六味地黃膠囊的質(zhì)量標準研究

萇玲+茅向軍

【摘要】目的：建立六味地黃膠囊中酒萸肉的薄層色譜鑒別及莫諾苷和馬錢苷的總量與丹皮酚含量的測定方法。方法：采用薄層色譜法對六味地黃膠囊中酒萸肉進行定性鑒別，采用高效液相色譜法同時測定方中酒萸肉里莫諾苷和馬錢苷的總量及牡丹皮中丹皮酚的含量；色譜柱為Thermo-C18（4.6×250mm，5μm），流動相：以乙腈為流動相A，以0.3%磷酸為流動相B，采用梯度洗脫，流速1mL/min，柱溫35℃，馬錢苷和莫諾苷的檢測波長為240nm，丹皮酚的檢測波長為270nm。結(jié)果：薄層色譜鑒別斑點清晰，陰性對照無干擾；莫諾苷在0.03508～1.0524μg范圍中線性關(guān)系良好，平均回收率為100.41%，RSD為1.21%（n=6）；馬錢苷在0.049342～1.480262μg范圍中線性關(guān)系良好，平均回收率為101.91%，RSD為1.37%（n=6）；丹皮酚在0.17046～5.1138μg范圍中線性關(guān)系良好。平均回收率為103.54%，RSD為0.92%（n=6）。結(jié)論：所建立的方法簡便、準確、重復(fù)性好，可用于六味地黃膠囊中酒萸肉的鑒別和酒萸肉里莫諾苷和馬錢苷的總量及牡丹皮中丹皮酚的含量測定。

【關(guān)鍵詞】 六味地黃膠囊；酒萸肉；莫諾苷；馬錢苷；丹皮酚

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）16-0029-04

Abstract：Objective to establish a method for the determination of Liuwei Dihuang capsule in Fructus Corni by TLC and morroniside and loganin total quantity and the content of paeonol. Methods the TLC method of Liuwei Dihuang capsule in Fructus Corni were identified， by high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of party in Fructus Corni in morroniside and loganin content and cortex moutan in paeonol content； column chromatography Thermo-C18 （4.6×250mm，5μ）， flow phase： with acetonitrile as mobile phase a， with 0.3% phosphoric acid as the mobile phase B， the gradient elution， flow rate of 1mL / min， column temperature 35 degrees Celsius， detection wavelength of loganin and morroniside was 240nm， paeonol detection wavelength 270nm. Results TLC spots were clear， without the interference of negative control； morroniside in 0.03508～1.0524 μg range linear relationship is good. The average recovery rate was 100.41%， RSD = 1.21% （n = 6）； loganin in 0.049342 ～1.480262 μg range linear relationship is good. The average recovery rate was 101.91%， RSD was 1.37% （n = 6）； paeonol in 0.17046～5.1138 μg range linear relationship good. the average recovery was 103.54%， RSD was 0.92% （n=6）. Conclusion the established method is simple， accurate and with good reproducibility and can be used for the determination of the content of morroniside and loganin total and tree peony bark of Paeonol in Liuweidihuang capsule liquor Cornus and the identification of Fructus Corni.

Keywords： Six Dihuang Capsules； Fructus Corni； Monod Glycosides； Loganin； Paeono

六味地黃膠囊收載于《中國藥典》2015年版一部，原標準有茯苓的顯微鑒別以及丹皮酚、山茱萸和熊果酸、澤瀉、茯苓的薄層色譜鑒別；含量測定采用薄層掃描法測定了酒萸肉中熊果酸的含量，采用HPLC法測定牡丹皮中丹皮酚的含量。2015 版《中國藥典》一部收載六味地黃的4種制劑，只有膠囊劑在含量測定中測定熊果酸，其余均為測定馬錢苷。酒萸肉藥材的定量指標為馬錢苷，其制劑則為熊果酸，而熊果酸含量在藥材檢測中沒有體現(xiàn)，難以保證制成膠囊后的含量一定符合規(guī)定，故將六味地黃膠囊山茱萸和熊果酸的薄層色譜鑒別改為酒萸肉中莫諾苷和馬錢苷的薄層色譜鑒別，含量測定更改為高效液相色譜法同時測定酒萸肉中莫諾苷和馬錢苷的總量及牡丹皮中丹皮酚的含量，使質(zhì)量標準更完善，檢驗方法更簡便。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695-2998高效液相色譜儀、配套自動進樣系統(tǒng)及配套工作站；超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；梅特勒XS205電子天平；梅特勒MS105DU電子天平。

1.2 材料 莫諾苷（批號：201304）、馬錢苷（批號：111640-201005）和丹皮酚（批號：110708-200506）購自中國藥品生物制品檢定所。薄層色譜硅膠G（青島海洋化工有限公司）。乙腈為Tedia Company色譜純、水為超純水，其他試劑為天津富宇精細化工有限公司的分析純。樣品由廠家提供，陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒萸肉的薄層色譜鑒別 取本品內(nèi)容物2g[規(guī)格（1）]或4g[規(guī)格（2）]，加甲醇50mL回流30min，放冷，濾過，蒸干，殘渣加水5mL使溶解，過D101大孔樹脂柱（3g，100目，直徑1.5cm），先用水洗脫至無色，棄去，再依次用10%和30%乙醇各50mL洗脫，合并，蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解，作為供試品溶液；取莫諾苷對照品和馬錢苷對照品分別加甲醇制成1mg/mL的對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各2-5μl，分別以條狀斑點點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點和熒光斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰，陰性無干擾。見圖1。

2.2 六味地黃膠囊的含量測定

2.2.1 對照品、供試品以及陰性對照溶液的制備 分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品適量，加甲醇制成每1mL含莫諾苷0.03mg，馬錢苷0.04mg、丹皮酚0.15mg的混合溶液，即得對照品溶液。取本品1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取自制陰性樣品按“2.2.1”項供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Thermo-C18（4.6×250mm，5μm）；以乙腈為流動相A，以0.3%磷酸為流動相B，按照表1梯度洗脫；柱溫：35℃；馬錢苷和莫諾苷的檢測波長為240nm，丹皮酚的檢測波長為270nm；理論塔板數(shù)按馬錢苷計算均應(yīng)不低于3000。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取對照品、供試品和陰性對照溶液各注入10μL液相色譜儀，按上述色譜條件測定，比較色譜圖。實驗結(jié)果表明供試品中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚峰與對照品色譜峰分別對應(yīng)一致，并且陰性無干擾。本法測定其含量專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好。見圖2。

2.2.4 線性關(guān)系考察 莫諾苷對照溶液：0.03508mg/mL，馬錢苷對照溶液：0.049342mg/mL，丹皮酚對照溶液：0.17046mg/mL，進樣體積為1μL，2μL，5μL，10μL，16μL，20μL，25μL，30μL。 按上述色譜條件測定對照品峰面積，以峰面積為縱坐標，莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的濃度為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程，莫諾苷：y=1661478.1729x-11844.7899，r=0.99997；馬錢苷：y=1544769.4643x-29732.7619，r=0.99992；丹皮酚：y=4594662.9994x+241386.0272，r=0.99984。結(jié)果表明莫諾苷在0.03508～1.0524μg范圍中線性關(guān)系良好；馬錢苷在0.049342～1.480262μg范圍中線性關(guān)系良好；丹皮酚在0.17046～5.1138μg范圍中線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液 10μL，連續(xù)進樣6次。結(jié)果顯示供試品溶液中莫諾苷峰面積的RSD為0.63%；馬錢苷峰面積的RSD為0.93%；丹皮酚峰面積的RSD為0.34%。表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一供試品（20140101，企業(yè)G），按供試品制備方法制備，按上述色譜條件測定莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，莫諾苷含量測定平均值為1.7174mg/g，RSD為0.74%；馬錢苷含量測定平均值為1.3944mg/g，RSD為1.65%；丹皮酚含量測定平均值為5.7767mg/g，RSD為1.04%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取供試品6份（供試品莫諾苷含量為1.7174mg/g、馬錢苷含量為1.3944mg/g、丹皮酚含量為5.7767mg/g），分別精密加入含0.0235mg/mL的莫諾苷對照、0.02599mg/mL的馬錢苷對照和0.05924mg/mL丹皮酚對照的混合溶液50mL，按供試品溶液制備方法處理，同法測定。結(jié)果表明本方法回收率較好。結(jié)果見表2、表3及表4。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（20140101，企業(yè)G），按供試品制備方法制備，按上述色譜條件測定莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，分別于0、2、4、6、8、10h進樣一次，莫諾苷峰面積RSD為0.53%，馬錢苷峰面積RSD為0.84%，丹皮酚峰面積RSD為0.46%。表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 樣品測定 根據(jù)上述條件，測定了規(guī)格（1）4批樣品，規(guī)格（2）18批樣品，結(jié)果見表5。

3 討論

對薄層鑒別方法樣品的前處理，曾采用甲醇回流提取后蒸干殘渣溶解直接點樣，但未取得較好的鑒別效果，最后采用甲醇回流提取后蒸干，殘渣加水溶解過d101大孔樹脂的方法制備樣品進行鑒別，結(jié)果表明，分離度好，Rf值達到要求，重現(xiàn)性好，陰性無干擾，經(jīng)多批次試驗，均能較好重現(xiàn)。

對提取方法采用加熱回流30min與超聲30min比較，結(jié)果表明回流方法優(yōu)于超聲方法。

對提取時間考察，分別加熱回流30min與1h，結(jié)果表明回流1h有效成分提取完全，故選擇回流1h。

分別對50%甲醇、甲醇、乙醇進行了比較。結(jié)果表明，甲醇和乙醇提取的供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上提取不到莫諾苷和馬錢苷的色譜峰或者峰形很差，50%甲醇的提取效果和提取率優(yōu)于其他溶劑。

分別對50%甲醇各25mL、50mL進行了試驗，結(jié)果表明50%的甲醇50mL提取得更加完全，故選擇50%的甲醇50mL。

檢測波長經(jīng)查閱資料，并對莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚進行光譜掃描后，定為莫諾苷和馬錢苷的檢測波長為240nm，丹皮酚的檢測波長為274nm。

本方法比較原有方法專屬性更強，采用雙波長，提取和檢驗都縮短了時間，提高了檢驗效率。本試驗在原標準的基礎(chǔ)上經(jīng)研究，將六味地黃膠囊山茱萸和熊果酸的薄層色譜鑒別改為酒萸肉中莫諾苷和馬錢苷的薄層色譜鑒別，含量測定更改為高效液相色譜法同時測定酒萸肉中莫諾苷和馬錢苷的總量及牡丹皮中丹皮酚的含量，專屬性更強，提高了檢驗效率，同時使質(zhì)控標準更趨完善，更有效控制了六味地黃膠囊的質(zhì)量。

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（編輯：陶希睿）