mail：xiaoyanliu6613@163.com

2016-06-24；接受日期：2016-09-08

湖北省農(nóng)科院競(jìng)爭(zhēng)性項(xiàng)目（2015 jzxjh04，2016 jzxjh026），國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31500428），湖北省農(nóng)科院創(chuàng)新崗位項(xiàng)目（2016-620-000-001-038）