沉默人宮頸癌細(xì)胞Hela中FAL1的表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響*

石興源，余宏偉，黃文瑾，廖志偉，賈保昌，羅凱

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東廣州510095）

沉默人宮頸癌細(xì)胞Hela中FAL1的表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響*

石興源1，余宏偉1，黃文瑾1，廖志偉1，賈保昌1，羅凱2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東廣州510095）

目的探討沉默人宮頸癌細(xì)胞Hela中功能基因組趨化基因（FAL1）的表達(dá)對人宮頸癌細(xì)胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響。方法設(shè)計(jì)并合成FAL1的siR NA片段轉(zhuǎn)染Hele細(xì)胞分別命名為FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞組和FAL1-NC/Hela細(xì)胞組。比較兩組Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAL1-siR NA后的FAL1 mR NA相對表達(dá)量、光密度（OD）值、穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移距離的差異。結(jié)果FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞的FAL1 mR NA相對表達(dá)量（0.49± 0.21）低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞（1.34±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞在72、96和120h的OD值分別為（2.04±0.15）、（2.43±0.08）和（2.48±0.15），低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞的（2.36±0.18）、（3.11±0.27）和（3.44±0.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（126.18± 8.75）個(gè)低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞（208.54±6.75）個(gè)，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞在24、48和72h的細(xì)胞遷移距離為（6.34±1.48）、（11.65±2.52）和（15.08±3.19）μm低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞的（11.42± 2.73）、（19.56±4.33）和（27.71±5.12）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論FAL1-siR NA/Hela細(xì)胞的FAL1 mR NA相對表達(dá)量下降，進(jìn)而抑制Hela細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

宮頸癌；Hela細(xì)胞；功能基因組趨化基因siR NA；增殖；侵襲；遷移

R 737.33

A

宮頸癌是臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，雖然宮頸人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）篩查和細(xì)胞學(xué)篩查，如膜式液基檢測等可以提高宮頸癌的早期篩查成功率，但近年來我國宮頸癌的發(fā)病率仍然呈上升趨勢[1]。手術(shù)是治療宮頸癌的主要方式，廣泛全子宮切除術(shù)聯(lián)合盆腔或者髂總淋巴結(jié)清掃雖然可以提高患者術(shù)后的生存時(shí)間，但17.5%的宮頸癌患者術(shù)后半年內(nèi)復(fù)發(fā)，且臨床分期越晚，復(fù)發(fā)和局部轉(zhuǎn)移陽性率越高[2-3]。

腫瘤分子生物學(xué)研究表明，基因水平的編碼異?；蛘叻蔷幋a基因產(chǎn)物的調(diào)控失衡，往往可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲能力的增強(qiáng)[4]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）不僅承擔(dān)遺傳信息中間載體的輔助性角色，同時(shí)更多地承擔(dān)各種調(diào)控功能。相關(guān)研究表明，lncRNA在卵巢癌、肺癌及乳腺癌等惡性腫瘤的早期發(fā)生、發(fā)展中具有重要的介導(dǎo)作用[5-6]，但對于功能基因組趨化基因（functional genomic approach identifies，F(xiàn)AL1）標(biāo)志物的異常表達(dá)與宮頸癌的增殖和侵襲能力的改變研究不足。本研究通過基因敲除進(jìn)而沉默F(xiàn)AL1的表達(dá)，從而探討FAL1對宮頸癌細(xì)胞株Hela的影響，為臨床上控制宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源

Hela細(xì)胞購置于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞和FAL1-NC/Hela細(xì)胞由廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染、鑒定和保存。設(shè)計(jì)并合成FAL1的siRNA片段轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞分別命名為FAL1-siRNA/Hela細(xì)胞組和FAL1-NC/Hela細(xì)胞組。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法

Hela細(xì)胞用含10%血清的洛斯維帕克紀(jì)念研究所改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2～3 d更換培養(yǎng)基。將8μg待轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒、10μl Lipafectamine 2000脂質(zhì)體及無血清的DMEM混勻后于室溫下孵育20 min，均勻滴加于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6h后，更換完全培養(yǎng)基。

1.3FAL1 mRNA表達(dá)的檢測方法

取已消化的細(xì)胞懸浮液，10 000 r/min離心，每1 ml Trizol試劑裂解的樣品中加入0.2 ml氯仿，進(jìn)行裂解操作，采用無酶RNA沖洗液在4℃冰上進(jìn)行洗滌，10000r/min離心5min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶（cdna synthesis kit，CSK）前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60min，室溫放置5min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以肌動蛋白β為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green1染料、正向引物、反向引物、脫氧核糖核苷三磷酸，使總體積達(dá)20μl。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性2 min，93℃變性1min，55℃退火2min，共40個(gè)循環(huán)。SYBR Green和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.4Hela細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)方法

Hela細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/小室的濃度小心加入上室，保證上室的無血清培養(yǎng)基量為200μl，下室中加入含有血清的正常培養(yǎng)基500μl，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24h后，進(jìn)行細(xì)胞固定、染色。在100倍顯微鏡下每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野，照相、計(jì)數(shù)分析穿過小室的細(xì)胞數(shù)。

1.5細(xì)胞增殖檢測

Hela細(xì)胞生長至融合度為90%時(shí)，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化液消化細(xì)胞，加入適當(dāng)培養(yǎng)基，吹勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞最終密度為1×105個(gè)/ml，96孔板每孔加入100μl吹勻后的細(xì)胞，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后每孔加入10μl新型細(xì)胞增殖，用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司KGA317）檢測毒性溶液，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞增長率（%）=（OD值MVs-OD值空白）/OD值空白×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，F(xiàn)AL1 mRNA相對表達(dá)量、OD值、穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移距離，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAL1-siRNA后FAL1 mRNA相對表達(dá)量

FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，兩組FAL1 mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 8.430，P=0.000），F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞的FAL1 mRNA相對表達(dá)量（0.49±0.21）低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞（1.34±0.13）。

2.2FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞增殖的影響

FAL1-siRNA/Hela細(xì)胞和FAL1-NC/Hela細(xì)胞在48h內(nèi)的OD值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。FAL1-siRNA/Hela細(xì)胞在72、96和120 h的OD值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞72、96和120 h的OD值低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞。FAL1-siRNA/Hela細(xì)胞在48h后增殖速度明顯受到抑制。見表1。

表1　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞增殖的影響（%±s）

表1　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞增殖的影響（%±s）

組別24 h48 h72 h96 h120 h FAL1-NC/ Hela細(xì)胞0.94±0.11 1.73±0.25 2.36±0.18 3.11±0.27 3.44±0.26 FAL1-siRNA/ Hela細(xì)胞0.97±0.08 1.78±0.22 2.04±0.15 2.43±0.08 2.48±0.15 t值0.5400.3683.3455.9157.834 P值0.1740.2860.0070.0000.000

2.3FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞侵襲能力的影響

兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.255，P=0.000），F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（126.18±8.75）個(gè)低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞（208.54±6.75）個(gè)。FAL1-siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，沉默F(xiàn)AL1表達(dá)可抑制Hela細(xì)胞的侵襲能力。見圖1。

圖1　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色×100）

2.4FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞遷移距離的影響

兩組24、48和72 h的細(xì)胞遷移距離比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表2）。FAL1-siRNA組細(xì)胞遷移距離明顯縮短，沉默F(xiàn)AL1表達(dá)可抑制Hela細(xì)胞的遷移能力（見圖2）。

表2　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞遷移距離的影響（μm±s）

表2　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞遷移距離的影響（μm±s）

組別FAL1-NC/Hele細(xì)胞24h 11.42±2.73 48h 19.56±4.33 72h 27.71±5.12 FAL1-siRNA/Hele細(xì)胞6.34±1.4811.65±2.5215.08±3.19 t值4.0073.8675.128 P值0.0010.0030.000

圖2　FAL1-siRNA轉(zhuǎn)染后對Hela細(xì)胞遷移距離的影響（結(jié)晶紫染色×100）

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。近幾十年宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普遍應(yīng)用，使宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已明顯下降[7-11]。但臨床上對于宮頸的相關(guān)臨床特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)25%左右的早期宮頸癌（宮頸癌臨床分期為Ⅰb1~Ⅱa1）的患者，其子宮宮旁組織的浸潤率可達(dá)35%[12-15]，同時(shí)根治性手術(shù)患者術(shù)后盆腔后腹膜和直腸的轉(zhuǎn)移率可>15%，較高的臨床復(fù)發(fā)率和術(shù)后轉(zhuǎn)移率促進(jìn)宮頸癌患者術(shù)后病死率上升，同時(shí)可降低6～8個(gè)月的術(shù)后生存時(shí)間，預(yù)后較差[16-20]。現(xiàn)階段臨床上術(shù)后聯(lián)合放、化療已廣泛應(yīng)用于臨床，但其控制宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的整體效果并不理想，且副反應(yīng)較多，嚴(yán)重的并發(fā)癥已嚴(yán)重影響到患者的生存質(zhì)量。而腫瘤生物分子靶向治療可以通過對靶基因或者靶分子的沉默和清除，進(jìn)而抑制下游信號通路或者癌蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，控制宮頸癌殘留細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-23]。

腫瘤基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，使宮頸癌的研究又向前邁進(jìn)一步，其中l(wèi)ncRNAFAL1可以通過對于穩(wěn)定PCR1基因調(diào)節(jié)穩(wěn)定家族相關(guān)非編碼RNA的表達(dá)，促進(jìn)BMI1蛋白末端殘基的磷酸化，并影響轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相關(guān)增強(qiáng)子和啟動子，促進(jìn)瘤蛋白P21的表達(dá)，影響惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[14-26]。腫瘤侵襲能力的改變與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、E-cadherin、Vimemtin蛋白等的表達(dá)具有重要的關(guān)系，lncRNA FAL1可以抑制E-cadherin、Vimemtin的表達(dá)，降低細(xì)胞間的黏附作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，以及對于局部臨近組織或者器官的浸潤[27]。本研究的創(chuàng)新性在于首次探討lncRNAFAL1對于宮頸癌細(xì)胞株Hela生物學(xué)特性的影響，重點(diǎn)探討Hela細(xì)胞株增殖和侵襲能力的改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，在RNA干擾技術(shù)沉默lncRNAFAL1的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞株Hela的lncRNAFAL1表達(dá)下降，F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞的FAL1 mRNA相對表達(dá)量（0.49±0.21）低于FAL1-NC/Hela細(xì)胞（1.34± 0.13），提示基因轉(zhuǎn)染成功。在成功轉(zhuǎn)染后，觀察組細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力下降，轉(zhuǎn)染后48 h后OD值低于對照組，特別是轉(zhuǎn)染成功96和120 h后，觀察組細(xì)胞株Hela的增殖率與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明lncRNAFAL1對于維持Hela細(xì)胞的增殖具有重要作用。MENG[28]、鄭春花[29]、袁俐等[30]學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，lncRNAFAL1沉默后24h，即可發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞株擴(kuò)增能力改變，雖然OD值下降<5%，但隨后觀察48h后，OD值可持續(xù)下降20%～35%。本研究進(jìn)一步探討lncRNAFAL1對于宮頸癌細(xì)胞株侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，在沉默lncRNAFAL1基因后，Hela細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)僅為（126.18±8.75）個(gè)，相比于FAL1-siRNA組下降30%左右，表明低表達(dá)或者不表達(dá)FAL1基因的細(xì)胞株，其細(xì)胞侵襲能力較低。穿膜細(xì)胞數(shù)每下降50個(gè)，宮頸癌細(xì)胞侵襲和局部浸潤即可明顯改善。FAL1-siRNA/Hela的穿膜細(xì)胞株下降>70個(gè)，進(jìn)一步表明通過特異性地沉默F(xiàn)AL1基因可以為臨床上控制宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供新的思路。另外，F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞在24、48和72h的細(xì)胞遷移距離下降，其機(jī)制可能與FAL1沉默導(dǎo)致E-cadherin、Vimemtin蛋白高表達(dá)有關(guān)，但仍然需要進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，沉默F(xiàn)AL1基因后宮頸癌細(xì)胞株Hela的生物學(xué)特性明顯改變，F(xiàn)AL1-siRNA/Hela細(xì)胞的FAL1 mRNA相對表達(dá)量下降，可以抑制Hela細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。針對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子進(jìn)行干涉，可以實(shí)現(xiàn)控制宮頸癌術(shù)后腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。

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（童穎丹編輯）

Effect of silencingFAL1expression on proliferation，invasion and migration of human cervical carcinoma Hela cells*

Xing-yuan Shi1，Hong-wei Yu1，Wen-jin Huang1，Zhi-wei Liao1，Bao-chang Jia1，Kai Luo2
（1.The Affiliated Cancer Hospital，2.Cancer Institute，Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong 510095，China）

Objective To study the effects of silencingFAL1expression on the proliferation，invasion and migration of the human cervical carcinoma Helacells.MethodsSiRNAFAL1fragmentwasdesigned，synthesized and transfected into Hela cells，which were namedFAL1-siRNA/Hela cell group andFAL1-NC/ Hela cell group.The differences inFAL1mRNA relative expression，OD value，number of transmembrane cells and migration distance were compared between the two groups after transfection.Results The relative expression ofFAL1mRNA in theFAL1-siRNA/Hela cells（0.49±0.21）was significantly lower than that of FAL1-NC/Hela cells［（1.34±0.13），P＜0.05］.The OD value of theFAL1-siRNA/Hela cells in 72，96 and 120 h［（2.04±0.15），（2.43±0.08）and（2.48±0.15）respectively］was significantly lower than that of the FAL1-NC/Hela cells［（2.36±0.18），（3.11±0.27）and（3.44±0.26）respectively，P＜0.05］.The number of transmembrane cells in theFAL1-siRNA/Hela cells（126.18±8.75）was significantly smaller than that of the FAL1-NC/Hela cells［（208.54±6.75），P＜0.05］.The cell migration distance of theFAL1-siRNA/Hela cells in24，48 and 72 h［（6.34±1.48），（11.65±2.52）and（15.08±3.19）μm respectively］was significantly shorther than that of theFAL1-NC/Hela cells［（11.42±2.73），（19.56±4.33）and（27.71±5.12）μm respectively，P＜0.05］.Conclusions The relative expression ofFAL1mRNA in theFAL1-siRNA/Hela cells decreases，which inhibits proliferation，invasion and migration of Hela cells.

cervical carcinoma；Hela cell；FAL1-siRNA；proliferation；invasion；migration

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.007

1005-8982（2016）17-0034-05

2016-04-08

廣州醫(yī)科大學(xué)青年基金（No：2013A45）