內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑通過(guò)上調(diào)GRP78增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

石少敏　趙建軍　趙鳳芹　王　靜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林　長(zhǎng)春　130033)

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑通過(guò)上調(diào)GRP78增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

石少敏趙建軍趙鳳芹王靜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130033)

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑(TM)增加肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP)敏感性的機(jī)制。方法DDP和TM處理肺癌A549細(xì)胞，MTT法檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-7表達(dá)。結(jié)果不同濃度的DDP(0，10，20，50 μmol/L)作用于肺癌A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率以劑量依賴的方式下降；TM誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，提高了DDP(20 μmol/L)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(55.23%±2.31%，P<0.05)；同時(shí)檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7表達(dá)增加。結(jié)論DDP能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，但是TM通過(guò)上調(diào)GRP78增加了肺癌A549細(xì)胞對(duì)DDP敏感性，聯(lián)合應(yīng)用TM和DDP有望成為治療肺癌的新策略。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；順鉑；凋亡；肺癌

順鉑(DDP)通過(guò)損傷細(xì)胞的DNA而發(fā)揮抗腫瘤作用〔1〕，可用于治療卵巢癌、頭頸部的腫瘤和肺癌等〔2〕，其治療腫瘤的主要障礙是藥物耐受〔3〕。新近報(bào)道，線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了DDP誘導(dǎo)的癌癥細(xì)胞的凋亡〔4〕。同時(shí)，有研究顯示，在人黑色素瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞中，DDP通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣穩(wěn)態(tài)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥細(xì)胞凋亡〔5〕。當(dāng)缺氧、DNA損傷、細(xì)胞內(nèi)的鈣紊亂時(shí)，誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。葡萄糖相關(guān)蛋白(GRP78)是細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上橫跨膜蛋白質(zhì)傳感器ATF6、IRE1、PERK〔6〕。有研究報(bào)道，在肺癌A549細(xì)胞中，GRP78上調(diào)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性〔7〕。本研究旨在觀察DDP作用于肺癌A549細(xì)胞前后細(xì)胞凋亡的變化，以及聯(lián)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑TM對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞完全貼壁，加入既定濃度的DDP和(或)TM，每孔200 μl的終體積液體，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)作用24 h后，每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5 g/L)，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。棄去培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)于每孔內(nèi)，振蕩搖勻后，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的生存率。

1.2.2流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，換液并按既定濃度的DDP和(或)TM處理細(xì)胞，藥物干預(yù)24 h后收集懸浮，并用胰酶消化貼壁細(xì)胞，加入400 μl結(jié)合緩沖液使細(xì)胞重懸，之后加入AnnexinV和PI溶液，于室溫條件下避光孵育15 min；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后分別加入既定濃度的DDP和(或)TM處理細(xì)胞，藥物干預(yù)24 h后，收集貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)方法將蛋白進(jìn)行定量。并使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)膠(200 V，45 min)進(jìn)行電泳，之后用100 V轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，同時(shí)含15%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉2 h，用PBS洗滌3次，之后加入相應(yīng)一抗，經(jīng)4℃孵育過(guò)夜后，用PBS洗滌3次15 min、5 min、5 min后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育2 h(Caspase-7抗體稀釋比例1∶100、β-actin抗體稀釋比例1∶1 000、二抗稀釋比例1∶1 000)，之后再用PBS洗滌3次，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行顯影，之后再用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1不同濃度的DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力及凋亡的影響0，10，20，50 μmol/L的DDP干預(yù)24 h后，MTT結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，其對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸增加，細(xì)胞存活率分別為(1±0.066)、(0.74±0.11)、(0.52±0.054)、(0.32±0.021)；并且隨著藥物濃度的逐漸增加，A549細(xì)胞逐漸皺縮，而且脫離貼壁的現(xiàn)象明顯增加。10，20，50 μmol/L的DDP作用A549細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡分別為(2.14±0.68)%，(8.67±0.69)%，(13.16±1.11)%，(19.22±1.65)%。

2.2DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平0，10，20，50 μmol/L的DDP作用A549細(xì)胞24 h后，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-7的表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而上調(diào)，分別為0.04±0.023，0.73±0.28，1.33±0.079，1.67±0.121,尤其DDP濃度在20，50 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，Cleaved Caspase-7的表達(dá)水平增加更明顯。見(jiàn)圖1。

2.3TM對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)水平的影響0，1，2，4 μg/ml TM作用A549細(xì)胞24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78的表達(dá)水平逐漸增加，分別為0.23±0.058、0.49±0.11、0.62±0.062、0.79±0.077，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4TM聯(lián)合DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞存活率的影響1 μg/ml TM聯(lián)合20 μmol/L DDP處理A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組(1±0.18)相比，單加1 μg/ml TM組細(xì)胞生存率(0.95±0.075)無(wú)明顯差異。DDP組(0.55±0.068)和二者聯(lián)合組(0.24±0.03)的細(xì)胞存活率均明顯降低，尤其二者聯(lián)合組的細(xì)胞生存率明顯低于單加DDP組(P<0.05)，提示TM促進(jìn)了順鉑對(duì)A549細(xì)胞生存率的影響。

2.5TM促進(jìn)DDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡TM聯(lián)合DDP處理肺癌A549細(xì)胞24 h后，流式結(jié)果顯示，與對(duì)照組〔(2.6±0.062)%〕相比，單加1 μg/ml TM組肺癌A549細(xì)胞凋亡率〔(3.3±0.17)%〕無(wú)明顯差異(P>0.05)；而20 μmol/L DDP組〔(10.21±0.32)%〕和二者聯(lián)合組〔(18.69±1.12)%〕的細(xì)胞凋亡率均明顯增加，尤其在二者聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率增加更明顯(P<0.05)，提示TM促進(jìn)了DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡率的增加。

2.6TM影響DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)TM聯(lián)合DDP處理肺癌A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組(0.03±0.02)相比，單加TM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的表達(dá)(0.043±0.031)無(wú)明顯的變化(P>0.05)；與單加DDP組(0.32±0.06)比較，二者聯(lián)合組Caspase-7表達(dá)(0.71±0.054)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1　DDP誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖2　TM對(duì)肺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖3　聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3　討　論

目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在化療藥物誘導(dǎo)的肺癌凋亡中起到了重要的作用〔8〕。在以前的研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是一種生物學(xué)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；事實(shí)上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是對(duì)許多刺激因素如生物化學(xué)、病理及生理?xiàng)l件下的刺激產(chǎn)生的一種細(xì)胞反應(yīng)，能夠促發(fā)各種細(xì)胞功能紊亂包括錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集和Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變〔9〕。并且在過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡性的細(xì)胞死亡之間的關(guān)系已經(jīng)在巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，以及癌癥細(xì)胞都已得到了證實(shí)〔10〕。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)TM增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。GRPs是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，普遍存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，能夠輔助蛋白質(zhì)的折疊〔11〕。GRP78(也被成為Bip)是典型的GRPs家族成員，是和細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白(HSP)70和90同源，并且一般被大家認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子標(biāo)志〔12〕。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78表達(dá)水平明顯上調(diào)。在本研究中也顯示，在肺癌A549細(xì)胞中，TM能夠劑量依賴性上調(diào)GRP78的表達(dá)，并且，當(dāng)TM和DDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能夠有效抑制肺癌A549細(xì)胞的生存率，同時(shí)明顯增加肺癌A549細(xì)胞的凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的表達(dá)。

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6Schroder M，Kaufman RJ.The mammalian unfolded protein response〔J〕.Annu Rev Biochem，2005;74(7)：739-89.

7Ahmad M，Hahn IF，Chatterjee S.GRP78 up-regulation leads to hypersensitization to cisplatin in A549 lung cancer cells〔J〕.Anticancer Res，2014;34(7)：3493-500.

8Zhao Y，Zhu C，Li X，etal.Asterosaponin 1 induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in A549 human lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2011;26(4)：919-24.

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12Lee AS.The glucose-regulated proteins：stress induction and clinical applications〔J〕.Trends Biochem Sci，2001;26(8)：504-10.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

王靜(1976-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

石少敏(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事肺癌診治的基礎(chǔ)研究。

R453

A

1005-9202(2016)16-3925-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.025