環(huán)境DNA metabarcoding及其在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

陳　煉，吳　琳，劉　燕，徐海根,*

1 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所, 南京　210042 2 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院, 南京　210013

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環(huán)境DNA metabarcoding及其在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

陳煉1, 2，吳琳2，劉燕1，徐海根1,*

1 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所, 南京210042 2 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院, 南京210013

環(huán)境DNA metabarcoding(eDNA metabarcoding)是指利用環(huán)境樣本(如土壤、水、糞便等)中分離的DNA進(jìn)行高通量的多個物種(或高級分類單元)鑒定的方法。近年來，該方法引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，逐漸應(yīng)用于生物多樣性研究、水生生物監(jiān)測、珍稀瀕危物種和外來入侵物種檢測等生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。介紹環(huán)境DNA metabarcoding的含義和研究方法；重點(diǎn)介紹環(huán)境DNA metabarcoding在物種監(jiān)測、生物多樣性研究和食性分析等生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用；總結(jié)環(huán)境DNA metabarcoding應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)并對該方法的發(fā)展進(jìn)行展望。

環(huán)境DNA；metabarcoding；生物多樣性；物種監(jiān)測

在生態(tài)學(xué)研究中，要實(shí)現(xiàn)對物種有效的管理與保護(hù)首先要對物種分布有清晰而明確的認(rèn)識，這需要建立準(zhǔn)確、快速的物種監(jiān)測機(jī)制。近年來，環(huán)境DNA metebarcoding被廣泛地應(yīng)用于生態(tài)學(xué)的研究中。環(huán)境DNA metabarcoding是在DNA條形碼技術(shù)的基礎(chǔ)上研究出來的新興方法。該方法從環(huán)境樣品中直接提取DNA，當(dāng)結(jié)合第二代測序技術(shù)時可以實(shí)現(xiàn)對環(huán)境樣品中所有存在物種的有效檢測，在生物多樣性研究、物種監(jiān)測、動物食性分析和外來入侵物種檢測等方面都有較好的應(yīng)用前景。

1　環(huán)境DNA metabarcoding

1.1環(huán)境DNA

環(huán)境DNA(environmental DNA, eDNA)的概念早在20世紀(jì)80年代末就已經(jīng)被提出，最初僅應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域，它是指從環(huán)境樣品(如土壤、沉積物、空氣、水體等)中提取的DNA，不對任何目標(biāo)生物進(jìn)行分離[1]。受該技術(shù)在微生物研究方面的啟發(fā)，科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)可以利用環(huán)境樣品中包含的DNA進(jìn)行物種鑒定及植食性動物的食性分析等方面的研究。

環(huán)境樣品中通常含有動植物脫落的細(xì)胞或者是游離的DNA，生物排泄過程中脫落的皮膚，尿液和糞便等也可以是“環(huán)境DNA”的來源，并能提供一個環(huán)境系統(tǒng)中物種的存在記錄[2-3]。

使用傳統(tǒng)采樣方法開展生態(tài)學(xué)研究，一些物種的樣本采集通常比較困難，并且耗時費(fèi)力。環(huán)境DNA允許從土壤、水體或是空氣中包含的動物毛發(fā)、脫落的細(xì)胞、糞便等進(jìn)行非損傷性取樣，從而成功進(jìn)行遺傳檢測。相比傳統(tǒng)的直接采樣，該方法成本更低，樣本采集受氣候條件影響較小[4]，可以進(jìn)行更大數(shù)量的樣本收集。環(huán)境DNA還可以用來分析那些很難通過傳統(tǒng)方法監(jiān)測的物種，比如那些需要經(jīng)過相關(guān)部門許可才可以獲得的瀕?；蛘湎∥锓N[5]。目前，有關(guān)環(huán)境DNA在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用研究已有較多報(bào)道[6-12]。

1.2環(huán)境DNA metabarcoding

DNA 條形碼作為物種快速鑒定和發(fā)現(xiàn)新物種的方法已得到廣泛應(yīng)用。對于不同類別生物的DNA條形碼已確定了不同的擴(kuò)增片段，例如：線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I 基因(COI) 已經(jīng)作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼廣泛用于鑒定動物物種[13]; 核糖體16S rRNA 常用于細(xì)菌的鑒定[14]; 而ITS 基因則作為真菌的標(biāo)準(zhǔn)條形碼用于物種鑒定[15]。中國植物條形碼工作組建議ITS 基因(或ITS2)應(yīng)作為種子植物的核心條形碼之一[16]。目前通常采用rbcL+matK+ITS 基因組合作為植物的標(biāo)準(zhǔn)DNA 條形碼用于物種鑒定[17]。

DNA條形碼技術(shù)雖然發(fā)展前景廣闊，但由于DNA 易發(fā)生降解，所以對于保存年代久遠(yuǎn)的博物館館藏標(biāo)本，要獲得標(biāo)準(zhǔn)的DNA 條形碼序列比較困難。對于DNA降解的標(biāo)本，相對而言，200bp左右的序列易于擴(kuò)增。由此，DNA 微型條形碼(DNA minibarcode)的概念被提出，它是指長度為100—200 bp的DNA 序列[18]。但在實(shí)際研究中，一方面，DNA易降解；另一方面，傳統(tǒng)測序技術(shù)僅適用于小樣品量的測序，當(dāng)需要研究的混合樣品包含上千個個體時，傳統(tǒng)測序技術(shù)不能滿足復(fù)雜的、大范圍的樣品測序。在第二代測序技術(shù)的發(fā)展和DNA條形碼存在局限性的雙重作用下，metabarcoding應(yīng)運(yùn)而生。Hajibabaei[19]認(rèn)為這兩種技術(shù)的結(jié)合極大地推動了“DNA 宏分類學(xué)(DNA metasystematics)”的發(fā)展。環(huán)境DNA metabarcoding是指利用宏條形碼對環(huán)境樣本(如土壤、水、糞便等)中分離的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和高通量測序，從而達(dá)到同時對環(huán)境樣本中多個物種(或高級分類單元)鑒定的目的[1,20]。環(huán)境DNA metabarcoding克服傳統(tǒng)物種鑒定方法耗時費(fèi)力的缺點(diǎn)，以更高的效率和更低的成本極大地拓展DNA 條形碼在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用。

環(huán)境DNA metabarcoding整合DNA 條形碼和高通量測序技術(shù)，通過提取環(huán)境樣品中的DNA，并使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后得到的可操縱分類單元(operational taxonomic units，OTUs)進(jìn)行物種鑒定[21]。該技術(shù)最大的優(yōu)勢在于高通量、低成本并能快速地鑒定物種[4- 5]，最大的局限性在于PCR 的偏向性，導(dǎo)致條形碼的解析度和普適性及數(shù)據(jù)庫的完善度水平較低。要實(shí)現(xiàn)metabarcoding 技術(shù)高通量、準(zhǔn)確、快速物種鑒定，最為關(guān)鍵的是構(gòu)建完善的物種DNA 條形碼的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫、物種信息庫、信息共享和應(yīng)用平臺[22]。

環(huán)境DNA metabarcoding擴(kuò)大了生物多樣性的研究范圍，其快速、可重復(fù)及高效性的特點(diǎn)讓更多的研究人員進(jìn)行物種鑒定和生物多樣性評估。在對混合樣品(水流樣品或土壤樣品等)的生物多樣性評估時，傳統(tǒng)方法中所遇的問題都會迎刃而解。

2　環(huán)境DNA metabarcoding的研究方法

2.1樣品采集

目前，在生態(tài)學(xué)研究中環(huán)境DNA樣本的主要來源是水體、土壤和糞便等。水樣可以來源于實(shí)驗(yàn)室的水箱[23]、天然的池塘[24-25]、河流[26- 27]、溪流[8]、海水[6,28]等。池塘、溪流、河流等的采樣量從15mL到10L不等，對于溪流、河水和海水而言，一般標(biāo)準(zhǔn)的樣本量大小是1—2L[5]。在物種監(jiān)測中一些研究小組采取在水體的不同地點(diǎn)3次取樣的方法來提高水樣中的物種覆蓋度，增加物種檢測概率[7- 8,10,24]。對于流動水，應(yīng)在水流上游連續(xù)采樣以避免水樣的重復(fù)采集。采樣過程中始終佩戴一次性無菌手套，每采樣一次及時更換手套[29]。水樣的采集通常采用沉淀法(precipitation)或?yàn)V膜法(filtration)[10,24]。沉淀法是使用50mL的滅菌離心管，取15mL的水樣，加入1.5mL的3mol/L醋酸鈉和33.5mL的無水乙醇，放置于-20℃冰箱保存[24,30]。同沉淀法相比，濾膜法需要更多體積的水, 其優(yōu)點(diǎn)是可以通過大量的水收集DNA，但也會丟失一些能夠增加檢測幾率的可溶性DNA[31]。水通過裝有47mm直徑，0.45m孔徑的硝酸纖維素?zé)o菌過濾膜的一次性過濾器過濾。過濾后，將濾膜放置在無菌的2mL小瓶中，加入無水乙醇放置于-20℃保存[32]。對于濾膜規(guī)格和類型的選擇，并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有些研究者選用25mm直徑，0.7m的玻璃纖維濾膜或1.5m的玻璃纖維素濾膜[27,33]。研究發(fā)現(xiàn)對于靜水和流水樣本的大型無脊椎動物，使用濾膜法檢測率最高。環(huán)境DNA采樣同傳統(tǒng)的方法比更容易以統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施，而且不易受到采樣強(qiáng)度和人員培訓(xùn)差異的影響而變化[29]。

在對土壤的生物多樣性分析中，土壤樣品應(yīng)該盡可能地代表研究區(qū)域的生物多樣性，當(dāng)研究區(qū)域的生物分布具有異質(zhì)性時需要多份樣品混合取樣。在收集土壤樣品時需要注意兩點(diǎn)：一是應(yīng)該隨機(jī)或有規(guī)律地采集來自不同深度的土樣，二是每個取樣地點(diǎn)應(yīng)該至少收集兩份樣品，同時每份樣品應(yīng)該是該取樣地點(diǎn)不同深度的土樣的混合品[31]。開展食性分析研究時，對采集到的1個或多個糞便樣本，應(yīng)從樣本混合物中進(jìn)行多次取樣，以增加檢測出樣品中所含被捕食動物的可能性[34]。

2.2環(huán)境DNA的提取

環(huán)境DNA提取方法也有很多種，包括氯仿萃取法[35]、 細(xì)胞溶解的物理破碎法[26]以及二氧化硅提取法[8]。Dveiner等[33]采集湖泊和河流水樣，比較了6種不同的樣本采集和DNA提取方法組合對水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性監(jiān)測的影響，結(jié)果表明不同的環(huán)境DNA采集和提取方法對DNA產(chǎn)量和高通量測序技術(shù)獲得的序列數(shù)量有顯著影響。采用濾膜法結(jié)合DNeasy 血液和組織試劑盒(Qiagen, 德國)提取DNA的方法對生活在激流環(huán)境中物種的檢測率最高。這也在檢測稀有物種或入侵物種的研究中得到證實(shí)[8,27,36]。目前研究中環(huán)境DNA提取使用較多的是DNeasy 血液及組織試劑盒(Qiagen, 德國), QIAamp 組織試劑盒(Qiagen德國), PowerWaterTMDNA 提取試劑盒 (MoBio Laboratories, 美國)， PowerMaxTM土壤 DNA 提取試劑盒 (MoBio Laboratories, 美國)等[11,25,33]。

2.3PCR擴(kuò)增與引物設(shè)計(jì)

由于環(huán)境DNA樣本往往會混有不同物種，無法使用傳統(tǒng)的DNA條形碼進(jìn)行研究。根據(jù)研究目的的需要，通常會擴(kuò)增1個或多個基因。動物研究一般選擇擴(kuò)增線粒體COI基因，Cytb基因，12S rRNA和18S rDNA等，植物研究一般選擇擴(kuò)增葉綠體DNAtrnL 的P6環(huán)。Thomsen等[10]通過擴(kuò)增環(huán)境水樣中混合DNA的線粒體COI基因和Cytb基因，成功鑒別了該環(huán)境中包含的兩棲類、魚類、甲蟲、哺乳動物和昆蟲等。

Metabarcoding技術(shù)依賴于設(shè)計(jì)理想的引物，通過PCR從環(huán)境樣品中擴(kuò)增出高質(zhì)量的混合DNA片段。由于環(huán)境中DNA易于受到紫外線和微生物分解作用的影響，物種的長DNA片段十分容易降解，因此使用短的片段(約90—120bp)十分重要[5]。在不同的研究中，選擇的宏條形碼不可能是完全相同的，在很多情況下需要針對特定的生物設(shè)計(jì)特異性的引物[38]。所以使用metabarcoding技術(shù)分析環(huán)境DNA的研究中，為了避免在不同分類種群中放大偏差，設(shè)計(jì)短小的、高度保守的引物是極其重要的。如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物保守度低和特異性不足的話，容易引起堿基錯配甚至引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果[27]。因此理想的宏條形碼應(yīng)該具有序列短且高度保守、高辨別度等優(yōu)點(diǎn)。Leray等[37]設(shè)計(jì)了5組針對線粒體COI基因片段擴(kuò)增的特異性引物，研究天竺鯛科(Apogonidae)和金鱗魚科(Holocentridae)珊瑚魚的胃內(nèi)容物。結(jié)果表明其中一對引物(mlCOIintF/jgHCO2198)擴(kuò)增出的313bp的線粒體COI基因片段比傳統(tǒng)的COI基因通用引物(LCO1490/HCO2198)在后生動物多樣性研究中能夠獲得更多的OTUs，擴(kuò)增成功率更高。

目前雖然有一些工具可以幫助生物學(xué)家設(shè)計(jì)引物，比如Primer5和QPrimer，但是還不能完全滿足metabarcoding設(shè)計(jì)引物的需求。Riaz等[38]通過研究證實(shí)ecoPrimers軟件可以滿足metabarcoding研究中設(shè)計(jì)引物的要求，盡管仍然存在一對引物覆蓋率較低的問題，但是可以通過設(shè)計(jì)極短的條形碼來提高引物的特異性和對目標(biāo)物種的覆蓋率。相信隨著公共數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的不斷完善，可以根據(jù)生物的特異性和研究需求，精確地設(shè)計(jì)出更多更有效的條形碼。

2.4第二代高通量測序技術(shù)

1977年，Sanger等發(fā)明了雙脫氧核苷酸末端終止法，而Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法標(biāo)志了第一代測序技術(shù)的產(chǎn)生。第一代測序技術(shù)完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖的測序工作，但是由于其測序成本高、速度慢等缺點(diǎn)并不是最理想的方法[39]。隨后，出現(xiàn)了可以邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA 的序列的第二代高通量測序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)，包括羅氏公司的454技術(shù)的GS FLX測序平臺、Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺[40]。第二代測序技術(shù)的大致步驟為：將片斷化的基因組DNA 兩端連上特殊的接頭，通過不同的方式將每個片段結(jié)合在微珠或芯片上，形成幾百萬個可以同時進(jìn)行反應(yīng)的微型反應(yīng)池，每個單鏈DNA 片段在其微型反應(yīng)池中通過PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生大量拷貝形成單克隆“DNA 簇群” (Polony)，以作為測序的模板；再通過酶延伸反應(yīng)或寡核苷酸連接反應(yīng)同時對這幾百萬個微型反應(yīng)池中的模板進(jìn)行測序[41]。

第二代測序技術(shù)最顯著的特征就是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序，目前SOLiD 3系統(tǒng)單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度[42]。與第一代測序技術(shù)相比，雖然讀取的序列片段長度和準(zhǔn)確度不及Sanger測序，但是第二代測序技術(shù)不僅降低了測序成本并縮短了測序時間，同時又可以對復(fù)雜的混合樣品進(jìn)行測序。因此第二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用可以在短時間內(nèi)對環(huán)境樣品中包含的上百萬條序列進(jìn)行測序，可以實(shí)現(xiàn)短時間對復(fù)雜環(huán)境樣品的研究。隨著第三代測序技術(shù)(如SMRT技術(shù)，納米孔單分子測序技術(shù)等)的迅速發(fā)展，測序的長度和準(zhǔn)確性都會大幅度提高。同時第三代測序技術(shù)無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增[43- 44]，解決了第二代測序錯誤偏向性的問題。

2.5生物信息學(xué)分析

Metabarcoding使用通用PCR引物擴(kuò)增環(huán)境中的DNA，經(jīng)高通量測序后得到其中包含的大規(guī)模分類學(xué)信息基因。然而如何對測序得到的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理是第二代測序的主要問題。由于得到的序列片段較短，而且環(huán)境樣品通常具有高度的復(fù)雜性，很難確定某條序列來自于哪個物種，因此面對海量的短序列，拼接和進(jìn)一步的分析具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。一般來說，數(shù)據(jù)處理過程主要包括：(1)去除噪音，即對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以去除低質(zhì)量的污染的序列。測序產(chǎn)物可能含有非特異性擴(kuò)增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)，長度過短的序列，及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體(chimera)，將這些序列納入分析范圍會降低分析質(zhì)量，因此修剪、去除(trim)這部分序列，可得到供精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列。如：SeqClean、VecScree、UCHIME等可以用來去除噪音[39]；(2)使用相關(guān)軟件如(USEARCH/CROP、Denoiser/UCLUST、OCTUPUS)根據(jù)相似度或序列組成對序列進(jìn)行歸類獲得OTUs。因?yàn)槊總€物種單獨(dú)貢獻(xiàn)許多DNA，而且通過PCR被復(fù)制了很多次，所以輸出的數(shù)據(jù)集需要使用軟件分配OTUs,其每一個理想的OTUs應(yīng)該只包含來自一個物種的序列[21]。最后，代表序列取自每個OTU和分配使用一個上面列出的數(shù)據(jù)庫的一個或多個分類法。通過多個對條形碼的分析可以獲得在該環(huán)境中各種物種的存在情況；(3)在獲得了OTUs后可以針對研究的具體內(nèi)容進(jìn)行后續(xù)分析，比如α-多樣性分析、β-多樣性分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、物種分類及物種豐度分析等[39]。

3　環(huán)境DNA metabarcoding在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

3.1生物多樣性研究

物種的準(zhǔn)確鑒定是探索、認(rèn)識物種和保護(hù)生物多樣性的基礎(chǔ)。但是，使用傳統(tǒng)的方法鑒定物種有很多局限性：(1)耗時較長，效率較低；(2)過于依賴專家的經(jīng)驗(yàn)，鑒定與分類結(jié)果的正確性有待商榷；(3)在某些物種的特定階段或發(fā)育階段時，會影響鑒定結(jié)果。DNA 條形碼可以構(gòu)建植物與動物之間的網(wǎng)狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以從群落水平探討物種多樣性、系統(tǒng)發(fā)育多樣性與群落穩(wěn)定性之間的相互關(guān)系[17]。

近年來，環(huán)境DNA metabarcoding已成功應(yīng)用于動植物的多樣性研究。Yoccoz等[12]利用metabarcoding技術(shù)分析了不同植被類型的土壤DNA，獲得其中葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子P6環(huán)序列，結(jié)果表明利用土壤DNA檢測的植物多樣性與傳統(tǒng)地面調(diào)查估計(jì)的植物種類和生長型多樣性結(jié)果高度一致。Bienert等[45]利用metabarcoding技術(shù)結(jié)合線粒體16S基因，設(shè)計(jì)兩個DNA短序列的特異性引物(大約30bp和70bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，分析了法國阿爾卑斯山地生態(tài)系統(tǒng)土壤中蚯蚓組成。研究表明基于DNA方法分析的蚯蚓群落多樣性與傳統(tǒng)分類方法獲得的結(jié)果一致，闡明了環(huán)境DNA作為土壤動物多樣性評價(jià)工具的潛力。Thomsen等[6]從丹麥的一個海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究海洋魚類生物多樣性。在獲得的環(huán)境DNA中發(fā)現(xiàn)了15種不同的魚類以及4種鳥類，其中包括一些用傳統(tǒng)監(jiān)測方法很難發(fā)現(xiàn)的稀有物種。同時與9種傳統(tǒng)的海洋魚類調(diào)查方法比較，環(huán)境DNA檢測出的魚類多樣性與其他傳統(tǒng)方法相當(dāng)，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Thomsen等[10]研究表明從湖泊、池塘和河流的少量水樣中直接獲得DNA，可以檢測并定量分析研究區(qū)域內(nèi)珍稀及瀕危淡水動物(兩棲類、魚類、哺乳類、昆蟲類和甲殼類)多樣性。同時表明通過池塘水中分離的DNA，利用第二代測序技術(shù)可以檢測到研究區(qū)域內(nèi)兩棲類和魚類群體，環(huán)境DNA可以作為監(jiān)測珍稀瀕危物種的工具，應(yīng)用于更廣泛的物種監(jiān)測中。

應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)不僅可以針對當(dāng)前的生物多樣性進(jìn)行有效的評估，也可以對過去的動植物群落的多樣性進(jìn)行評估[11,45]。Epp等[11]通過對過去和現(xiàn)在的環(huán)境DNA進(jìn)行metabarcoding研究，所有目標(biāo)類群都能通過metabarcoding的方法檢測出來，但是類群之間和不同年代的環(huán)境樣品所檢測的結(jié)果存在較大變異范圍，如更新世時期的樣品中真菌檢測成功率最高，同時也可以檢測到苔蘚植物、甲蟲和鳥類的序列。

目前國內(nèi)在應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究生物多樣性的報(bào)道還比較少。楊晨雪等[46]使用metabarcoding技術(shù)研究土壤樣品中的生物多樣性，通過三種不同的生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行比較分析，探討了用18S rDNA基因擴(kuò)增土壤中后生動物的有效性，研究證明metabarcoding技術(shù)可以快速、全面、有力地調(diào)查土壤動物多樣性。中科院昆明動物所Yu等[47]利用馬氏網(wǎng)誘捕節(jié)肢動物，對整個混合樣本的DNA進(jìn)行線粒體COI基因擴(kuò)增，再進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，探討metabarcoding方法對群落的差異度(β-多樣性)和群落內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育(α-多樣性)評估的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明metabarcoding方法可以在更廣的尺度上有效地測量生物多樣性。

3.2食性分析

食性分析及食物網(wǎng)絡(luò)的研究可直接體現(xiàn)出生態(tài)群落的功能結(jié)構(gòu)，是生態(tài)系統(tǒng)研究的重要組成部分[34]。傳統(tǒng)的食性分析通常通過收集糞便并鑒別其中的食物殘留，研究人員通過肉眼直接觀察或利用早期的分子實(shí)驗(yàn)獲取食譜信息。由于食物殘留情況各異，這種方法耗時費(fèi)力，對分析人員的經(jīng)驗(yàn)依賴性大而且解析度不高，時間長，準(zhǔn)確度不高[48]。

在動植物間的植食網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，當(dāng)觀察動物的行為存在困難時，可利用動物消化道中的食物殘?jiān)?，利用metabarcoding技術(shù)，研究人員可快速準(zhǔn)確地進(jìn)行大量樣品的食性分析[34]。Shehzad等[49]基于第二代測序技術(shù)進(jìn)行了食肉動物豹貓(Prionailurusbengalensis)的食性分析。從38個豹貓的糞便提取出了混合DNA，通過擴(kuò)增約100bp片段的12S rRNA研究豹貓取食的食物種類，發(fā)現(xiàn)了18種獵物，包括八種哺乳動物、八種鳥類、一種兩棲類和一種魚類，并且確定豹貓主要食用嚙齒動物鼠類。

3.3外來入侵物種的檢測

目前外來入侵物種的情況日趨嚴(yán)重。當(dāng)外來物種入侵時，入侵物種很有可能破壞原本的生態(tài)平衡，使生態(tài)系統(tǒng)不完善，從而對本地物種的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響[24]。但是在早期入侵階段外來入侵物種通常數(shù)量不多，使用傳統(tǒng)的檢測方法耗時且效率不高，難度高，不能及時被發(fā)現(xiàn)。這會導(dǎo)致外來入侵物種對本地生態(tài)平衡的危害達(dá)到最高值時才受到重視，為時已晚。環(huán)境DNA metabarcoding增強(qiáng)了對入侵物種早期監(jiān)測的可能性，可以有效地遏制物種入侵。

研究發(fā)現(xiàn)利用環(huán)境DNA metabarcoding可以從淡水中提取環(huán)境DNA，檢測出外來入侵物種的存在。Ficetola等[24]最早將環(huán)境DNA metabarcoding應(yīng)用于物種監(jiān)測，他們使用特異性引物擴(kuò)增短線粒體DNA序列追蹤在受控環(huán)境和自然環(huán)境中一種入侵牛蛙(Ranacatesbeiana)的存在，發(fā)現(xiàn)對環(huán)境中低密度的物種，使用metabarcoding技術(shù)仍然可以進(jìn)行快速有效的物種檢測。這是首次結(jié)合大規(guī)模測序和DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展來進(jìn)行物種識別，為利用環(huán)境DNA監(jiān)測外來物種提供了新方法和新思路。Jerde等[26]利用環(huán)境DNA研究美國芝加哥地區(qū)河流中的兩種入侵亞洲鯉科魚(Hypophthalmichthysmolitrix和H.nobilis)，發(fā)現(xiàn)使用傳統(tǒng)電氣捕魚法檢測到一條魚需要93人d的努力，而環(huán)境DNA metabarcoding方法檢測到目標(biāo)物種只需要0.174人d。在亞洲鯉科魚種群密度很低的區(qū)域，只有環(huán)境DNA方法能夠檢測到這兩種魚[5]?？梢?，環(huán)境DNA metabarcoding方法不僅在時間和資金成本上優(yōu)于傳統(tǒng)監(jiān)測方法，而且可以在種群密度很低的環(huán)境樣本中靈敏地檢測到入侵物種的存在。Piaggio等[23]捕獲入侵佛羅里達(dá)州的半水棲物種緬甸巨蟒(Pythonbivittatus)，放置于90L的水箱中評估水中環(huán)境DNA的降解速率，結(jié)果表明緬甸巨蟒的DNA在96h以內(nèi)都可以檢測到。在佛羅里達(dá)州6個野外地點(diǎn)采集的水樣中，有5個地點(diǎn)的緬甸巨蟒環(huán)境DNA為陽性，這與緬甸巨蟒的野外分布結(jié)果一致。Takahara等[7]使用環(huán)境DNA方法采集日本海岸以及周圍島嶼的70個水樣對一種入侵藍(lán)腮太陽魚(Lepomismacrochirus)進(jìn)行檢測。利用藍(lán)腮太陽魚的特異性引物(100bp的Cytb片段)擴(kuò)增水環(huán)境DNA，結(jié)果表明70個池塘中有19個池塘遭受藍(lán)腮太陽魚的入侵。盡管魚的大小、習(xí)性等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，但使用環(huán)境DNA metabacoding提高了監(jiān)測入侵物種的準(zhǔn)確度。

3.4物種監(jiān)測

通過水體中的環(huán)境DNA可以有效檢測水生脊椎動物，并且已在濕地和大型河流研究中得到證實(shí)[26]。利用環(huán)境DNA檢測河流中的稀有物種和隱秘物種可以增加調(diào)查結(jié)果準(zhǔn)確性，減少調(diào)查成本。Goldberg等[8]利用metabarcoding技術(shù)，通過收集快速流動的水體環(huán)境DNA樣本，對尾突角蟾(Ascaphusmontanus)和愛達(dá)荷陸巨螈(Dicamptodonaterrimus)兩種珍稀物種進(jìn)行監(jiān)測。設(shè)計(jì)特異性引物尾突角蟾和愛達(dá)荷陸巨螈的線粒體Cytb區(qū)域的85bp和78bp片段，在5個不同物種密度的水樣中均成功進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并靈敏地檢測到了目標(biāo)物種的存在。該研究還發(fā)現(xiàn)早春季節(jié)比早秋季節(jié)更難以檢測到兩棲類物種存在，推測可能是由于早春比早秋溫度更低，降低了生物代謝速率而導(dǎo)致。Foote等[28]從海水中分離DNA，使用特異性引物擴(kuò)增線粒體DNA區(qū)域60—80bp的片段檢測水體中是否存在港灣鼠海豚(Phocoenaphocoena)，對控制條件下和自然條件下該物種進(jìn)行遺傳監(jiān)測。在一個樣地中檢測到長肢領(lǐng)航鯨(Globicephalamelas)，而該物種極少在研究海域被發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)境DNA的方法可用于檢測稀有物種。Wilcox等[27]利用環(huán)境DNA結(jié)合定量PCR檢測了河流中的兩個稀有物種，美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfontinalis)和強(qiáng)壯紅點(diǎn)鮭(S.confluentus)，同時發(fā)現(xiàn)定量PCR(qPCR)比傳統(tǒng)PCR更加靈敏，檢測概率更高。Rees等[25]利用環(huán)境DNA和傳統(tǒng)的實(shí)地調(diào)查方法開展對英國珍稀保護(hù)物種冠北螈(Trituruscristatus)的監(jiān)測，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)有冠北螈分布的地點(diǎn)中，采集的水樣DNA中成功檢測出冠北螈的概率為84%。使用環(huán)境DNA方法監(jiān)測物種，對物種及其生存環(huán)境不會造成損害。隨著測序成本的下降，環(huán)境DNA與metabarcoding技術(shù)結(jié)合應(yīng)用在許多情況下甚至優(yōu)于一些傳統(tǒng)監(jiān)測方法，成為物種監(jiān)測方法的又一選擇[4]。

4　面臨的挑戰(zhàn)

4.1樣品來源的影響

使用環(huán)境DNA監(jiān)測水生生物時，必須保證能獲得該環(huán)境的完整樣品并能進(jìn)行很好的保存[27]。水體的溫度和光照情況[53-54]，水體的流速[55]，物種密度和在環(huán)境中的停留時間[54]，生物體的發(fā)育階段[55]等均會對環(huán)境中所取的DNA的量造成影響。Maruyama等[56]對水體中DNA的半衰期進(jìn)行了研究和計(jì)算，發(fā)現(xiàn)魚類離開此水體后環(huán)境DNA的半衰期是6.3h，但對環(huán)境DNA降解速率及其影響因素，環(huán)境DNA在環(huán)境中存在時間的長短等問題仍缺乏充分的了解。

在采集溪流水樣時，由于許多溪流水來自于地下水，所以接觸到目標(biāo)生物脫落DNA的可能性較低。此外，由于溪流水水位淺而且是充分混合的，因此脫落的DNA被光降解的可能性更大，導(dǎo)致在溪流中檢測到的目標(biāo)物種密度會比較低[27]。使用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)對淡水中的物種進(jìn)行檢測已被證實(shí)快速有效。淡水中水流較平和且流量小，所以準(zhǔn)確度高。與淡水相比，海洋生態(tài)系統(tǒng)中有單位體積中的生物量比例更大，海流和波浪的影響作用，以及鹽度對保存和提取環(huán)境DNA的影響都需要加以考慮。這些因素可能意味著海水中的環(huán)境DNA不太集中，且分散更迅速，提取DNA時比較困難，導(dǎo)致在海水中使用時只能針對一小片區(qū)域，并且對外來入侵物種的檢測效率不高。因此在海水中的使用還需要進(jìn)一步的研究與完善[28]。

4.2PCR擴(kuò)增的偏向性

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的一個潛在的局限性是PCR引物設(shè)計(jì)。通用引物的使用是普遍的，對所有的序列都有擴(kuò)增的作用。非特異性的引物和探針會造成假陽性的結(jié)果，非靶標(biāo)模板的競爭會產(chǎn)生不準(zhǔn)確的DNA量估計(jì)，從而導(dǎo)致物種豐富度的不準(zhǔn)確估計(jì)[53]?？梢酝ㄟ^以下兩種方式來解決由于非特異性引物而造成的假陽性：(1)設(shè)計(jì)分析與非目標(biāo)物種最大化堿基對錯配的引物區(qū)域；(2)通過實(shí)驗(yàn)來測定靶DNA和非靶DNA的純樣品和混合樣品[27]。

從長遠(yuǎn)角度看，在PCR擴(kuò)增時低密度的物種可能會因?yàn)橥ㄓ靡锏脑虮缓鲆暎@也就是PCR的偏向性。但是如果任由PCR的偏向性發(fā)生，會導(dǎo)致一些稀有的或者本身難以擴(kuò)增的物種有數(shù)據(jù)丟失的情況，或者引入嵌合體等錯誤產(chǎn)物[21]。目前的第三代測序技術(shù)就是采用單分子讀取技術(shù)，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度。而且不依賴于PCR擴(kuò)增，不僅進(jìn)一步降低了測序成本，而且解決了在環(huán)境DNA metabarcoding的研究中PCR擴(kuò)增偏向的制約問題[43]。

5　展望

在第三代測序技術(shù)的推動下，不需要經(jīng)過PCR步驟的metabarcoding(PCR-free metabarcoding)技術(shù)，相信在不久的將來就會實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)的應(yīng)用可以對物種中存在線粒體DNA的總量進(jìn)行推斷，還可以在生態(tài)學(xué)的研究中作為一種新興方法對物種的生物量和相對豐度進(jìn)行評估，將極大地改變生態(tài)學(xué)家對生態(tài)多樣性檢測方法的認(rèn)知。所以在今后環(huán)境DNAmetabarcoding研究中, 一方面要大力發(fā)展PCR-free metabarcoding，不斷完善數(shù)據(jù)庫并且發(fā)展生物信息學(xué)工具增加數(shù)據(jù)處理的可信度[21]。另一方面應(yīng)盡快形成環(huán)境DNA metabarcoding對不同環(huán)境采樣的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。雖然環(huán)境DNA metabarcoding并不能完全取代傳統(tǒng)的野外工作者和專業(yè)分類學(xué)家的工作，但是對于提高受限制和保護(hù)資源的有效利用而言是一個十分有效的工具[5]。

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Application of environmental DNA metabarcoding in ecology

CHEN Lian1,2, WU Lin2, LIU Yan1, XU Haigen1,*

1NanjingInstituteofEnvironmentalSciences,MinistryofEnvironmentalProtection,Nanjing210042,China2CollegeofLifeSciences,ChemistryandChemicalEngineering,JiangsuSecondNormalUniversity,Nanjing210013,China

Environmental DNA metabarcoding is defined as high throughput DNA sequencing used for simultaneous molecular identification of multiple taxa in a complex environmental sample (i.e., soil, water, feces, etc.). In recent years, this method has aroused widespread concern among scientists and has been increasingly used in the field of ecology, such as biodiversity research, monitoring of aquatic, rare, or invasive species. This article describes the significance and the methods of environmental DNA metabarcoding, and highlights its application in the fields of species monitoring，detection of rare and invasive species, biodiversity, and diet analysis. Finally, this article summarizes the challenges in application of environmental DNA metabarcoding in ecological research and discusses the future prospects of its development.

environmental DNA; metabarcoding; biodiversity; species detection

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2013)；江蘇省環(huán)境科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助

2015- 01- 15; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 11- 17

Corresponding author.E-mail: xhg@nies.org

10.5846/stxb201501150125

陳煉，吳琳，劉燕，徐海根.環(huán)境DNA metabarcoding及其在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(15):4573- 4582.

Chen L, Wu L, Liu Y, Xu H G.Application of environmental DNA metabarcoding in ecology.Acta Ecologica Sinica,2016,36(15):4573- 4582.