勝利油田沾3區(qū)塊油藏中Geobacillus菌的激活研究

李彩風(fēng)，李 陽，吳昕宇，曹嫣鑌，汪衛(wèi)東，包木太

（1.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島266100；2.中國石化股份勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營257000；3.中國石油化工股份有限公司，北京100728；4.中國石油大學(xué)信息與控制工程學(xué)院，山東青島266580）

勝利油田沾3區(qū)塊油藏中Geobacillus菌的激活研究

李彩風(fēng)1，2，李 陽3，吳昕宇4，曹嫣鑌2，汪衛(wèi)東2，包木太1

（1.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島266100；2.中國石化股份勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營257000；3.中國石油化工股份有限公司，北京100728；4.中國石油大學(xué)信息與控制工程學(xué)院，山東青島266580）

利用16S rRNA克隆文庫技術(shù)分析勝利油田沾3區(qū)塊油藏樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)，使用不同激活劑對沾3區(qū)塊油藏樣品進行內(nèi)源微生物激活，對激活后樣品進行乳化能力、產(chǎn)生表面活性物質(zhì)能力評價及微生物群落結(jié)構(gòu)分析，并開展物理模擬驅(qū)油實驗。結(jié)果表明：沾3區(qū)塊油藏樣品中含有2%的Geobacillus，該菌是沾3區(qū)塊油藏內(nèi)源微生物中產(chǎn)生表面活性物質(zhì)、發(fā)揮乳化功能的關(guān)鍵菌群；加入適宜的激活劑體系可以選擇性激活該類細菌，使其成為優(yōu)勢菌；利用選擇性激活Geobacillus的配方激活沾3區(qū)塊油藏內(nèi)源微生物，可以在水驅(qū)基礎(chǔ)上提高原油采收率10.8%。

Geobacillus；乳化能力；激活；內(nèi)源微生物；微生物種群

Geobacillus是2001年國際上新命名的一類細菌［1］，由于其具有嗜熱、兼性厭氧，降解烴和產(chǎn)生表面活性劑的特性，在微生物采油、環(huán)境治理等領(lǐng)域中有潛在應(yīng)用價值；同時這類細菌可能具有特殊的功能基因和特種酶，對構(gòu)建工程菌亦具有重要的研究價值［2-4］。在火山口、溫泉等高溫環(huán)境中均可分離到Geobacillus菌屬的菌株。此外，Geobacillus菌株并不是單獨存在于環(huán)境中，而是與其他細菌共存形成一個生物多樣性的群體。在60℃的中高溫條件下，Geobacillus一般處于優(yōu)勢地位［5-6］。夏文杰等［7］從大慶油田油藏樣品中分離到一株Geobacillus sp WJ-2，在有氧或厭氧、45～75℃下生長良好，最適溫度為65℃，能以原油為唯一碳源生長并合成生物表面活性劑。徐爽等［8］從甘肅玉門油田油藏樣品中分離到1株可降解原油并具有很好乳化活性的嗜熱菌株Geobacillus pallidus，最適生長溫度為60℃，生長pH值為5.5～9.5，該菌還能降解原油中重質(zhì)組分，提高原油流動性，改善原油品質(zhì)［8］。筆者對勝利油田沾3區(qū)塊油藏地層水中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行克隆測序分析，研究Geobacillus菌屬在高溫油藏的分布和激活規(guī)律，進一步模擬沾3區(qū)塊油藏條件，在水驅(qū)基礎(chǔ)上評價Geobacillus菌屬的驅(qū)油潛力。

1 材料與方法

1.1 激活樣品

微生物激活樣品為勝利油田沾3區(qū)塊3口油井產(chǎn)出液的混合樣品，該區(qū)塊油藏溫度63℃，地層水總礦化度7.0～10.0 g/L。

1.2 激活劑

1#激活劑：蔗糖30g/L，NaNO32g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO412H2O 1.4 g/L，酵母粉0.5 g/L。

2#激活劑：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

3#激活劑：NH4Cl 1.0 g/L，K2HPO40.2 g/L，Mg-SO40.2 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，NaNO31.0 g/L，KH2PO40.1 g/L，原油5 g/L。

1#激活劑體系參考了文獻檢索到的適宜Geobacillus生長的培養(yǎng)基［9］，2#激活劑為LB培養(yǎng)基［10］，適合大多數(shù)微生物的生長，3#激活劑為無機鹽配方，適合烴類降解菌的生長。

1.3 實驗方法

1.3.1 內(nèi)源微生物菌群分析

對樣品進行16S rRNA克隆文庫分析，由華大基因公司完成。

1.3.2 內(nèi)源微生物激活培養(yǎng)

在血清瓶中加入沾3區(qū)塊地層水，然后分別加入上述不同激活劑體系。于65℃下進行高溫靜止培養(yǎng)，2、5、8、12、15 d后進行菌液取樣，通過不同指標對比激活劑體系的激活效果。

1.3.3 激活后樣品中總菌數(shù)檢測

將培養(yǎng)不同時間的內(nèi)源微生物激活樣品進行不同倍數(shù)稀釋后，利用血球計數(shù)板在顯微鏡下進行微生物總菌數(shù)的檢測。

1.3.4 乳化能力測定

在試管中加入5 mL柴油和5 mL激活樣品，渦旋振蕩器充分振蕩1 min，60℃靜置24 h后測量乳化層高度，以乳化指數(shù)表示激活樣品的乳化能力。乳化指數(shù)等于乳化層高度占有機相總高度的分數(shù)［11］。

1.3.5 擴油圈測定

采用擴油圈法測試油藏樣品和富集樣品中是否存在表面活性物質(zhì)［12］，本文中對擴油圈法進行了改進。取一培養(yǎng)皿，加入含0.1%蘇丹紅的液體石蠟，中心滴加激活后樣品，中心油膜被擠向四周形成一圓圈，觀察圓圈直徑，圓圈直徑與表面活性劑含量和活性成正比。

1.3.6 物理模擬驅(qū)油實驗

裝填巖心；巖心抽真空飽和沾3區(qū)塊地層水；測孔隙度和滲透率參數(shù)；飽和油并計算原始含油飽和度；一次水驅(qū)至巖心產(chǎn)出液含水率98%；65℃下連續(xù)注入0.3VP（VP為孔隙體積）激活劑；培養(yǎng)12 d；二次水驅(qū)至含水率100%結(jié)束。

2 結(jié)果分析

2.1 沾3區(qū)塊地層水菌群結(jié)構(gòu)分析

對沾3區(qū)塊地層水的微生物群落結(jié)構(gòu)進行16S rRNA基因克隆文庫分析，結(jié)果如圖1所示。文庫覆蓋率均超過90%，可以準確地反映油藏樣品的微生物多樣性；Shannon指數(shù)為2.11，說明該樣品中微生物群落的多樣性高，微生物種類豐富；Pielou均勻度指數(shù)為0.88，表明樣品中微生物呈均勻分布，不存在明顯的優(yōu)勢物種。其中弓形菌（Arcobacter）、熱硫還原桿菌（Thermodesulforhabdus）占文庫比例超過20%，為相對占優(yōu)勢的種群，Geobacillus菌屬占文庫比例2%，為非優(yōu)勢種群。

圖1 沾3區(qū)塊地層水菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.1 Microbial diversity of reservoir water of Zhan 3 block

2.2 地層水激活后總菌數(shù)檢測

沾3區(qū)塊地層水采用3種激活劑激活培養(yǎng)，激活后總菌數(shù)隨時間變化情況見圖2。可以看出，設(shè)計的3種激活劑均能激活油藏樣品中的內(nèi)源微生物，1#激活劑和2#激活劑激活培養(yǎng)8 d后菌液密度達到最高，分別為5.0×108個/mL和3.5×108個/ mL，無明顯差別，3#激活劑激活培養(yǎng)12 d后菌液密度達到最高，為1.8×108個/mL，低于前兩種激活劑激活效果。

圖2 地層水激活后總菌數(shù)Fig.2 Total number of bacteria in activted reservoir water

2.3 地層水激活后乳化能力測試

利用3種不同的激活劑激活樣品中的內(nèi)源微生物，不同時間取樣進行乳化指數(shù)測定。圖3顯示1#激活劑激活的樣品乳化效果較好，培養(yǎng)3 d后，開始出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，培養(yǎng)8 d后，乳化指數(shù)最高可達98%，之后略有降低。2#激活劑激活樣品后無明顯乳化效果。3#激活劑培養(yǎng)5 d后，開始出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，培養(yǎng)12 d，乳化指數(shù)最高達80%。證明1#激活劑和3#激活劑中的營養(yǎng)成分有利于激活樣品中代謝產(chǎn)生物表面活性劑的油藏微生物，1#激活劑激活效果最佳。

圖3 地層水激活后的乳化指數(shù)Fig.3 Index of emulsification of activted reservoir water

2.4 地層水激活后擴油圈測試

擴油圈檢測實驗顯示培養(yǎng)8 d后，1#激活劑激活的樣品擴油圈直徑最大可達6 cm，2#激活劑激活樣品擴油圈直徑最大為1 cm。培養(yǎng)12 d后，3#激活劑激活樣品擴油圈直徑最大為3 cm。表明1#激活劑激活樣品產(chǎn)生的表面活性劑量相對較高。隨著激活時間的延長，擴油圈直徑有所降低，與上述乳化指數(shù)的變化相似。

圖4 地層水激活后的擴油圈直徑Fig.4 Diameter of exclusive circle by oil spreading method of activted reservoir water

2.5 地層水激活后菌群結(jié)構(gòu)分析

圖5 激活劑激活后樣品菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 Microbial diversity of actived reservoir water by activators

對1#激活劑、2#激活劑激活8 d后的樣品和3#激活劑激活12 d后的樣品進行16S rRNA基因克隆文庫分析，結(jié)果見圖5。與激活前沾3區(qū)塊地層水菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖1）相比，3個激活劑激活后樣品中微生物種群數(shù)明顯減少，優(yōu)勢種群突出。1#激活劑、2#激活劑激活后樣品中均含有Bacillus thermoamylovora、Achromobacter、Geobacillus，推測這3類細菌更適應(yīng)沾3區(qū)塊油藏環(huán)境，加入激活劑體系后相比其他菌群生長繁殖能力更強。1#激活劑激活后樣品中 Bacillus thermoamylovora、Achromobacter和Geobacillus所占比例分別為18%、4%和78%，2#激活劑激活后樣品中這3類細菌所占比例分別為78%、16%和6%。3#激活劑激活后樣品中Geobacillus、Achromobacter和Arcobacter所占比例分別為80%、8%和12%，表明這3類細菌均具有烴類降解功能，在沾3區(qū)塊油藏環(huán)境條件下，Geobacillus降解烴類的能力最強。綜合菌群結(jié)構(gòu)、乳化能力和擴油圈分析結(jié)果，Geobacillus是沾3油藏內(nèi)源微生物中產(chǎn)生表面活性物質(zhì)、發(fā)揮乳化功能的關(guān)鍵菌群，并且1#激活劑可以在沾3區(qū)塊復(fù)雜的內(nèi)源微生物類群中選擇性激活Geobacillus，使其成為優(yōu)勢菌，激活效果最佳。

2.6 內(nèi)源微生物驅(qū)油

如表1所示，0為空白巖心，1、2和3分別為注入1#激活劑、2#激活劑和3#激活劑激活內(nèi)源微生物進行驅(qū)替的巖心。其中空白巖心二次水驅(qū)提高采收率1.8%，而3組實驗巖心二次水驅(qū)提高采收率分別為12.6%、3.0%和8.0%，計算得出3組實驗巖心激活內(nèi)源微生物在一次水驅(qū)基礎(chǔ)上提高原油采收率分別為10.8%、1.2%和6.2%。同時，對巖心驅(qū)替液進行顯微鏡觀察，結(jié)果見圖8。1#巖心產(chǎn)出液發(fā)現(xiàn)有大量乳化油滴存在，油滴直徑約為10 μm。2#巖心產(chǎn)出液無明顯乳化油滴存在，3#巖心產(chǎn)出液中發(fā)現(xiàn)乳化油滴存在，但數(shù)量明顯少于1#巖心產(chǎn)出液。對1#巖心、2#巖心和3#巖心產(chǎn)出液分別進行16S rRNA基因克隆文庫分析，結(jié)果與3種激活劑激活地層水后菌群結(jié)構(gòu)相似。上述結(jié)果表明，在沾3油藏條件下，激活Geobacillus能夠產(chǎn)生生物乳化劑等有利于驅(qū)油的代謝產(chǎn)物，充分發(fā)揮其原油乳化功能，大幅度提高原油采收率，1#激活劑對Geobacillus的激活效果最好。

表1 內(nèi)源微生物驅(qū)提高采收率結(jié)果Table 1 Results of enhanced oil recovery by endogenous microorganism flooding

圖6 1#巖心產(chǎn)出液的顯微鏡觀察Fig.6 Microscope observation of produced fluid of core 1#

3 結(jié) 論

（1）勝利油田沾3區(qū)塊油藏微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其中存在Geobacillus，但其所占比例較低，僅為2%。加入合適的激活劑體系可以選擇性激活該類細菌，使其成為優(yōu)勢菌。

（2）Geobacillus是沾3區(qū)塊油藏內(nèi)源微生物中產(chǎn)生表面活性物質(zhì)、發(fā)揮乳化功能的關(guān)鍵菌群。

（3）模擬油藏條件下，采用激活Geobacillus的激活劑體系，沾3區(qū)塊內(nèi)源微生物在水驅(qū)基礎(chǔ)上提高原油采收率10.8%，驅(qū)替液中原油乳化現(xiàn)象顯著。表明Geobacillus在油藏條件下產(chǎn)生生物乳化劑等代謝產(chǎn)物，乳化原油，提高了原油采收率，該菌是內(nèi)源微生物采油技術(shù)激活的重要功能菌。

［1］ NAZINA T N，TOUROVA T P，POLTARAUS A B，et al.Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli：descriptions of Geobacillus subterraneus gen nov，sp nov and Geobacillus uzenensis sp nov from petroleum reservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus，Bacillus thermocatenulatus，Bacillus thermoleovorans，Bacillus kaustophilus，Bacillus thermodenitrificans to Geobacillus as the new combinations G stearothermophilus G th［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2001，51（2）：433-446.

［2］ OBOJSKA A，TERNAN N G，LEJCZAK B，et al.Organophosphonate utilization by the thermophile Geobacil-lus caldoxylosilyticus T20［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：2081-2084.

［3］ MARCHANT R，BANAT I M，RAHMAN T J，et al.The frequency and characteristics of highly thermophilic bacteria in cool soil environments［J］.Environmental Microbiology，2002，4（10）：595-602.

［4］ ANNWEILER E，RICHNOW H H，ANTRANIKIAN G，et al.Naphthalene degradation and incorporation of naphthalene derived carbon into biomass by the thermophile Bacillus thermoleovorans［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（2）：518-523.

［5］ SCHIANO M V，LAMA L，POLI A，et al.Production of exopolysaccharides from a thermophilic microorganism isolated from a marine hot spring in flegrean areas［J］. Journal ofIndustrialMicrobiology&Biotechnology，2003，30（2）：95-101.

［6］ KIMURA H，ASADA R，NAGANUMA T.Distribution of microorganisms in the subsurface of the manus basin hydrothermal vent field in Papua New Guinea［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）：644-648.

［7］ 夏文杰，董漢平，俞理，等.一株耐溫耐鹽烴降解菌Geobacillus sp XDF-4性能［J］.化工學(xué)報，2010，61（11）：2951-2958. XIA Wenjie，DONG Hanping，YU Li，et al.Characterization of a thermophilic and halotolerant strain Geobacillus sp XDF-4［J］.CIESC Journal，2010，61（11）：2951-2958.

［8］ 徐爽，黃志勇，路福平，等.高溫產(chǎn)生物乳化劑菌的篩選及其功能分析［J］.科技導(dǎo)報，2011，29（15）：52-57. XU Shuang，HUANG Zhiyong，LU Fuping，et al.Screening bioemulsifier-produced microorganisms and its function analysis［J］.Science&Technology Review，2011，29（15）：52-57.

［9］ 孔祥平.一株地芽孢桿菌（Geobacillus sp）在模擬油藏條件下的生長與運移實驗研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2007. KONG Xiangping.Study on the growth and transport of the bacterium Geobacillus sp in simulated reservoir conditions［D］.Qingdao：Ocean University of China，2007.

［10］ 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南［M］.黃培棠，譯.3版.北京：科學(xué)出版社，2002.

［11］ 張國印，劉慶梅，李凌云，等.表面活性劑復(fù)配在三次采油中的應(yīng)用［J］.中外能源，2010，15（2）：56-59. ZHANG Guoyin，LIU Qingmei，LI Lingyun，et al.Application of combined surfactant in tertiary oil recovery［J］. Sino-Global Energy，2010，15（2）：56-59.

［12］ 張凡，佘躍惠.排油圈法對生物表面活性劑的定性與定量［J］.化學(xué)工程師，2005，112（1）：14-15，38. ZHANG Fan，SHE Yuehui.Quantitative and qualitative analysis of biosurfactant by oil spreading method［J］. Chemical Engineer，2005，112（1）：14-15，38.

（編輯 劉為清）

Study on the activation Geobacillus species in Zhan 3 blocks of Shengli Oilfield

LI Caifeng1，2，LI Yang3，WU Xinyu4，CAO Yanbin2，WANG Weidong2，BAO Mutai1
（1.College of Chemistry&Chemical Engineering in Ocean University of China，Qingdao 266100，China；2.Shengli Oil Production Research Institution，SINOPEC，Dongying 257000，China；3.China Petroleum&Chemical Corporation，Beijing 100728，China；4.College of information and Control Engineering in China University of Petroleum，Qingdao 266580，China）

The microbial community structure in Zhan 3 block reservoir of Shengli Oilfield was analyzed by means of 16S rRNA clone library.The indigenous microorganism in Zhan 3 block reservoir was activated by adding different activators. And the emulsifying ability，the ability of producing surfactant，and the analysis of microbial community structure for the activated samples were studied.The physical simulation flooding experiments were also carried out.The results show that Geobacillus accounts for 2%of the total sequences in Zhan 3 reservoir samples，which is the key species for producing surfactant and playing the function of emulsification.It could be selectively activated and becomes the dominant species by adding proper activators.The indigenous microorganism could enhance oil recovery up to 10.8%based on water flooding at the Geobacillus activator formula in the reservoir conditions.

Geobacillus；emulsifying ability；activation；indigenous microorganism；microbial population

TE 357.9

A

1673-5005（2016）01-0163-05 doi：10.3969/j.issn.1673-5005.2016.01.023

2015-07-01

國家“863”計劃項目（2013AA064401）

李彩風(fēng)（1981-），女，工程師，博士研究生，研究方向為石油微生物。E-mail：fengr66@163.com。

包木太（1971-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為微生物采油和環(huán)境生物修復(fù)。E-mail：mtbao@ouc.edu.cn。

引用格式：李彩風(fēng)，李陽，吳昕宇，等.勝利油田沾3區(qū)塊油藏中Geobacillus菌的激活研究［J］.中國石油大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，40（1）：163-167.

LI Caifeng，LI Yang，WU Xinyu，et al.Study on the activation Geobacillus species in Zhan 3 blocks of Shengli Oilfield［J］. Journal of China University of Petroleum（Edition of Natural Science），2016，40（1）：163-167.