不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者外周血CD14+單核細(xì)胞IL-1β、IL-1Ra表達(dá)水平的差異

張國(guó)良　王玲玲　詹森林　曹廷智　汪文斐　張紅梅　鄧群益　聶廣

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不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者外周血CD14+單核細(xì)胞IL-1β、IL-1Ra表達(dá)水平的差異

張國(guó)良王玲玲詹森林曹廷智汪文斐張紅梅鄧群益聶廣

目的探討肺結(jié)核患者不同中醫(yī)證型與CD14+單核細(xì)胞白介素-1β(interleukine-1β,IL-1β)、白介素-1受體拮抗劑(interleukine-1 receptor anlagenist,IL-1Ra)表達(dá)水平的相關(guān)性。 方法選取104例肺結(jié)核確診患者為研究對(duì)象，其中肺陰虧虛33例，陰虛火旺36例，氣陰兩虛35例。采集抗凝血并利用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，與CD14+免疫磁珠孵育后獲得單核細(xì)胞，使用結(jié)核桿菌裂解物刺激單核細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。12小時(shí)后收集細(xì)胞上清通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IL-1β、IL-1Ra水平，同時(shí)裂解細(xì)胞提取總RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定IL1B、IL1RN基因相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)方差分析比較不同證型肺結(jié)核患者IL-1β、IL-1Ra表達(dá)水平的差異。結(jié)果(1)成功建立檢測(cè)IL1B、IL1RN基因的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，靶基因可以被有效擴(kuò)增，并且引物具有良好特異性;(2)結(jié)核菌刺激后IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高，其中肺陰虧虛組顯著高于陰虛火旺組和氣陰兩虛組(P<0.05)，陰虛火旺組IL-1β分泌水平又顯著高于氣陰兩虛組(P<0.05)。IL-1B mRNA表達(dá)趨勢(shì)與蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組中IL-1B基因表達(dá)水平依次降低，組與組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)；(3)結(jié)核菌刺激能夠顯著增加IL-1Ra分泌水平，氣陰兩虛組顯著高于其它兩組(P<0.05)，而肺陰虧虛組和陰虛火旺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，在mRNA層面氣陰兩虛組IL1RN表達(dá)水平顯著高于其它兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)；(4)在結(jié)核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺陰虧虛和陰虛火旺組中明顯增高，顯著高于氣陰兩虛組(P<0.01、P<0.05)。 結(jié)論IL-1β、IL-1Ra表達(dá)水平與肺結(jié)核中醫(yī)病機(jī)演變密切相關(guān)，由此推測(cè)它們不僅可以作為肺結(jié)核中醫(yī)微觀辨證的生物標(biāo)識(shí)，也可以作為未來(lái)結(jié)核病治療的有效分子靶點(diǎn)。

肺結(jié)核；中醫(yī)證型；白介素-1β；白介素-1受體拮抗劑；單核細(xì)胞

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由單一感染因素引起的死亡率最高的疾病，因本病每年全球死亡人數(shù)高達(dá)140萬(wàn)，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。經(jīng)過(guò)多年努力，中國(guó)結(jié)核病流行總體形勢(shì)有所好轉(zhuǎn)，但仍是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，并且耐多藥結(jié)核(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)的危害也日益凸顯[1]。肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)是結(jié)核病的主要表現(xiàn)形式，屬于中醫(yī)“肺癆”范疇，其病因外為感染癆蟲(chóng)，內(nèi)為正氣虛弱，且兩者相互為因。結(jié)核桿菌屬于胞內(nèi)菌，可以在CD14+細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中復(fù)制、存活[2]。白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)作為巨噬細(xì)胞分泌的重要前炎癥因子，在控制結(jié)核菌感染以及轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色[3]。IL-1R拮抗劑(IL-1Ra)由IL1RN基因編碼，能特異性地與IL-1受體結(jié)合，拮抗IL-1而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。本研究通過(guò)探討肺結(jié)核患者不同中醫(yī)證型與CD14+單核細(xì)胞IL-1β、IL-1Ra表達(dá)水平的相關(guān)性，以期明確肺結(jié)核病機(jī)演變過(guò)程中免疫應(yīng)答變化特征，并為中醫(yī)微觀辨證提供新的生物標(biāo)識(shí)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取于2014年6月至2015年6月期間在深圳市第三人民醫(yī)院就診的104例肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，其中男性65例，女性39例，平均年齡(36.5±13.7)歲。所有患者均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》中的診斷要求[5]，且痰涂片陽(yáng)性，結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測(cè)陽(yáng)性，均為初治肺結(jié)核，無(wú)合并其它感染性疾病、遺傳代謝性疾病和自身免疫性疾病等。本研究經(jīng)深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑與儀器

人淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào)：DKW-KLSH-0100)購(gòu)自深圳達(dá)科微生物公司，RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：11875-093)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)：10437-028)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CD14免疫磁珠(貨號(hào)130-097-052)購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司，總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，批號(hào)：74106)購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)Qiagen公司，SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑(批號(hào)：RR820A)購(gòu)自日本TAKARA公司，qPCR引物委托深圳華大基因研究院合成，IL-1β、IL-1Ra細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：DLB50、DRA00B)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品，多功能酶標(biāo)儀DTX880和細(xì)胞離心機(jī)為德國(guó)Beckman公司產(chǎn)品，ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，結(jié)核分枝桿菌裂解物由課題組前期自行制備并保存。

1.3中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]，擬定肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛3個(gè)證型的主癥和次癥，根據(jù)其臨床證侯、舌象、脈象進(jìn)行中醫(yī)辨證分型。所有病例的辨證分型均由兩名專(zhuān)科中醫(yī)師共同完成，分型結(jié)果不一致的病例予以剔除。由于陰陽(yáng)兩虛多見(jiàn)于病程日久、遷延難愈患者，且合并艾滋病患者居多，為避免不同疾病中醫(yī)證型的相互干擾，本研究未納入陰陽(yáng)兩虛患者。入選病例中肺陰虧虛33例、陰虛火旺36例、氣陰兩虛35例。不同中醫(yī)證型人群在年齡、性別分布中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.4外周血CD14+單核細(xì)胞的分選

用肝素鋰抗凝管采集外周血5 mL，然后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)比稀釋?zhuān)徛尤隖icoll淋巴細(xì)胞分離液上方，采用密度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取1×107個(gè)PBMCs與CD14免疫磁珠5 μL置于4℃保存，孵育20分鐘，再使用MACS自動(dòng)磁珠分選儀獲得CD14+單核細(xì)胞。

1.5結(jié)核桿菌刺激CD14+單核細(xì)胞

將來(lái)源于同一結(jié)核病患者的CD14+單核細(xì)胞一分為二，分別接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中兩個(gè)細(xì)胞孔，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，加入含10 %胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，并放置在5% CO2、37°C培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，12小時(shí)后，將其中一個(gè)細(xì)胞孔加入經(jīng)煮沸處理的結(jié)核菌裂解物(Mtb lysate，20 μg/mL)刺激。刺激12后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，細(xì)胞裂解后提取總RNA，上清檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-1Ra濃度。另外一個(gè)細(xì)胞孔則以無(wú)細(xì)菌刺激作為空白對(duì)照。

1.6總RNA的提取及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

根據(jù)RNeasy Mini Kit的說(shuō)明書(shū)操作步驟，從CD14+單核細(xì)胞中提取總RNA。RNA的質(zhì)量及濃度檢測(cè)采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定。取2 μL RNA，使用oligo-T通用逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA。使用IL1B和IL1RN基因特異性引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL， cDNA模板2 μL，加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95°C 30秒，隨后95°C 5秒，60°C 34秒，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參基因Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終以2-ΔΔCt值表示IL1B和IL1RN基因拷貝數(shù)。

1.7ELISA測(cè)定細(xì)胞上清IL-1β、IL-1Ra濃度

ELISA試劑盒測(cè)定IL-1β、IL-1Ra濃度。首先加入200 μL樣本至反應(yīng)孔中，室溫孵育2小時(shí)后，PBS洗滌3次，然后加入200 μL酶標(biāo)二抗室溫孵育1小時(shí)，PBS洗滌3次，最后加入200 μL底物顯色，使用DTX880酶標(biāo)儀讀取光密度值(optical density，OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子濃度，然后比較不同中醫(yī)證型患者之間表達(dá)水平差異。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL1B、IL1RN基因表達(dá)

如圖1所示，qPCR擴(kuò)增曲線圖顯示IL1B、IL1RN和GAPDH基因可以被有效擴(kuò)增，而熔解曲線圖顯示不同基因具有特異性熔解曲線，而且曲線峰值單一，提示前期設(shè)計(jì)的引物具有很好的敏感性和特異性。

2.2不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者CD14+單核細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平差異

相對(duì)于空白對(duì)照，結(jié)核菌裂解物能顯著刺激IL-1β分泌，其中肺陰虧虛組表達(dá)水平最高，顯著高于陰虛火旺組和氣陰兩虛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，其中陰虛火旺組IL-1β分泌水平又顯著高于氣陰兩虛組(P<0.05)。同時(shí)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)IL1B基因表達(dá)水平，與蛋白表達(dá)水平相一致，在肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組中IL1B基因表達(dá)水平依次降低，且組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

圖1　應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL1B、IL1RN基因表達(dá)

表2　不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者CD14+單核細(xì)胞IL-1β及其mRNA表達(dá)水平比較

注： 與空白對(duì)照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.01；與陰虛火旺組相比，cP<0.05。

2.3不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者CD14+單核細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)水平差異

在無(wú)結(jié)核菌刺激的條件下，IL-1Ra分泌水平在肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而結(jié)核菌刺激能夠顯著增加IL-1Ra分泌水平，其中氣陰兩虛組升高最為明顯，顯著高于肺陰虧虛組和陰虛火旺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而肺陰虧虛組和陰虛火旺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-1Ra的編碼基因?yàn)镮L1RN，在mRNA水平，氣陰兩虛組IL1RN表達(dá)水平顯著高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3　不同中醫(yī)證型肺結(jié)核患者CD14+單核細(xì)胞IL-1Ra及其mRNA表達(dá)水平比較

注： 與空白對(duì)照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.05；與陰虛火旺組相比，cP<0.01。

2.4肺結(jié)核患者中醫(yī)證型與CD14+單核細(xì)胞IL-1β/IL-1Ra比值的相關(guān)性

根據(jù)上述細(xì)胞上清IL-1β和IL-1Ra濃度進(jìn)一步計(jì)算IL-1β/IL-1Ra比值，如表4所示，與空白對(duì)照組比較，肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組IL-1β/IL-1Ra比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在結(jié)核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺陰虧虛和陰虛火旺中顯著增高，顯著高于氣陰兩虛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4　肺結(jié)核患者中醫(yī)證型與CD14+單核細(xì)胞上清中IL-1β/IL-1Ra比值的相關(guān)性

注： 與空白對(duì)照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.01；與陰虛火旺組相比，cP<0.05。

3　討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)“肺癆”的認(rèn)識(shí)歷史悠久，早在《內(nèi)經(jīng)·靈樞》就有記載“咳，脫形，身熱，脈小以疾”，詳細(xì)描述了肺癆的主癥和慢性消耗性特征。晉代《肘后備急方》首次創(chuàng)立“鬼注”“尸注”之名，并認(rèn)識(shí)到本病具有傳染性。宋代《三因極一病證方論》首次提出“癆瘵”之名，并與“虛勞”病證劃清界限?！镀諠?jì)本事方》記載“肺蟲(chóng)居肺葉之內(nèi)，蝕人肺體，故成瘥疾，咯血聲嘶”，認(rèn)為本病是由“肺蟲(chóng)”引起。《醫(yī)學(xué)正傳·勞極》確立了殺蟲(chóng)與補(bǔ)虛兩大治療原則。肺癆病位在肺，肺喜潤(rùn)惡燥，癆蟲(chóng)蝕肺，首耗肺陰，陰不制陽(yáng)，則現(xiàn)陰虛火旺之候，若陰傷及氣，或陰損及陽(yáng)，則可出現(xiàn)氣陰兩傷或陰陽(yáng)兩虛之候[7]。因此朱丹溪提出“癆瘵主乎陰虛”之說(shuō)，并倡導(dǎo)“滋陰降火”這一治則應(yīng)貫穿肺癆治療的始終。

多種微生物感染可以誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生，如《Nature》報(bào)道[8]白色念珠菌通過(guò)激活NLRP3炎癥小體而促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生并介導(dǎo)宿主抗真菌免疫應(yīng)答。Mishra等[9]發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌效應(yīng)分子ESAT-6同樣能夠被NLRP3炎癥小體識(shí)別并導(dǎo)致IL-1β分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL1B基因敲除小鼠在感染結(jié)核菌后表現(xiàn)出更高的死亡率和肺臟細(xì)菌載量[10]，提示IL-1β及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在結(jié)核保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用。IL-1Ra是一種有高度選擇性的競(jìng)爭(zhēng)性受體拮抗劑，它與受體結(jié)合但并不能激活受體，從而抑制IL-1β的多種生物學(xué)活性[4]。IL-1β/IL-1Ra比值可以作為評(píng)估機(jī)體抗結(jié)核免疫應(yīng)答的重要指標(biāo)。

在本研究中，結(jié)核菌刺激能夠顯著誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分泌IL-1β和IL-1Ra，而以肺陰虧虛患者IL-1β表達(dá)水平最高，隨著病機(jī)演變，陰虛火旺患者逐漸降低，至氣陰兩傷階段，其表達(dá)水平最低，提示IL-1β表達(dá)水平與病機(jī)演變密切相關(guān)，而且IL-1β作為機(jī)體抗結(jié)核感染免疫的重要指標(biāo)，也可以作為中醫(yī)正氣損傷的有效生物標(biāo)識(shí)。此外，研究發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛患者IL-Ra表達(dá)水平顯著升高，因此推測(cè)對(duì)于肺癆后期患者，IL-Ra升高競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL-1β介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致病情遷延難愈。IL-Ra不僅可以作為氣陰兩虛證型的微觀辨證標(biāo)簽，也有希望作為未來(lái)結(jié)核病治療的分子靶點(diǎn)。

總而言之，本研究證實(shí)在肺結(jié)核早期(肺陰虧虛型)，主要表現(xiàn)為高IL-1β、低IL-Ra表達(dá)；在疾病中期(陰虛火旺型)，IL-1β水平逐漸降低；而在疾病后期(氣陰兩虛型)，則呈現(xiàn)低IL-1β、高IL-Ra的臨床表型。以上結(jié)果提示在肺結(jié)核病機(jī)演變過(guò)程中，IL-1β介導(dǎo)的宿主保護(hù)性免疫逐漸弱化，而IL-Ra介導(dǎo)的病理性免疫逐漸增強(qiáng)。根據(jù)本研究結(jié)果，在未來(lái)結(jié)核病治療中，需要在中醫(yī)辨證施治的基礎(chǔ)上，適當(dāng)配伍合適的免疫調(diào)節(jié)劑，如黃芪多糖和黃芪皂苷已被證實(shí)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β[11]，這是未來(lái)研究的主要方向。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients

ZHANGGuo-liang，WANGLing-ling，ZHANSen-lin，etal.

InstituteofHepatology，ShenzhenThirdPeople’sHospital，Shenzhen518112，China.

ZHANGGuo-liang，E-mail：szdsyy@aliyun.com

ObjectiveTo explore the discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+ monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients. MethodsTotally 104 pulmonary tuberculosis patients were recruited，the patients were divided into Lung-Yin deficiency(n=33)，Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity(n=36)，and Qi and Yin deficiency(n=35). The density gradient centrifugation was used to separate PBMCs from peripheral blood，then CD14+ monocytes were purified after incubation with magnetic beads. Monocytes were stimulated with or without Mtb lysate for 12 hours，the supernatant was collected to detect IL-1β and IL-1Ra levels using ELISA，and total RNA was purified from cells and gene expression of IL1B and IL1RN was determined with real-time qPCR assay. Finally，the discrepancy was compared with ANOVA analysis. Results(1)The expression of IL1B and IL1RN could be detected by real-time quantitative PCR assay with gene specific primers. (2)After Mtb stimulation，IL-1β level was the highest in Lung-Yin deficiency group compared to Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P<0.05、P<0.01), and it was higher in Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group than that in Qi and Yin deficiency group(P<0.05). There was similar pattern observed in IL1B mRNA level, and IL1B level decreased in the order of Lung-Yin deficiency, Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity, and Qi and Yin deficiency(P<0.05、0.01). (3)IL-1 Ra expression increased significantly after Mtb stimulation, it was the highest in Qi and Yin deficiency group compared to other two groups(P<0.05), and there was no difference between Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P>0.05). Similar pattern was also observed in IL1RN level，which Qi and Yin deficiency group had the highest level(P<0.05,P<0.01). (4)After Mtb stimulation，IL-1β/IL-1Ra ratio increased in Lung-Yin deficiency and Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity groups，which was higher than that in Qi and Yin deficiency(P<0.01,P<0.05). ConclusionExpression of IL-1β and IL-1Ra was associated with TCM pathogenesis evolution of pulmonary TB patients，which could be considered as biomarkers of microcosmic syndrome differentiation and effectively therapeutic targets.

Pulmonary tuberculosis；TCM syndrome types；Interleukine-1β；Interleukine-1 receptor antagonist；Monocytes

國(guó)家自然科學(xué)基金(81501714)；廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313789)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140411111718166)

518112深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所(張國(guó)良、詹森林、汪文斐、聶廣)，結(jié)核病科(王玲玲、曹廷智、張紅梅、鄧群益)

張國(guó)良(1982- )，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：感染病中西醫(yī)結(jié)合診治研究。E-mail：szdsyy@aliyun.com

R249

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.003

2016-07-04)