兔自體骨膜包裹肌腱移植前交叉韌帶重建實(shí)驗(yàn)研究

崔巍 時(shí)劍輝 劉振中 王巖 曲穎 呂偉

兔自體骨膜包裹肌腱移植前交叉韌帶重建實(shí)驗(yàn)研究

崔巍 時(shí)劍輝 劉振中 王巖 曲穎 呂偉

目的 觀察比較翻轉(zhuǎn)骨膜包裹自體肌腱移植、單純自體肌腱及骨膜正常包裹自體肌腱移植，重建前交叉韌帶移植物腱骨愈合的組織學(xué)變化過(guò)程。方法 取60只新西蘭白兔120膝，隨機(jī)平均分為翻轉(zhuǎn)骨膜組、正常骨膜組及肌腱組。切除兔雙膝前交叉韌帶，取其雙側(cè)拇長(zhǎng)伸肌腱，及需要切取骨膜側(cè)脛骨上端內(nèi)側(cè)骨膜，大小約1.5 cm×0.5 cm。同側(cè)肌腱折成2股重建兔雙膝前交叉韌帶。采用HE染色、甲苯胺藍(lán)染色，觀察重建術(shù)后3、4、8及12周時(shí)移植物腱骨愈合的變化情況。結(jié)果顯微鏡下觀察重建術(shù)后隨著時(shí)間推移，翻轉(zhuǎn)骨膜組較其他兩組腱骨界面可見成纖維細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞更多表達(dá)；12周時(shí)，翻轉(zhuǎn)骨膜組腱骨界面間的膠原纖維數(shù)量及排列較其他兩組無(wú)明顯差異；生物力學(xué)測(cè)試術(shù)后3、4、8周骨膜翻轉(zhuǎn)組抗?fàn)坷γ黠@大于其他兩組，而術(shù)后12周組間對(duì)照無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 骨膜包裹自體肌腱移植重建兔前交叉韌能夠在愈合期12周內(nèi)促進(jìn)腱骨結(jié)合部成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的再生；對(duì)腱骨愈合具有積極的促進(jìn)作用，超過(guò)愈合期則無(wú)差異。

兔；骨膜；前交叉韌帶；自體肌腱；移植

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關(guān)節(jié)中重要的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)之一，具有重要的生理功能[1］。韌帶損傷如果通過(guò)MRI、X 線等[2］診斷后，應(yīng)盡早行手術(shù)治療[3］。關(guān)節(jié)鏡下自體肌腱移植重建ACL已經(jīng)成為主要治療方法之一。但重建術(shù)后移植物松動(dòng)失敗也占有相當(dāng)比例[4］。糾其原因有很多，其中腱骨愈合速度與程度是決定手術(shù)效果的重要因素[5-6］。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察翻轉(zhuǎn)骨膜包裹自體肌腱移植重建ACL，移植物腱骨愈合的組織學(xué)變化過(guò)程，旨在為臨床應(yīng)用此方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭白兔60只，5月齡，體重3.0 kg左右，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 分組 將60只白兔隨機(jī)分成：A骨膜翻轉(zhuǎn)縫合組（生發(fā)層面向骨道）；B骨膜正?？p合組（生發(fā)層面向肌腱）；C無(wú)骨膜包裹。

1.2.2 手術(shù)方法 應(yīng)用20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，雙膝關(guān)節(jié)脫毛后消毒，于脛骨近端內(nèi)側(cè)切取1.5 cm×0.5 cm骨膜備用，分別在同側(cè)足背切口，游離拇長(zhǎng)伸肌并切取，A組以0#尼龍線進(jìn)行股骨側(cè)，骨膜翻轉(zhuǎn)包裹后的2股肌腱編織縫合固定。以3.0鉆頭鉆通脛骨、股骨骨隧道，分別于骨道外口附近外固定一枚螺釘，以備栓樁。將制備好肌腱由引導(dǎo)線引入骨道內(nèi)，并將兩側(cè)編織縫合線固定在螺釘處。打緊線結(jié)使移植物處于最佳位置。B組為股骨側(cè)骨膜不翻轉(zhuǎn)縫合；C組無(wú)骨膜包裹，其他手術(shù)方法同上。術(shù)后自由活動(dòng)，常規(guī)應(yīng)用抗生素，觀察創(chuàng)口。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中白兔膝關(guān)節(jié)無(wú)感染發(fā)生，無(wú)白兔死亡。于3、4、8、12周隨機(jī)處死15只（每組5只），隨機(jī)選取6只12膝（每組2只）進(jìn)行顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取9只18膝（每組3只）進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。

表1 各個(gè)組別不同時(shí)期生物力學(xué)測(cè)試及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果[（±s），n=18］

表1 各個(gè)組別不同時(shí)期生物力學(xué)測(cè)試及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果[（±s），n=18］

注：術(shù)后3、4、8周A組與B、C組間比較P＜0.05，術(shù)后12周組間比較P＞0.05

A B C P 3周（n=18） 51.27±1.36 29.68±2.21 27.44±2.68 0.000 5 4周（n=18） 69.22±6.54 52.81±3.83 50.77±5.59 0.000 1 8周（n=18） 104.27±4.84 80.66±4.62 78.33±6.12 0.000 1 12周（n=18） 126.35±5.44 120.63±4.45 118.83±5.64 0.06

1.3 觀測(cè)方法

1.3.1 顯微鏡觀察 給予標(biāo)本固定，常規(guī)處理切片，HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.3.2 生物力學(xué)測(cè)試 三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象分別于3、4、8、12周時(shí)取材，拆除股骨側(cè)固定釘處的尼龍線，保留脛骨固定方式，切斷除重建的前交叉韌帶外的股骨和脛骨之間的軟組織，將標(biāo)本固定在WDW-100微機(jī)控制電子萬(wàn)能生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，加以5 mm/s的速度將肌腱從股骨隧道內(nèi)拉出，并記錄腱骨分離時(shí)最大拉力載荷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，所有指標(biāo)數(shù)據(jù)用（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察

術(shù)后3周：A組：骨膜內(nèi)有大量間充質(zhì)細(xì)胞增生，并可見新生骨樣組織形成。腱骨結(jié)合部有大量細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為炎性細(xì)胞，其次為成纖維細(xì)胞，并出現(xiàn)少量纖維軟骨細(xì)胞，骨膜生發(fā)層部位還可見大量新生軟骨細(xì)胞，排列不規(guī)整。B組：骨膜增生，骨膜內(nèi)可見部分新生軟骨細(xì)胞和基質(zhì)，部分軟骨鈣化成骨。C組：腱骨界面通過(guò)大量膠原纖維連接，未見新生軟骨細(xì)胞及基質(zhì)。

術(shù)后4周：A組：出現(xiàn)明顯的膜內(nèi)化骨，在骨界面也可以看到膠原和結(jié)締組織為主要成分的新生骨質(zhì)，并向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，新生骨小梁周圍可見大量骨母細(xì)胞呈柵形排列。B組：骨膜部位可見較多的軟骨細(xì)胞，腱骨接點(diǎn)處纖維結(jié)締組織增生，膠原排列尚紊亂，骨面見少量新生骨質(zhì)。C組：腱骨界面間無(wú)新生骨形成，僅通過(guò)大量成纖維細(xì)胞及膠原纖維相連。

術(shù)后8周：A組：新生骨小梁與肌腱和骨隧道結(jié)合緊密，無(wú)間隙，排列比較規(guī)整，膠原纖維成束狀于鈣化組織交錯(cuò)排列，沿力線方向有規(guī)律排列，趨于正常腱骨附著結(jié)構(gòu)。B組：腱骨界面間可見新生骨骨島以及大量軟骨細(xì)胞，排列略規(guī)則，膠原纖維成束狀于鈣化組織交錯(cuò)排列，沿力線方向較有規(guī)律排列。C組：腱骨界面間通過(guò)膠原纖維相連，排列紊亂，局部可見少量軟骨細(xì)胞及軟骨鈣化。

術(shù)后12周：A、B、C各組鏡下見新生骨小梁與肌骨隧道結(jié)合緊密，無(wú)間隙，排列規(guī)整，為正常腱骨附著結(jié)構(gòu)。

2.2 生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果

3、4、8周各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12周各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1?？梢姽悄しD(zhuǎn)包裹肌腱在腱骨愈合的時(shí)間內(nèi)無(wú)論是抗?fàn)坷€是腱骨結(jié)合強(qiáng)度都大于其他方式肌腱移植。

3 討論

3.1 腱骨結(jié)合處解剖學(xué)特點(diǎn)

腱骨之間的結(jié)合方式有兩種：（1）間接止點(diǎn)，由致密纖維結(jié)締組織構(gòu)成，是動(dòng)物模型中常見的愈合方式，特征為腱骨連接處由走向與骨道縱軸垂直的穿插性Sharpey纖維構(gòu)成[7］。這些纖維是由Ⅲ型膠原組成，因其連接骨與肌腱，因此被看做是腱骨愈合的最早標(biāo)志。（2）直接止點(diǎn)是由纖維結(jié)締組織、纖維軟骨、礦化的纖維軟骨及骨組織組成。是生理狀態(tài)下肌腱止點(diǎn)，也可見于愈合后腱骨連接部[8］。

3.2 影響腱骨愈合的因素

正常移植肌腱與骨愈合需經(jīng)歷移植物的變性、血管再生、細(xì)胞再生、膠原沉著和基質(zhì)重塑的過(guò)程。如果移植物與宿主具有較好的組織相容性并與骨道緊密接觸，就會(huì)很快地與骨道進(jìn)行生長(zhǎng)、結(jié)合，從而保證重建韌帶的早期穩(wěn)定性。董向輝[9］等研究證實(shí)關(guān)節(jié)滑液對(duì)前交叉韌帶重建后韌帶的強(qiáng)度以及腱骨愈合有不利影響。而固定位點(diǎn)選擇不佳[10］、初期固定不牢固及過(guò)早、過(guò)度地進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練等都是影響腱骨愈合的重要因素。

3.3 自體骨膜促進(jìn)腱骨愈合的機(jī)制

骨膜是由大量未分化祖細(xì)胞和基質(zhì)顆粒組成內(nèi)層（生發(fā)層）和大量成纖維細(xì)胞和膠原纖維束組成的纖維層（外層）構(gòu)成；生發(fā)層含有豐富的未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞因外界的環(huán)境不可而分化成成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，目前已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)證明骨膜能夠促進(jìn)骨和軟骨的愈合。左百軍等[11］利用骨膜包裹自體跟腱重建兔ACL，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)腱骨界面的炎性反應(yīng)發(fā)生和細(xì)胞聚集以及成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的再生，促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成及軟骨分化，從而促進(jìn)腱骨愈合。

本課題研究將骨膜翻轉(zhuǎn)后包裹肌腱縫合植入腱骨交接處，其生發(fā)層朝向不同的方向，在顯微鏡下可明顯觀察到同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)軟骨成骨、新骨形成等有明顯差異，A組成骨特征明顯好于其他組別。這在腱骨愈合階段有著非常重要的臨床意義。而本研究的生物力學(xué)分析也可清的看到，翻轉(zhuǎn)骨膜包裹后的A組在術(shù)后3、4、8周抗?fàn)坷拱纬隽糜谄渌麅山M。骨膜包裹后的肌腱移植可以明顯提高愈合速度和愈合強(qiáng)度，可以減少因制動(dòng)而產(chǎn)生的關(guān)節(jié)僵硬，提前進(jìn)行康復(fù)練習(xí)，降低關(guān)節(jié)粘連的發(fā)生幾率，提高患者滿意度，減少社會(huì)醫(yī)療資源的浪費(fèi)。而在本研究中也可看到術(shù)后12周腱骨愈合后雖然在組織學(xué)形態(tài)上還有區(qū)別，但在生物力學(xué)測(cè)試中的到的數(shù)據(jù)并未提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)節(jié)液中存在的多種影響腱骨愈合的物質(zhì)，而骨膜包裹肌腱后可以最大限度封堵關(guān)節(jié)液進(jìn)入腱骨界面間，減少關(guān)節(jié)液的不利影響，同時(shí)也減少骨隧道的擴(kuò)大，促進(jìn)腱骨愈合。

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Experimental Study on Anterior Cruciate Ligament Reconstruction with Autologous Periosteum Wrapped Tendon in Rabbits

CUI Wei SHI Jianhui LIU Zhenzhong WANG Yan QU Ying LV Wei Department of Orthopedics， Heilongjiang Hospital， Harbin Heilongjiang 150036， China

Objective To compare reverse periosteum w rapped autologous tendon transplantation， autologous tendon and normal periosteumw rapped with autologous tendon transplantation， reconstruction of anterior cruciate ligament graft tendon bone healing histological change. Methods 60 New Zealand white rabbits 120 knees were selected， the reversed periosteum group， the normal periosteum group and the tendon group. Resection of rabbit knee anterior cruciate ligament， the bilateral extensor pollicis longus tendon， and the need to cut the proximal tibia medial periosteal periosteum，the size of about 1.5 cm×0.5 cm. The same side of the tendon folded into 2 strands of anterior cruciate ligament reconstruction. Using HE staining，toluidine blue staining， observe the reconstruction after 3， 4， 8 and 12 weeks of shift plant tendon bone healing. Results Observation under the microscope after reconstruction with time reversal periosteum group than the other two groups of tendon bone interface fibroblasts， cartilage cells more expression， at 12 weeks， flip periosteum group tendon bone interface between the number and arrangement of the collagen fibers than the other two groups had no significant difference； biomechanical test after 3 and 4，8 week group of anti pulling force of periosteal turnover was significantly greater than the other two groups， and 12 weeks after operation there was no significant difference between groups. Conclusion Reconstruction of periosteumw rapped tendon autograft of rabbit anterior cruciate ligament can promote the regeneration of tendon bone healing in 12 weeks with fibroblasts， osteoblasts and chondrocytes； which plays a positive role in promoting the healing of tendon bone healing period， there were no differences over.

Rabbit， Periosteum， Anterior cruciate ligament， Autologous tendon， Transplantation

R 687

A

1674-9308（2016）26-0215-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.26.140

黑龍江省醫(yī)院骨科，黑龍江 哈爾濱 150036

呂偉，E-mail：cuiwei720409@sina.com