響應(yīng)面法優(yōu)化野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝

蔡雨晴，賈棹東，吳茜茜，白紅進(jìn)，2，蔣卉，2*

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

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響應(yīng)面法優(yōu)化野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝

蔡雨晴1，賈棹東1，吳茜茜1，白紅進(jìn)1，2，蔣卉1，2*

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了乙醇濃度、浸泡時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法獲得野生酸棗仁總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，野生酸棗仁總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度64.46%、浸泡時(shí)間12 h、超聲時(shí)間44.02 min、超聲溫度62.86℃，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮理論提取率為1.00984%，實(shí)際總黃酮提取率為0.9269%。

酸棗仁；總黃酮；超聲波；響應(yīng)面分析法

酸棗仁是鼠李科（Rhamnaceae）植物酸棗的種子，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗生津等功效，是較為常用的鎮(zhèn)定安眠的中草藥。酸棗仁中主要化學(xué)成分有多糖、黃酮、生物堿、皂苷、三萜、脂肪酸及氨基酸等化合物（張巧月等，2015；林海成等，2015）。李游（2009）研究認(rèn)為，黃酮類物質(zhì)為酸棗仁主要有效成分之一。

目前對(duì)酸棗仁總黃酮提取工藝的研究較少，且國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化提取工藝（張吉祥和歐來(lái)良，2012；谷建等，2009）。由于這些方法本身的特點(diǎn)，一般采用線性數(shù)學(xué)模型擬合試驗(yàn)結(jié)果與影響因素間的關(guān)系，而不適合用二次多項(xiàng)式，試驗(yàn)次數(shù)較少，精密度較低，預(yù)測(cè)性比較差。響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，精密度和預(yù)測(cè)性較好，可信度較高。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁總黃酮的提取工藝，建立預(yù)測(cè)模型，旨在為酸棗仁總黃酮提取供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器野生酸棗仁，于2014年11月采集于陜西省渭南市澄城縣交道鎮(zhèn)阿蘭寨村。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）；石油醚、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LD500搖擺式中草藥粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）；Sartorius-SQP電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；721-100紫外-可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）；RE-50B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；儀表恒溫水浴鍋（上海申光儀器儀表有限公）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；800型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理將酸棗仁粉碎，過(guò)20目篩，稱取一定量的酸棗仁粉置于索氏提取器中，用10倍體積的石油醚（60～90℃）、60℃水浴回流脫脂2次，每次回流3 h，并回收石油醚。將脫脂后的酸棗仁粉混勻后密封干燥保存。

1.2.2酸棗仁總黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12.00 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解，超聲助溶，定容，得濃度為1.20 mg/mL蘆丁溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。

參照刁海鵬等（2004）的方法，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm測(cè)其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光度（A）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2樣品中總黃酮提取率的測(cè)定供試樣品溶液的制備：精確稱取2.000 g酸棗仁粉，以乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為12 h，在超聲功率為150 W，超聲溫度為60℃的條件下超聲提取40 min，提取液以3000 r/min離心20 min，即得供試樣品溶液。

取5 mL供試樣品溶液于50 mL容量瓶中，按測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的方法測(cè)定樣品溶液吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。計(jì)算公式（李游，2009）為：

式中：C為總黃酮提取液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；M為酸棗仁的質(zhì)量，g。

1.2.3超聲波輔助提取總黃酮單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)精確稱取酸棗仁粉2.000 g，選擇乙醇濃度0%、20%、40%、60%、80%、100%，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡時(shí)間4、8、12、16、20、24 h，超聲時(shí)間10、20、30、40、50、60 min，超聲溫度30、40、50、60、70、80℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)因素對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁總黃酮提取工藝在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，以乙醇濃度、浸泡時(shí)間、超聲溫度、超聲時(shí)間為自變量，酸棗仁總黃酮提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。在0.06～3.0 mg/mL濃度時(shí)，吸光度（A）與標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1乙醇濃度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響在料液比為1∶20，浸泡時(shí)間為8 h，超聲功率150 W，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，選取0%、20%、40%、60%、80%、100%乙醇考察乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次，不同乙醇濃度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2　乙醇濃度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，提取率達(dá)到峰值，然后隨著乙醇濃度的增大，提取率逐漸下降，可能是由于乙醇濃度的增大影響了黃酮類化合物的溶解度，導(dǎo)致提取率下降，因此確定最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2料液比對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，浸泡時(shí)間為8 h，超聲功率為150 W，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，分別選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，考察料液比對(duì)總黃酮提取率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次，不同料液比對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3　料液比對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，提取率達(dá)到峰值，然后隨著料液比的增大提取率逐漸下降，因此確定最佳料液比為1∶25。

2.2.3浸泡時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，超聲功率為150 W，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，浸泡時(shí)間分別選取4、8、12、16、20、24 h，考察不同浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次，不同浸泡時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖4所示。

圖4　浸泡時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著浸泡時(shí)間的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，提取率達(dá)到峰值，然后隨著浸泡時(shí)間的增大提取率逐漸下降，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間浸泡使黃酮類化合物氧化破壞，因此確定12 h為最佳浸泡時(shí)間。

2.2.4超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為12 h，超聲功率為150 W，超聲溫度為40℃的條件下，選取超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次，不同超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖5所示。

圖5　超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，提取率達(dá)到峰值，然后隨著超聲時(shí)間的增大提取率逐漸下降，可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降，因此確定最佳超聲時(shí)間為40 min.

2.2.5超聲溫度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時(shí)間為12 h，超聲功率150 W，超聲時(shí)間為40 min的條件下，選取30、40、50、60、70、80℃不同超聲溫度，考察溫度對(duì)總黃酮提取率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3次，不同超聲溫度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖6所示。

圖6　超聲溫度對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖6可知，隨著超聲溫度的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)超聲溫度達(dá)到60℃時(shí)，提取率達(dá)到峰值，然后隨著超聲溫度的增大提取率呈下降趨勢(shì)，可能是溫度影響了黃酮化合物的穩(wěn)定性，因此確定60℃為最佳超聲溫度。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料液比為1∶25，超聲功率為150 W，選擇4個(gè)重要的因素乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度、浸泡時(shí)間為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　響應(yīng)面回歸模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到乙醇濃度（A）、浸泡時(shí)間（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲溫度（D）四因素三水平的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

模型的可靠性可通過(guò)方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9611，說(shuō)明該模型擬合較好，試驗(yàn)數(shù)值與預(yù)測(cè)值比較接近。由表3可知，模型F值為24.7226，P＜0.0001，說(shuō)明該回歸模型達(dá)到了極顯著水平。失擬項(xiàng)P=0.5355＞0.05，說(shuō)明失擬不顯著，因而可以用該模型對(duì)酸棗仁總黃酮提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸模型和方差分析可知，方程交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、D2對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響達(dá)到極顯著水平。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)椋阂掖紳舛龋ˋ）＞浸泡時(shí)間（D）＞超聲時(shí)間（B）＞超聲溫度（C）。

圖7～12為根據(jù)擬合模型繪制的酸棗仁總黃酮提取率的三維響應(yīng)面和等高線圖，等高線圖可直觀地反映各因素對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的交互作用程度。由等高線可以直觀的反映出各因素與對(duì)酸棗仁黃酮提取的影響。等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著。由圖7、10、11可以看出兩因素的等高線呈馬鞍形，表明乙醇濃度（A）與浸泡時(shí)間（D）、超聲時(shí)間（B）與浸泡時(shí)間（D）、超聲溫度（C）與浸泡時(shí)間（D）兩兩交互作用顯著。由響應(yīng)面圖可以看出乙醇濃度（A）對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的影響最大，因?yàn)榍€最為陡峭。

利用Design-expertV 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化處理，得到超聲波輔助提取酸棗仁總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度64.46%，浸泡時(shí)間12 h，超聲溫度62.86℃，超聲時(shí)間44.02 min，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮理論提取率為1.00984%，實(shí)際總黃酮提取率為0.9269%。

圖7　乙醇濃度、浸泡時(shí)間相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

圖8　乙醇濃度、超聲時(shí)間相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

圖9　乙醇濃度、超聲溫度相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

圖10　浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

3　結(jié)論

本試驗(yàn)以脫脂后的酸棗仁為材料，采用超聲波輔助提取其總黃酮，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，用Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立了乙醇濃度、浸泡時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁總黃酮提取率的回歸模型，并對(duì)模型進(jìn)行失擬，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法具有可信度，能夠較好地預(yù)測(cè)酸棗仁總黃酮的提取率。得到超聲波輔助提取酸棗仁總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度64.46%，浸泡時(shí)間12 h，超聲溫度62.86℃，超聲時(shí)間44.02 min，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮提取率為1.00984%，實(shí)際操作得到酸棗仁總黃酮提取率為0.9269%。

圖11　浸泡時(shí)間、超聲溫度相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

圖12　超聲時(shí)間、超聲溫度相互作用對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面趨勢(shì)圖（a）和等高線（b）

［1］刁海鵬，呂俊杰，曹曉峰.蒲公英花中總黃酮含量測(cè)定［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（2）：178～179.

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The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen.The effects of ethanol concentration，soaking time，ultrasonic temperature，ultrasonic time and material to liquid ratio on extraction rate of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were examined，and on the basis，the optimum extraction technology was obtained via response surface methodology.The results showed that the best extraction conditions for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were as follows:ethanol concentration was 64.46%，soaking time was 12 h，ultrasonic time was 44.02 min，ultrasonic temperature was 62.86℃，the theoretic extraction rate for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen was 1.00984%，and the actual extraction rate was 0.9269%.

Zizyphi spinosi semen；total flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

中國(guó)·豬營(yíng)養(yǎng)國(guó)際論壇

S816.7

A

1004-3314（2016）03-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160306

浙江大學(xué)馥莉食品研究院基金資助項(xiàng)目（KY201404）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410757011）