日糧中不同稻殼替代水平對(duì)19～28日齡仔鵝腸道微生物區(qū)系的影響

蔡中梅，王志躍，楊海明

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

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科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

日糧中不同稻殼替代水平對(duì)19～28日齡仔鵝腸道微生物區(qū)系的影響

蔡中梅，王志躍*，楊海明

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

本試驗(yàn)旨在利用PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）技術(shù)研究日糧中不同稻殼替代水平對(duì)19～28日齡揚(yáng)州鵝腸道微生物區(qū)系的影響。選用19日齡揚(yáng)州公鵝260只，隨機(jī)分成4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)13只。A組飼喂基礎(chǔ)日糧，B、C、D組分別飼喂7%、14%、21%稻殼替代的基礎(chǔ)日糧。在28日齡時(shí)采集各腸段內(nèi)容物進(jìn)行總DNA的提取，對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用DGGE電泳技術(shù)分析腸道微生物區(qū)系。結(jié)果顯示：不同稻殼替代水平對(duì)十二指腸、空腸、盲腸菌群條帶總數(shù)量影響不明顯，但共有條帶存在一定差異；十二指腸、空腸各組間菌群相似性程度均較低，盲腸組間相似性程度最高。由此可見(jiàn)，不同程度的稻殼替代能夠影響腸道菌群分布，其中對(duì)十二指腸、空腸影響較大，對(duì)盲腸影響較小。

揚(yáng)州鵝；稻殼替代水平；變性梯度凝膠電泳；微生物；腸道

鵝是草食性動(dòng)物，在其空腸后段、回腸、盲腸內(nèi)存在大量微生物，所以鵝在利用粗纖維方面具有較大優(yōu)勢(shì)。Hamer（2008）認(rèn)為，纖維物質(zhì)能為腸道微生物菌群提供能量。此外，微生物菌群對(duì)纖維類物質(zhì)進(jìn)行代謝可產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如短鏈脂肪酸、維生素、氨基酸等。戰(zhàn)利（2012）研究指出，高水平纖維日糧能顯著影響鵝腸道微生物菌群多樣性。劉蓓一（2012）研究發(fā)現(xiàn)，不同纖維水平對(duì)鵝盲腸菌群的調(diào)控起主要作用，盲腸微生物種類會(huì)隨著纖維水平的提高而增加，且盲腸中以不可培養(yǎng)的細(xì)菌為主。

以前微生物研究大多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，重復(fù)性差，且絕大多數(shù)腸道菌群需要厭氧環(huán)境，而目前厭氧培養(yǎng)技術(shù)還不是很完善。隨著16S rRNA為基礎(chǔ)的分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多可鑒定不可培養(yǎng)微生物新技術(shù)相繼出現(xiàn)。變性梯度凝膠電泳（DGGE）因其準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物胃腸道菌群研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)擬用PCR-DGGE技術(shù)研究不同稻殼替代水平日糧對(duì)揚(yáng)州鵝各腸段微生物區(qū)系的影響，為進(jìn)一步探討鵝消化纖維機(jī)制積累理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)選用260只健康、體重基本一致的19日齡揚(yáng)州鵝公鵝，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)13只。其中A組飼喂基礎(chǔ)日糧，B、C、D組分別飼喂7%、14%、21%稻殼替代日糧。

1.2日糧組成與飼養(yǎng)管理基礎(chǔ)日糧參照美國(guó)NRC標(biāo)準(zhǔn)（1994）、前蘇聯(lián)畜牧科學(xué)研究所（1985）的建議及本教研室歷年研究成果進(jìn)行配制（張宏福，1995），基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)鵝采取網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食飲水，常規(guī)免疫程序免疫。

表1　基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3樣品采集于28日齡宰殺試驗(yàn)鵝，每組取5只，無(wú)菌操作，取各腸段內(nèi)容物，將同組5只鵝的各腸段內(nèi)容物均勻混合，并快速置于-70℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1腸道菌群總DNA的提取按照TIANamp Stool DNA Kit（TIANGEN）試劑盒的使用說(shuō)明來(lái)提取鵝各腸段微生物總DNA。提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2總DNA的定量及純度檢測(cè)DNA的含量用Spectrophotometer DNA定量?jī)x（Thermo公司）進(jìn)行測(cè)定，采用OD260/OD280方法檢測(cè)DNA的純度。用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA片段的大小。

1.4.3總DNA的PCR擴(kuò)增利用大腸桿菌16S rRNA V3區(qū)的片段基因設(shè)計(jì)合成通用引物。F338-GC為5’端加40個(gè)堿基的“GC”發(fā)夾：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'與R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按照2×Tap PCR MasterMix（TIANGEN）試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。最后用1.0%瓊脂糖電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4變性梯度凝膠電泳用8%的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。變性劑濃度為45%～60%。在1×TAE緩沖液、80 V、60℃條件下電泳12 h。電泳結(jié)束后用硝酸銀溶液染色，顯影后在Vilber凝膠成像掃描系統(tǒng)上進(jìn)行成像。

1.5數(shù)據(jù)分析使用Quantity One分析軟件包（Bio-rad公司）對(duì)各條帶進(jìn)行分析。通過(guò)相似性指數(shù)（Cs）來(lái)比較不同稻殼替代水平日糧對(duì)鵝各腸段微生物多樣性的影響，計(jì)算公式如下：

式中：Nx為x泳道的條帶數(shù)；Ny為y泳道的條帶數(shù)；j為2個(gè)泳道共有的條帶數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1腸道微生物總DNA及PCR產(chǎn)物大小試驗(yàn)結(jié)果表明，除回腸之外，各腸段DNA純度較高，DNA片段大小在23 kb左右。由圖1可見(jiàn)，總DNA經(jīng)16S rRNA V3區(qū)引物擴(kuò)增后可得到約200 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，效果較好，可用于后續(xù)的DGGE分析。

圖1　各腸段菌群16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

2.2不同稻殼替代水平對(duì)腸道微生物區(qū)系的影響各試驗(yàn)組樣本經(jīng)DGGE分離出數(shù)目不一樣的電泳條帶，且條帶在遷移率及強(qiáng)度上存在一定的差異（圖2）。十二指腸、空腸、回腸、盲腸的平均條帶數(shù)為16.25、16、9.25、30.5條，說(shuō)明鵝盲腸菌群最豐富，其次是十二指腸和空腸，回腸菌種最少，尤其是D組回腸微生物條帶僅為4條。

由圖2可知，十二指腸各處理組間條帶數(shù)量相近，但共有性條帶較少，差異條帶較多。如1是A、B、D組共有條帶，C組和D組之間存在差異條帶2、3，差異不明顯，A組和B組之間存在差異條帶4、5、6，A組和C組雖然條帶數(shù)相同，但差異條帶較多。相比于十二指腸，空腸各組間共有條帶相對(duì)較多，且21%稻殼替代組微生物條帶數(shù)最多。回腸微生物數(shù)量最少，其中D組只有4個(gè)條帶，除了A組和B組含有較多共同條帶，其他各組間菌群組成差異較大，只有1種相同微生物甚至沒(méi)有，如A組和D組。盲腸各處理組間條帶遷移位置相近，不同處理組間大部分為共性條帶，但也有差異性條帶。如圖中a、b是前三組的共有菌，不存在于D組中，而c代表的微生物存在于B、C、D組，在A組中不存在。A組和B組之間存在差異條帶e、f和g等。

圖2　各腸段微生物DGGE電泳條帶示意圖

除此之外，各處理組間部分條帶的粗細(xì)有所不同。條帶的粗細(xì)不同表明微生物DNA濃度有差異。條帶越粗，代表該種微生物含量越高，反之則越少。

2.3不同處理組間菌群相似性分析Cs值越大，表明兩組樣品的相似性程度越高。由表2可知，十二指腸各組間相似性程度都較低，其中A組和C組相似性指數(shù)最低，僅為28.6%，說(shuō)明兩組間差異條帶較多?？漳c各組間相似性指數(shù)較小，但與十二指腸相比，其組間相似性程度稍高?；啬c各組間除A組和B組相似程度較高之外，其他各組間幾乎沒(méi)有相似性。盲腸各組相似性程度最高。其中B組和C組之間相似性指數(shù)最大，為87.1%。A組和D組之間相似性程度最低，為73.3%，說(shuō)明兩組之間差異條帶相對(duì)較多。隨著稻殼替代比例的增加，D組與其他3組條帶相似性程度都相對(duì)較低。

表2　各腸段4組間主要菌群的相似性分析指數(shù)

3　討論

即使在相同日齡、環(huán)境、日糧營(yíng)養(yǎng)水平等條件下，宿主微生物菌群也會(huì)表現(xiàn)出不同的DGGE指紋圖譜，說(shuō)明個(gè)體對(duì)腸道菌群組成影響很大。不同個(gè)體腸道菌群分布、種類及數(shù)量均有差異。van der Wielen等（2002）研究指出，同一日齡肉雞即使飼養(yǎng)在相同環(huán)境中并且飼喂同種飼料，結(jié)果微生物菌群卻呈現(xiàn)出不同的帶譜，表明個(gè)體因素對(duì)腸道細(xì)菌群落組成具有重要影響作用。陳波等（2012）研究表明，影響腸道微生物多樣性的因素有很多，其中腸道菌群結(jié)構(gòu)因個(gè)體差異而極為不同。Cong等（2007）對(duì)2～15只雞分別混合后的樣品圖譜進(jìn)行觀察與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)以上的個(gè)體樣品混合才能代表整體菌群組成。所以為了盡可能避免個(gè)體因素而引起的差異，本試驗(yàn)每組采集5只鵝各腸段內(nèi)容物均勻混合以便提取的總DNA更具有代表性。

微生物菌群數(shù)量的多少依賴于日糧成分和營(yíng)養(yǎng)濃度的變化。Awati（2005）研究指出，日糧組成影響健康動(dòng)物腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種，其中日糧纖維影響較大。鵝與其他家禽不同，其盲腸中存在大量微生物，能夠消化利用適量的粗飼料。日糧纖維可作為碳水化合物被體內(nèi)微生物發(fā)酵，部分分解成揮發(fā)性脂肪酸被動(dòng)物吸收利用。黨國(guó)華和王恬（2005）研究指出，鵝消化粗纖維所獲得的能量中6%～18%來(lái)自于纖維素，2%～4%來(lái)自于半纖維素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著稻殼替代比例增加，盲腸微生物多樣性最豐富，且條帶也呈增加趨勢(shì)。這與劉蓓一（2012）、張名愛(ài)等（2007）研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為不同纖維水平的日糧主要對(duì)鵝盲腸菌群多樣性起主要作用，盲腸中微生物種類隨纖維水平的提高而增加。胡敏華和胡民強(qiáng)（2010）研究指出，日糧中粗纖維水平在5.03%～8.98%，肉鵝腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量隨著纖維水平的上升而顯著增加，其可能的原因是家禽內(nèi)源性消化酶不能降解非淀粉多糖，致使其中的養(yǎng)分流入后段腸道，從而引起細(xì)菌的增殖。

圖譜中條帶的數(shù)量及位置反映了微生物菌群的多樣性。本試驗(yàn)中，28日齡雛鵝十二指腸、空腸、回腸、盲腸的平均條帶數(shù)分別為16.25、16、9.25、30.5。其中回腸微生物含量最少，盲腸微生物多樣性最豐富，盲腸段A組和B組雖然條帶數(shù)相同，但相似性指數(shù)僅為79.3%，說(shuō)明對(duì)日糧進(jìn)行7%稻殼替代會(huì)使兩組差異條帶數(shù)增加。D組與其他各組相似性程度相對(duì)較低，原因可能是隨著稻殼替代比例的增加，D組菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且部分條帶的種類和數(shù)量可能也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化?？梢?jiàn)，日糧中纖維水平的增加，會(huì)促使盲腸段部分微生物菌種的出現(xiàn)或數(shù)量的增加。至于菌種及其數(shù)量還需進(jìn)一步的克隆測(cè)序及細(xì)菌定量測(cè)定來(lái)完成。

4　結(jié)論

4.1隨著稻殼替代比例的增加，十二指腸、空腸菌群條帶數(shù)相對(duì)較穩(wěn)定，盲腸微生物條帶數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但差異不大。

4.2十二指腸、空腸各組間菌群組成差異較大，盲腸各組間菌群組成相似性程度較高。

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This experiment was conducted to study the effects of different proportions of rice husk replaced diets on intestinal microflora of geese from 19～28 days by denaturing gradient gel electrophoresis.Two hundred and sixty 19-dayold healthy Yangzhou geese were randomly assigned into 4 groups with 5 replicates of 13 geese each.The control group（A）were fed with basic diet（A）；groups B，C，D were fed with 7%，14%，21%rice husk replaced diets，respectively.The genomic DNA was extracted from the content of various intestinal segments at the age of 28 days.The V3 variable region of bacterial 16S rRNA was amplified with universal primer.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of the amplicons were analyzed.The results showed that different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the band quantity of microflora in duodenum jejunun，and cecum of geese，the common bands were different.And different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the microflora similarity degree in duodenum and jejunum，the similarity index in cecum was maximal.Therefore，different proportions of rice husk replaced diets mostly affected intestinal microflora of duodenum and jejunum and rarely affect the cecum.

Yangzhou geese；rice husk replaced level；denaturing gradient gel electrophoresis；microflora；intestine

S815

A

1004-3314（2016）03-0009-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160302

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-43-27）；揚(yáng)州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”資助