電針對(duì)特應(yīng)性皮炎瘙癢模型小鼠的止癢作用及對(duì)強(qiáng)啡肽、P物質(zhì)的影響

蔣　麗　謝長(zhǎng)才　黃鍵澎　符文彬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東　廣州　510120)

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電針對(duì)特應(yīng)性皮炎瘙癢模型小鼠的止癢作用及對(duì)強(qiáng)啡肽、P物質(zhì)的影響

蔣麗謝長(zhǎng)才黃鍵澎符文彬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510120)

目的觀察電針不同穴位對(duì)特應(yīng)性皮炎(AD)瘙癢模型小鼠搔抓行為、脊髓強(qiáng)啡肽(DYN)及血清P物質(zhì)(SP)的影響。方法將32只雌性BALB/c小鼠分為空白組、模型組、內(nèi)關(guān)組和曲池組，每組8只。除空白組外，其余各組均以2，4-二硝基氯苯(DNCB)誘導(dǎo)建立AD動(dòng)物模型，共刺激7次。內(nèi)關(guān)組和曲池組在實(shí)驗(yàn)第5天開始分別給予電針內(nèi)關(guān)、曲池穴治療?？瞻捉M和模型組不給予任何治療。觀察小鼠搔抓次數(shù)、腹部皮損改變，運(yùn)用Western印跡法檢測(cè)脊髓DYN含量，ELISA法檢測(cè)血清中SP水平變化。結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠搔抓次數(shù)顯著升高，腹部皮膚產(chǎn)生AD樣濕疹皮損改變，脊髓內(nèi)DYN及血清SP水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，內(nèi)關(guān)組和曲池組小鼠的搔抓次數(shù)顯著降低，腹部皮損炎癥略有減輕，脊髓DYN含量明顯升高(均P<0.05)、血清SP水平顯著降低(P<0.05)；內(nèi)關(guān)組和曲池組間比較，各指標(biāo)均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論電針對(duì)DNCB誘發(fā)的AD樣瘙癢模型小鼠的止癢作用可能是通過(guò)提高脊髓中DYN的含量、抑制SP水平而介導(dǎo)的。

電針;特應(yīng)性皮炎;強(qiáng)啡肽;P物質(zhì)

瘙癢是多種皮膚病和系統(tǒng)性疾病最常見的自覺癥狀〔1,2〕。特應(yīng)性皮炎(AD)即是一種以持續(xù)性瘙癢為主要癥狀的遺傳性慢性炎癥性皮膚病〔3,4〕。由于持續(xù)劇烈的瘙癢，多數(shù)患者因不能忍受而劇烈的抓撓皮膚病患處，從而使瘙癢癥和抓撓形成反復(fù)惡性的轉(zhuǎn)歸模式，造成該病遷延難愈，對(duì)患者身心健康及生活質(zhì)量造成很大影響〔5〕。然而，引起AD皮膚瘙癢的發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，導(dǎo)致臨床治療過(guò)程中缺少理想的止癢藥物〔5～7〕。近年來(lái)，針灸止癢具有顯著療效已得到眾多臨床研究的證實(shí)，穴位是針灸取效的關(guān)鍵〔8～12〕。但是研究多傾向于臨床，有關(guān)針灸抗瘙癢作用機(jī)制的研究相對(duì)缺乏。本研究初步探討電針對(duì)2,4-二硝基氯苯(DNCB)誘發(fā)的AD樣瘙癢的止癢療效及其可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組方法6～8周齡的健康SPF級(jí)BALB/c小鼠32只，雌性，體重20～25 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，給予3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度55%～65%。晝夜時(shí)間控制在各12 h。將32只小鼠按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、電針內(nèi)關(guān)穴組(內(nèi)關(guān)組)和電針曲池穴組(曲池組)，每組8只。

1.2藥物與試劑DNCB(Sigma 公司)、P物質(zhì)(SP)試劑盒(USCNK公司)、BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、磷酸甘油醛脫氨酶(GAPDH，廣州速聚生物有限公司)。將DNCB 溶解于丙酮/橄欖油(1∶4)基質(zhì)溶液中，分別配制成濃度1%和2%的DNCB致敏溶液。

1．3主要儀器低速離心機(jī)(中佳SC3614)，低溫冷凍離心機(jī)(黑馬Min1612r)，勻漿機(jī)(Bertin Precellys 24)，臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)，TG16-W)，電泳儀(上海天能科技有限公司，EPS-300)，X射線攝影暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械有限公司，AX-Ⅱ)，紫外線分光光度儀(Thermo Nanodrop 2000C)，酶標(biāo)儀(thermo multiskanMK3)、顯微鏡(Leica DMI6000B)。華佗牌電子針療儀(型號(hào)：SDZ-Ⅴ型，蘇州醫(yī)療用品廠出產(chǎn))、華佗牌一次性針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠出產(chǎn))。

1．4AD模型的建立除空白組外，其余3組均需造模。AD小鼠模型的建立參考文獻(xiàn)〔13～15〕方法并略有改進(jìn)：實(shí)驗(yàn)前2 d剃去小鼠腹部體毛，面積約2.5 cm×2.5 cm。實(shí)驗(yàn)第1天用2% DNCB丙酮溶液100 μl涂于腹部剃毛處和耳部，實(shí)驗(yàn)第2～4天不作處理，第5天改用1%DNCB 丙酮溶液100 μl涂搽小鼠的腹部剃毛處和耳部，以后每隔2 d刺激1次，持續(xù)21 d，共進(jìn)行7次刺激。空白組小鼠腹部脫毛區(qū)及耳部?jī)H涂搽丙酮/橄欖油基質(zhì)溶液，涂搽時(shí)間及涂搽劑量與模型組一致。

1．5治療方法內(nèi)關(guān)組和曲池組在造模期第5天開始接受電針治療。若治療當(dāng)日有造模刺激，則電針治療應(yīng)在DNCB刺激前不少于2 h進(jìn)行。內(nèi)關(guān)組取內(nèi)關(guān)穴(雙側(cè))，曲池組取曲池穴(雙側(cè))。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位定位方法〔16〕，并根據(jù)大鼠形態(tài)、解剖、生理特點(diǎn)而定。內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè)尺橈骨縫間，離腕關(guān)節(jié)約3 mm；曲池位于小鼠橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷處。針刺時(shí)，在內(nèi)關(guān)穴區(qū)刺入兩根針灸針，刺入深度1～2 mm，兩針間隔約2～3 mm，防止兩針相觸，以免短路；膠布固定后與電針治療儀相連接，同一對(duì)正負(fù)極連接同穴區(qū)兩針柄；針刺曲池穴方法同內(nèi)關(guān)穴。電針采用輸出電流強(qiáng)度1～2 mA(先1 mA,然后逐漸加大到2 mA，以引起大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度)，疏密波，頻率2/100 Hz,交替，留針20 min。隔天治療1次，共治療9次?？瞻捉M及模型組以同樣方法抓取大鼠，但不做電針處理。

1．6檢測(cè)指標(biāo)

1．6．1小鼠搔抓次數(shù)記錄將各組小鼠單籠放置，采用視頻攝像機(jī)記錄并計(jì)數(shù)10 min內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)。以后肢連續(xù)搔抓耳部及腹部視為1次搔抓活動(dòng)，當(dāng)后爪落地或被舔舐時(shí)代表本次搔抓結(jié)束。前肢的活動(dòng)以及后爪對(duì)面、背部等處的搔抓則不作統(tǒng)計(jì)。分別于實(shí)驗(yàn)第1天(DNCB第1次刺激后1 h內(nèi))、實(shí)驗(yàn)第5天(第1次電針治療前)以及實(shí)驗(yàn)第21天(末次電針針治療后)各觀察1次，共觀察3次。

1．6．2觀察小鼠皮損改變及體重變化肉眼觀察各組小鼠皮損表現(xiàn)情況并拍照記錄。于實(shí)驗(yàn)開始前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別檢測(cè)各組小鼠體重。

1.6.3血清SP水平末次電針后24 h內(nèi)，各組小鼠(n=5)均眼球取血，室溫放置2 h后1 000 r/min離心20 min。取血清于-80℃保存，血清各指標(biāo)檢測(cè)均按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的樣本濃度值，單位為pg/ml。

1.6.4脊髓強(qiáng)啡肽(DYN)Western印跡檢測(cè)各組小鼠經(jīng)麻醉取血后，經(jīng)心臟灌流PBS沖凈血液，快速暴露脊髓，小心取出脊髓組織置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中。勻漿后冰上裂解20 min，4℃離心，13 000 r/min，5 min。取上清，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白濃度定量檢測(cè)。取20 μg 蛋白樣品加入上樣緩沖液，濃度為1 mg/ml，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜后將偏聚二氟乙烯(PVDF)膜置于封閉液中室溫封閉60 min，然后孵育于一抗(Rabbit Anti-Big dynorphin，博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)，4℃ 過(guò)夜。在室溫孵育30 min后，PVDF 膜在洗膜緩沖液(TBST)中漂洗3次，每次10 min。孵育于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京)，室溫孵育1 h。PVDF 膜在TBST 中漂洗5次，每次3 min，然后采用化學(xué)發(fā)光法觀察目的條帶，以GAPDH作為對(duì)照進(jìn)行圖像灰度分析。

2　結(jié)　果

2．1不同組別小鼠搔抓次數(shù)比較見表1。各組小鼠搔抓次數(shù)組間重復(fù)性測(cè)量方差分析顯示有顯著性差異(F=42.403，P<0.01)；進(jìn)一步組間兩兩比較，實(shí)驗(yàn)第5天，與空白組比較，所有參與刺激造模的小鼠搔抓次數(shù)均顯著升高(均P<0.01)；模型組與內(nèi)關(guān)組、曲池組三組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第21天，各組小鼠搔抓次數(shù)仍均顯著高于空白組，但內(nèi)關(guān)穴組和曲池穴組小鼠搔抓次數(shù)均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)；內(nèi)關(guān)組與曲池組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1　四組小鼠各觀察時(shí)點(diǎn)搔抓次數(shù)和體重的比較±s,n=8)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2不同組別小鼠體重比較在實(shí)驗(yàn)第1天與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠的體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；各組小鼠體重增長(zhǎng)的差值組間比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組小鼠腹部皮損表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)，空白組小鼠腹部皮膚基本無(wú)變化，僅有輕微潮紅和水腫，未見皮疹、滲出及結(jié)痂。模型組小鼠腹部皮膚出現(xiàn)明顯紅斑、水腫、滲出，部分糜爛面逐漸結(jié)痂，可見黃色厚薄不一的痂皮，同時(shí)可見局部干燥、脫屑及表皮增厚等AD樣皮損改變。內(nèi)關(guān)組和曲池組小鼠腹部皮損表現(xiàn)與模型組相似，均有紅斑、水腫、皮疹等表現(xiàn)，但滲出、糜爛結(jié)痂及表皮增厚等癥狀均略輕于模型組。

2．4血清SP水平比較SP水平各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.28，P<0.01)。組間兩兩比較，與空白組〔(627.83±37.29)pg/ml〕相比，其余3組〔模型組(929.83±80.80)pg/ml；內(nèi)關(guān)組(827.62±93.81)pg/ml；曲池組(802.27±50.60)pg/ml〕小鼠血清SP含量均顯著增高(均P<0.01)。與模型組比較，內(nèi)關(guān)組與曲池組SP水平顯著降低(均P<0.05)；內(nèi)關(guān)組與曲池組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5脊髓DYN的Western印跡檢測(cè)結(jié)果小鼠脊髓DYN含量各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.367，P<0.01)。組間兩兩比較顯示，與空白組(11.33±17.039)相比，其余三組(模型組：33.33±3.215，內(nèi)關(guān)組：58.67±10.017，曲池組61.00±11.533)小鼠脊髓DYN濃度均明顯升高(均P<0.01)。內(nèi)關(guān)組與曲池組脊髓DYN濃度也均高于模型組(均P<0.05)；但是內(nèi)關(guān)組與曲池組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖1。

圖1　Western印跡檢測(cè)DYN表達(dá)

3　討　論

瘙癢是許多AD患者中常見而棘手的問題，也是影響疾病轉(zhuǎn)歸預(yù)后的重要因素。目前西醫(yī)臨床中主要是系統(tǒng)或局部應(yīng)用皮質(zhì)類固醇、抗組胺藥和免疫抑制劑等抑制瘙癢，止癢效果有限，且常因不良反應(yīng)無(wú)法長(zhǎng)期應(yīng)用，治療間斷后瘙癢迅速?gòu)?fù)發(fā)〔2,5,6,17〕。近年來(lái)，眾多臨床報(bào)道證實(shí)，無(wú)論是對(duì)于由組胺皮內(nèi)注射引起的實(shí)驗(yàn)性瘙癢，還是對(duì)由致敏源刺激誘發(fā)的瘙癢(如AD的慢性瘙癢)，針灸治療均顯示良好的止癢效果，且更安全無(wú)毒副作用〔8～12〕。

有報(bào)道指出〔3,13～18〕，運(yùn)用DNCB反復(fù)外搽刺激小鼠皮膚可以誘發(fā)出類似AD患者的瘙癢及皮損表現(xiàn)，故該法常被用于建立AD模型或是變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型，以考察瘙癢機(jī)制或藥物的抗炎止癢機(jī)制。搔抓次數(shù)是反映動(dòng)物瘙癢程度的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)提示電針可以有效抑制DNCB刺激誘發(fā)的瘙癢。經(jīng)電針處理的小鼠皮損癥狀略輕于模型組，其原因可能與電針抑制了搔抓行為從而減少對(duì)皮損的進(jìn)一步刺激有關(guān)。此外，各組小鼠體重增加未顯示出明顯差異，提示DNCB的反復(fù)慢性刺激并不會(huì)對(duì)小鼠的進(jìn)食及生長(zhǎng)造成很大影響。

DYN是一種內(nèi)源性阿片肽，為κ-受體激動(dòng)劑，主要在脊髓內(nèi)發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用，是針灸發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要阿片肽物質(zhì)〔19，20〕。疼痛與瘙癢在病理生理學(xué)方面有相似之處〔21〕,大量研究發(fā)現(xiàn)〔7,22，23〕，阿片肽類物質(zhì)及其受體不僅參與了痛覺的形成，也參與了癢覺的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制。μ-阿片肽受體和κ-阿片肽受體是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的阿片類物質(zhì)受體。神經(jīng)生理學(xué)研究證實(shí)，μ-受體激活參與癢覺的形成，而κ-受體激活則參與癢覺的抑制〔23〕。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，這兩個(gè)受體及其相應(yīng)內(nèi)源性阿片肽物質(zhì)形成相互制約的平衡關(guān)系，若打破這一平衡關(guān)系，則會(huì)出現(xiàn)癢覺異常。臨床上觀察到，嗎啡是U-受體激動(dòng)劑，外周或中樞給予嗎啡止痛可以引起瘙癢，給予選擇性κ-受體激動(dòng)劑卻顯示出對(duì)抗嗎啡相關(guān)性瘙癢的作用〔23～26〕。電針鎮(zhèn)痛的機(jī)制研究顯示〔19，20,27〕，電針(2/100 Hz或100～120 Hz)使脊髓DYN大量釋放，起到了強(qiáng)有力的鎮(zhèn)痛效果，卻不會(huì)產(chǎn)生類似嗎啡鎮(zhèn)痛后帶來(lái)的瘙癢這一不良反應(yīng)。而應(yīng)用κ-阿片肽受體阻斷劑顯著抑制120 Hz電針的止癢效應(yīng)，說(shuō)明120 Hz電針的止癢效應(yīng)是通過(guò)激活κ-受體而產(chǎn)生的〔28〕。由此我們推測(cè)，脊髓DYN在電針止癢中也扮演了重要的角色。本研究結(jié)果顯示，除空白組外，經(jīng)DNCB處理的各組小鼠的脊髓內(nèi)DYN含量均明顯提高，提示內(nèi)源性止癢活動(dòng)的開始，外周致癢物質(zhì)的持續(xù)刺激可以促使體內(nèi)合成和釋放更多的DYN來(lái)對(duì)抗瘙癢，但由于含量少因此對(duì)癢覺的抑制效果有限；經(jīng)電針治療后小鼠的DYN含量又顯著高于模型組，是由于電針的刺激使DYN在脊髓水平的釋放進(jìn)一步增強(qiáng)，加強(qiáng)了脊髓水平癢覺信號(hào)初級(jí)整合中樞的作用。

SP是廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)多肽，通過(guò)與游離感覺神經(jīng)末梢神經(jīng)激肽(NK)受體結(jié)合啟動(dòng)癢覺傳導(dǎo)過(guò)程,參與許多瘙癢性皮膚病的發(fā)生〔7〕。SP本身也是一種重要的瘙癢介質(zhì)。AD患者血清中SP水平明顯高于健康對(duì)照組，其含量與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)。精神緊張可通過(guò)周圍神經(jīng)元導(dǎo)致神經(jīng)肽逆向釋放從而加重AD患者的瘙癢。在高壓力狀態(tài)下AD患者血清中SP水平可顯著提高〔29,30〕。在皮膚組織中，研究發(fā)現(xiàn)AD 患者的SP 陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)目較正常對(duì)照組顯著增多〔2〕。這些結(jié)果提示,SP與AD 發(fā)病有密切的關(guān)系。本研究顯示經(jīng)DNCB處理的小鼠血清SP水平顯著升高，而電針可以逆轉(zhuǎn)模型小鼠血清中SP升高趨勢(shì)，降低SP水平，由此推測(cè)電針可能是通過(guò)促進(jìn)脊髓內(nèi)DYN釋放，使κ-受體大量激活，一方面減弱了中樞內(nèi)瘙癢的信號(hào)傳遞，另一方面通過(guò)抑制炎性介質(zhì)SP的釋放，減輕對(duì)外周癢覺神經(jīng)的刺激。

穴位是針灸取效的關(guān)鍵因素之一。曲池穴有祛邪透表和驅(qū)逐周身風(fēng)邪的特殊作用,是針灸臨床中用于治療皮膚病的常用穴位。而《素問·至真要大論》云：“諸痛癢瘡，皆屬于心”，明確提出“癢”與“心”的關(guān)系，止癢治療當(dāng)從“心”論治。中醫(yī)理論認(rèn)為心主神明，內(nèi)關(guān)穴屬手厥陰心包經(jīng)，心包與心在功能上聯(lián)系密切，常代心受邪。臨床上,內(nèi)關(guān)穴主要治療失眠、心悸、焦慮等神志和心腦疾病。類似于臨床上運(yùn)用抗抑郁焦慮藥緩解瘙癢〔2〕，對(duì)于皮膚濕疹瘙癢的治療，內(nèi)關(guān)穴則有安神止癢的功效。然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未顯示出電針內(nèi)關(guān)穴或曲池穴在止癢療效上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果的產(chǎn)生是否與兩穴屬于相鄰脊髓神經(jīng)節(jié)段產(chǎn)生相似的抗瘙癢效應(yīng)有關(guān)，還是因樣本量不足以顯示出兩者間的療效差異還不能明確。此外，兩穴在脊髓上中樞的效應(yīng)有無(wú)差異等問題尚需要進(jìn)一步的深入研究。

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〔2016-07-22修回〕

(編輯曲莉)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81403461)

符文彬(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事針灸治療痛癥及抑郁相關(guān)病癥的研究。

蔣麗(1983-)，女，博士，主要從事針灸治療皮膚病及抑郁相關(guān)病癥的研究。

R749

A

1005-9202(2016)16-3874-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.003