利用苯扎氯銨抑制再生水源熱泵系統(tǒng)中微生物污垢的實(shí)驗(yàn)研究

常思遠(yuǎn)　姜 朔　楊倩鵬　史 琳

(清華大學(xué)熱科學(xué)與動(dòng)力工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 CO2資源利用與減排技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室清華大學(xué)熱能工程系　北京　100084)

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利用苯扎氯銨抑制再生水源熱泵系統(tǒng)中微生物污垢的實(shí)驗(yàn)研究

常思遠(yuǎn)姜 朔楊倩鵬史 琳

(清華大學(xué)熱科學(xué)與動(dòng)力工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 CO2資源利用與減排技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室清華大學(xué)熱能工程系北京100084)

再生水源熱泵系統(tǒng)以城市再生水作為冷熱源，為城市建筑制冷、供暖，而微生物污垢是影響再生水源熱泵系統(tǒng)效率和安全的重要問(wèn)題。本研究通過(guò)進(jìn)行掛片實(shí)驗(yàn)，利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殺菌劑苯扎氯銨每天浸泡污垢10 min，考察其抑垢作用。對(duì)污垢進(jìn)行活性染色，并利用共聚焦激光掃描顯微鏡CLSM對(duì)其進(jìn)行拍照，觀察污垢內(nèi)細(xì)胞的活性分布。最后利用Imaris軟件分別統(tǒng)計(jì)活/死細(xì)胞所占的生物體積。結(jié)果表明，苯扎氯銨對(duì)微生物污垢具有抑制作用，能殺滅污垢內(nèi)絕大部分細(xì)菌細(xì)胞，且該作用隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升而增強(qiáng)。該研究可對(duì)相關(guān)抑垢技術(shù)提供指導(dǎo)，從而提高再生水源熱泵系統(tǒng)的運(yùn)行效率與系統(tǒng)安全，促進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。

再生水源熱泵系統(tǒng)；微生物污垢；苯扎氯銨；激光共聚焦掃描顯微鏡

我國(guó)城市污水排放量大，處理率高[1]，處理后產(chǎn)生的城市再生水具有流量大而穩(wěn)定、溫度冬暖夏涼等特點(diǎn)，是理想的熱泵冷熱源[2- 3]。以城市再生水作為冷熱源的再生水源熱泵系統(tǒng)是一項(xiàng)立足于節(jié)能減排的技術(shù)，能夠利用再生水中含有的大量低品位熱能，實(shí)現(xiàn)城市建筑的制冷、供暖，該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際中已有了一定的應(yīng)用[4-7]。但在運(yùn)行過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于再生水中含有細(xì)菌等雜質(zhì)，易在熱泵系統(tǒng)的板式換熱器內(nèi)形成污垢，嚴(yán)重影響熱泵系統(tǒng)的效率與安全性。

本課題組前期研究表明[8]，板式換熱器內(nèi)污垢是以微生物污垢為主體的混合污垢。微生物污垢是指致垢流體中含有的細(xì)菌等微生物附著到固體基底表面，并繁殖、生長(zhǎng)、產(chǎn)生分泌物而形成的生物粘膜[9-10]。利用殺菌劑清洗能夠殺滅流體與污垢中的細(xì)菌，促進(jìn)污垢的剝離脫落，是目前常用的抑垢除垢手段[11]。苯扎氯銨作為一種廣譜、高效殺菌劑，能夠有效去除微生物污垢，并且對(duì)人體與環(huán)境沒(méi)有危害作用[12]。

共聚焦激光掃描顯微鏡CLSM是醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域常用的顯微檢測(cè)手段，由于其具有能夠分辨細(xì)胞活性、不同組分分布等優(yōu)點(diǎn)，目前在微生物污垢研究領(lǐng)域正受到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[13-14]。但目前利用CLSM主要是對(duì)污垢內(nèi)細(xì)胞活性分布進(jìn)行定性觀察，還鮮有研究利用軟件對(duì)CLSM顯微照片進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)與分析。

本研究進(jìn)行掛片實(shí)驗(yàn)，通過(guò)掛片在人工再生水中的轉(zhuǎn)動(dòng)在掛片表面生成微生物污垢，并定時(shí)將掛片浸泡在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的苯扎氯銨溶液中進(jìn)行除垢。對(duì)污垢進(jìn)行活性熒光染色，并利用CLSM觀察污垢內(nèi)細(xì)胞活性分布；利用Imaris軟件統(tǒng)計(jì)活/死細(xì)胞的生物體積，從而定量分析了苯扎氯銨的殺菌與抑垢作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 旋轉(zhuǎn)掛片儀成垢

本研究通過(guò)人工配置的方法模擬城市再生水，將實(shí)際再生水中的優(yōu)勢(shì)菌種芽孢桿菌[15]菌液稀釋到盛有一定量過(guò)濾水的燒杯之中，使其中菌濃度達(dá)到1.0×105CFU/mL，添加葡萄糖使其中BOD達(dá)到 15 mg/L，從而與實(shí)際再生水的相關(guān)參數(shù)保持一致。每12 h更新人工再生水，并利用涂平板法對(duì)其中活菌濃度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)菌濃度為(1.0±0.1) ×105CFU/mL，較為穩(wěn)定。隨后將各組盛有人工再生水的燒杯放置到如圖1所示的旋轉(zhuǎn)掛片儀(RCCⅢ型)中的恒溫水浴部分中，調(diào)節(jié)水浴溫度為實(shí)際工況中常見(jiàn)的25 ℃。

圖1 旋轉(zhuǎn)掛片儀Fig.1 The rotation coupon instrument

將不銹鋼掛片(材質(zhì)SS316，尺寸20 mm×20 mm×1 mm)固定到掛片儀旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸上，下降升降平臺(tái)，使掛片沉入燒杯內(nèi)配制好的人工再生水中。隨后旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)掛片在人工再生水中做繞軸轉(zhuǎn)動(dòng)，從而模擬再生水流經(jīng)換熱板片表面并生成微生物污垢這一實(shí)際過(guò)程。轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)速為96 r/min，對(duì)應(yīng)線速度0.4 m/s，與工程實(shí)際保持一致。

每天定時(shí)將掛片取下，分別浸泡到生理鹽水(對(duì)照組)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω分別為10-4，2×10-4，10-3的苯扎氯銨溶液中，浸泡時(shí)間為10 min/d。浸泡完畢后再將掛片安裝回掛片儀上，在人工再生水中繼續(xù)成垢，實(shí)驗(yàn)共持續(xù)5天。

1.2 污垢的活性熒光染色

從成垢第一天至第五天成垢結(jié)束，每天從各浸泡組分別取一片掛片進(jìn)行活性熒光染色。使用的熒光染色劑為L(zhǎng)IVE/DEAD? Biofilm Viability Kit(Life Technology，貨號(hào)L10316)，成分為SYTO? 9 + Propidium Iodide (PI，碘化丙啶)。其中SYTO? 9能夠?qū)⑽酃钢兴屑?xì)菌細(xì)胞的核酸染色，并在隨后CLSM拍照時(shí)受激光激發(fā)發(fā)出綠色熒光，而PI只能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜，將所有死細(xì)胞的核酸染色，并在激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，覆蓋掉綠色熒光，從而完成對(duì)污垢內(nèi)活(綠色)/死(紅色)細(xì)胞分布的區(qū)分。

染色時(shí)，首先將3 μL的SYTO? 9與3 μL的PI稀釋到1000 μL的去離子水中，配成染色劑，然后每片掛片表面輕輕滴加500 μL該染色劑，避光染色25 min。隨后利用去離子水漂洗掛片表面污垢5 min，洗去未與細(xì)胞結(jié)合的染色劑。染色后的掛片如圖2所示。

圖2 染色后的掛片F(xiàn)ig.2 The stained coupon

1.3 污垢的CLSM拍照與照片分析

將染色后的污垢放置到CLSM上進(jìn)行拍照，CLSM工作原理如圖3所示。激光發(fā)射器發(fā)射出的激光經(jīng)折射照射樣品，樣品內(nèi)的熒光染料在激光激發(fā)下發(fā)出熒光，在針孔的遮擋作用，以及濾片的濾光作用下，只有聚焦平面的熒光能夠達(dá)到光電倍增管PMT，從而增加了圖像的清晰度。PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，經(jīng)成像軟件處理形成CLSM顯微照片。

圖3 CLSM工作原理Fig.3 Operating principle of CLSM

利用Imaris軟件(v. 7.2.3，Bitplane)將CLSM二維圖片集進(jìn)行三維重構(gòu)，得到污垢的立體微觀結(jié)構(gòu)；隨后利用Imaris軟件中“surface”功能，定量統(tǒng)計(jì)出三維圖片中活/死細(xì)胞所占的生物體積。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 污垢內(nèi)細(xì)胞生物體積

為了能夠定量考察污垢內(nèi)細(xì)胞的活性分布，利用Imaris軟件計(jì)算了CLSM顯微照片中活/死細(xì)胞分別所占的生物體積。在用于定量統(tǒng)計(jì)的CLSM拍照中，采用了40倍物鏡，從而能夠更清晰分辨出單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)而計(jì)算其體積；拍攝中隨機(jī)選取5個(gè)視場(chǎng)，利用軟件求出其對(duì)應(yīng)的生物體積后求平均作為最終結(jié)果。

成垢5天時(shí)間中污垢內(nèi)活/死細(xì)胞所占生物體積如圖4所示。

圖4 污垢內(nèi)活/死細(xì)胞的生物體積Fig.4 Biovolume of live/dead cell in the biofouling

從圖中看出，未進(jìn)行苯扎氯銨浸泡時(shí)，污垢中活細(xì)胞占絕大部分比例，活性較強(qiáng)，細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)迅速，污垢內(nèi)細(xì)胞總體積較大，最高可達(dá)18236 μm3；而不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的苯扎氯銨溶液每天浸泡污垢10 min，使得污垢內(nèi)活細(xì)胞所占比例大大減小，死細(xì)胞占絕大部分比例，從而污垢活性降低，易于剝離脫落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯扎氯銨浸泡對(duì)污垢內(nèi)細(xì)菌具有顯著的殺滅作用，能夠殺死絕大部分細(xì)菌。

2.2 污垢內(nèi)活/死細(xì)胞的體積比例

從圖4中看出，對(duì)照組成垢第5天的細(xì)胞總體積小于成垢第4天的細(xì)胞總體積，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，第5天污垢的宏觀質(zhì)量、體積均大于第4天。產(chǎn)生這一差異的主要原因是第5天污垢厚度較大，CLSM拍照時(shí)，污垢內(nèi)部發(fā)射的熒光受頂層細(xì)胞遮擋較為嚴(yán)重，底層細(xì)胞熒光信息較弱，從而導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)出的細(xì)胞整體體積較小。

針對(duì)這一情況，計(jì)算了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)苯扎氯銨溶液浸泡下污垢內(nèi)活細(xì)胞與死細(xì)胞體積的比值，所得結(jié)果如圖5所示。

圖5 活細(xì)胞與死細(xì)胞體積比例Fig.5 The ratio of biovolume of live cell to dead cell

從圖中可以看出，對(duì)照組中污垢內(nèi)活細(xì)胞體積所占比例遠(yuǎn)大于死細(xì)胞，活細(xì)胞體積大概是死細(xì)胞體積的101～102倍；而當(dāng)利用苯扎氯銨每天浸泡10 min后，污垢內(nèi)死細(xì)胞占絕大部分比例，活細(xì)胞體積大概是死細(xì)胞體積的10-1～10-2倍；此外，隨著苯扎氯銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸上升，活細(xì)胞體積與死細(xì)胞體積的比值逐漸減小，當(dāng)苯扎氯銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至ω=10-3時(shí)，5天成垢時(shí)間內(nèi)活細(xì)胞與死細(xì)胞體積的比值僅為0.0098～0.079。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯扎氯銨溶液對(duì)細(xì)菌的殺滅作用隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升而增強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞活性分布的定性觀察

除了利用CLSM顯微照片定量統(tǒng)計(jì)污垢內(nèi)活/死細(xì)胞所占體積，還通過(guò)拍照觀察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)苯扎氯銨溶液浸泡后污垢內(nèi)細(xì)胞的活性分布。在用于定性觀察的CLSM拍照中，選擇采用了10倍物鏡，其視場(chǎng)范圍更大，從而能夠獲得更全面的活性分布與微觀形貌信息。

以成垢第5天的污垢為例，各組污垢的CLSM顯微照片如圖6所示。

圖6 第5天污垢的CLSM照片(A為對(duì)照組，B、C、D分別對(duì)應(yīng)苯扎氯銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10-4，2×10-4，10-3，圖中比例尺長(zhǎng)度為200 μm)Fig.6 CLSM pictures of biofouling on the fifth day (A: control group; B, C, D: benzalkonium chloride mass fraction was 10-4, 2×10-4, 10-3 scale bar=200 μm)

從圖中可以看出，對(duì)照組中污垢內(nèi)幾乎全部為活細(xì)胞(綠色熒光)，說(shuō)明正常生長(zhǎng)的污垢內(nèi)部主要含有活細(xì)菌細(xì)胞；而分別利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-4，2×10-4，10-3的苯扎氯銨每天浸泡污垢10 min后，污垢內(nèi)活細(xì)胞的顯著減少，死細(xì)胞(紅色熒光)幾乎遍布整個(gè)視場(chǎng)；當(dāng)苯扎氯銨溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至10-3時(shí)，視場(chǎng)中有明顯無(wú)污垢覆蓋的黑色裸露區(qū)域，說(shuō)明在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)苯扎氯銨溶液處理后，污垢由于內(nèi)部細(xì)胞大量死亡，整體強(qiáng)度下降，變得易于剝離脫落。

有研究表明[16]，當(dāng)換熱器內(nèi)微生物污垢細(xì)胞活性下降，污垢量減少時(shí)，能夠提高換熱器的換熱效率，縮短換熱器的清理周期，避免污垢帶來(lái)的堵塞腐蝕等問(wèn)題。而利用苯扎氯銨進(jìn)行清洗，能夠殺滅污垢內(nèi)部的細(xì)菌，抑制污垢的生長(zhǎng)，從而提高再生水源熱泵系統(tǒng)的運(yùn)行效率與系統(tǒng)安全。

3 結(jié)論

本研究進(jìn)行掛片成垢實(shí)驗(yàn)，利用不同濃度苯扎氯銨每天浸泡污垢10 min，對(duì)污垢進(jìn)行活性熒光染色及CLSM拍照，并利用Imaris軟件定量分析顯微圖片，從而得出了如下結(jié)論：

1)苯扎氯銨對(duì)污垢內(nèi)細(xì)菌有明顯的殺滅作用，使得其中活細(xì)胞所占體積顯著降低；

2)苯扎氯銨對(duì)細(xì)菌的殺滅作用隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)能夠殺滅絕大部分細(xì)菌；

3)苯扎氯銨通過(guò)殺滅細(xì)菌對(duì)污垢表現(xiàn)出顯著的抑制作用，能夠降低污垢的活性與強(qiáng)度，使得污垢易于剝離脫落，從而提高再生水源熱泵系統(tǒng)的運(yùn)行效率與系統(tǒng)安全。

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About the author

Chang Siyuan, male, Ph. D. candidate, Department of Thermal Engineering, Tsinghua University,+86 10-62794535, E-mail：changsiyuan1226@163.com. Research fields: Biofouling inhibition in treated sewage heat pump systems. The author participates in project “Study on Growth and Inhibition Mechanisms and Heat Transfer Characteristics of Biofouling” supported by National Natural Science Foundation of China.

Experimental Investigation on the Anti-fouling Effect of Benzalkonium Chloride against Biofouling in Treated Sewage Heat Pump System

Chang SiyuanJiang ShuoYang QianpengShi Lin

(Key Laboratory for Thermal Science and Power Engineering of Ministry of Education, Beijing Municipal Key Laboratory for CO2Utilization & Reduction, Department of Thermal Engineering of Tsinghua University, Beijing, 100084,China)

The treated sewage heat pump system reuses the wasted heat in the city sewage to cool and/or heat the buildings. Biofouling, as the key problem in treated sewage heat pump systems, decreases the system efficiency and security. In this study, rotary coupon experiments were conducted, and Benzalkonium chloride, a broad-spectrum and efficient bactericide, of various concentrations was used to immerse the biofouling 10 min per day. Vital dye was used to stain the biofouling and confocal laser scanning microscope (CLSM) was used to take microphotographs of the biofouling to show the viability distribution of the bacteria cells in the biofouling. Imaris was used to calculate the biovolume of live/dead cells. The results show that benzalkonium chloride inhibits the biofouling significantly by killing most of the bacteria cells, and the inhibition effect is enhanced as the concentration increases. This research obtains insight into the biofouling inhibiting techniques and promotes the practical application of the treated sewage heat pump system by increasing the system efficiency and security.

treated sewage heat pump system； biofouling； benzalkonium chloride； confocal laser scanning microscope

0253- 4339(2016) 04- 0015- 05

10.3969/j.issn.0253- 4339.2016.04.015

國(guó)家自然科學(xué)基金 (51476090, 50976060)和國(guó)家創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) (51321002) 資助項(xiàng)目。(The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 51476090 and No. 50976060) and the Science Fund for Creative Research Group (No. 51321002).)

2015年12月30日

TK124;TQ051.5

文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

常思遠(yuǎn)，男，博士生，清華大學(xué)熱能工程系工程熱物理研究所， (010)62794535，E-mail:changsiyuan1226@163.com。研究方向：再生水源熱泵中微生物污垢抑制的研究。參與的研究項(xiàng)目有：國(guó)家自然科學(xué)基金“多物理場(chǎng)下微生物污垢的生長(zhǎng)與抑制機(jī)理及傳熱特性研究”。