高糖環(huán)境下mircoRNA-200b影響視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究*

蔣群，朱小華，劉建明，李兵

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南長(zhǎng)沙410011；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410013）

高糖環(huán)境下mircoRNA-200b影響視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究*

蔣群1，朱小華1，劉建明2，李兵2

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南長(zhǎng)沙410011；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410013）

目的探討高糖環(huán)境下microR NA-200b（miR-200b）影響人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（hR ECs）功能的作用機(jī)制。方法在正常和高糖環(huán)境下培養(yǎng)hR ECs，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)miR-200b表達(dá)。分別用miR-200b和特異性miR-200b抑制劑轉(zhuǎn)染hR ECs，并且用噻唑藍(lán)法檢測(cè)高糖環(huán)境下miR-200b對(duì)hR ECs增殖的影響。用Western blot測(cè)定hR ECs轉(zhuǎn)染miR-200b和miR-200b抑制劑后對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）蛋白和mR NA的表達(dá)的影響。結(jié)果高糖組VEGF、TGF-β1mR NA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加（P<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-200b后，hR ECs中miR-200b表達(dá)升高，而VEGF、TGF-β1mR NA和蛋白的表達(dá)降低。與高糖組比較，hR ECs增殖受到抑制（P<0.05）。結(jié)論miR-200b通過(guò)改變VEGF和TGF-β1的表達(dá)，調(diào)節(jié)hR ECs生長(zhǎng)和增殖，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致成人失明的主要原因[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，目前全世界有多達(dá)3.6億糖尿病患者，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)10億[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）與高糖環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損害密切相關(guān)[5]。DR可以影響視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其代謝和功能紊亂。視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)視網(wǎng)膜神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)需求。視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞維持血-視網(wǎng)膜屏障穩(wěn)定，并清除毒素和炎癥因子，其在保護(hù)視力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。microRNA（miRNA）是一種有調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA，廣泛存在在動(dòng)植物中[8]。miRNA可降解為mRNA并且通過(guò)與靶基因完全或不完全配對(duì)，或通過(guò)抑制下游靶蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯[9]。miRNA與癌癥發(fā)生有關(guān)[10-12]，與其他疾病的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。miR-200b是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的miR-200b表達(dá)明顯降低，并與糖尿病的發(fā)展密切相關(guān)。因此，miR-200b被認(rèn)為參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[13-14]。進(jìn)一步研究表明，miR-200b可能參與DR的發(fā)生、發(fā)展[15]。但miR-200b作用于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的具體功能和機(jī)制仍不清楚。高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（retinal endothelial cell，REC）直接或間接損傷，可導(dǎo)致視力障礙和DR的發(fā)生。同時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被證實(shí)參與DR病變的調(diào)節(jié)機(jī)制[16-17]。本研究目的是探討高糖狀態(tài)下miR-200b對(duì)REC的影響及其調(diào)節(jié)TGF-β1、VEGF的機(jī)制，分析miR-200b在DR中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells，hRECs）購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司，青霉素、鏈霉素和乙二胺四乙酸為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，Enzyme-乙二胺四乙酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒l(wèi)ipo2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑購(gòu)自瑞典Amersham biociences公司，兔抗人VEGF和TGF-β1抗體、標(biāo)記免疫球蛋白G二抗辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海Beyotime公司，DNA擴(kuò)增器和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，其他常見(jiàn)的試劑購(gòu)于上海生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1hR ECs培養(yǎng)和分組將hRECs接種在不含胎牛血清，含5.5 mmol/L葡萄糖的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）中，（含100 u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素），第8代細(xì)胞數(shù)達(dá)1×106個(gè)/cm2，將其隨機(jī)分為4組：①對(duì)照組：正常情況下細(xì)胞培養(yǎng)；②高糖組：在高糖環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，hRECs在33 mmol/L葡萄糖的微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基增殖；③轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染miR-200b的REC-5細(xì)胞在高糖條件下培養(yǎng)；④抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR-200b抑制劑的REC-5細(xì)胞在普通條件下培養(yǎng)。

1.2.2miR-200b及抑制劑轉(zhuǎn)染miR-200b及抑制劑由在上海吉瑪公司模擬合成。其序列分別為5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGAC-3'和5'-AU UAUGACGGACCAUUACUACUG-3'。在普通條件和高糖環(huán)境下，用轉(zhuǎn)染液lipo2000將miR-200b抑制劑和miR-200b轉(zhuǎn)染hRECs。hRECs在增殖期，接種于3×106個(gè)/cm2的6孔培養(yǎng)板，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，將混有miR-200b和抑制劑的lipo2000轉(zhuǎn)染液添加到細(xì)胞培養(yǎng)8h，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用Trizol從hRECs中提取mRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)。反應(yīng)條件為：52℃預(yù)變性60 s，90℃變性30s，58℃退火50s，72℃延伸35s，共35個(gè)循環(huán)。見(jiàn)附表。

附表PCR反應(yīng)相關(guān)引物

1.2.4MTT細(xì)胞接種于96孔板后，取5 g/L MTT溶液20μl添加至每孔，孵育4h。除上清液后，加入150μl DMSO，10 min后，采用紫外分光光度儀測(cè)570nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.5Western blot檢測(cè)從超聲處理的提取液中提取hRECs總蛋白。10000r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管，置于-20℃冰箱冷凍存放。蛋白質(zhì)由10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜膜，用5%脫脂奶封閉2h，與VEGF抗體（1∶1 000）或TGF-β1抗體（1∶2 000）在4℃共同孵育一整夜；用聚丁二酸-共-對(duì)苯二甲酸丁二醇酯漂洗后，膜被進(jìn)一步與羊抗兔二抗體（1∶2000）一起孵育30min，用化學(xué)發(fā)光劑顯像。IPP 6.0軟件分析Western blot條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1hRECs中miR-200b表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hRECs中miR-200b表達(dá)，結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）的擴(kuò)增曲線、熔解曲線穩(wěn)定，提示miR-200b的異物特異性好，能較好地檢測(cè)hRECs中miR-200b的表達(dá)。見(jiàn)圖1～2。

圖1　miR-200b的RT-PCR擴(kuò)增曲線圖

各組miR-200b表達(dá)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.511，P=0.000）。各組miR-200b表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，抑制劑組和高糖組中miR-200b表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.972，P=0.003），轉(zhuǎn)染組中miR-200b表達(dá)高于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.171，P=0.010）。見(jiàn)圖3。

圖3　miR-200b的表達(dá)

2.2miR-200b對(duì)hRECs細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)在高血糖環(huán)境下miR-200b對(duì)hRECs細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組hRECs增殖率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 7.286，P=0.011）。各組miR-200b表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，抑制劑組和高糖組中hRECs增殖率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.561，P=0.001），轉(zhuǎn)染組中hRECs增殖率低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.383，P=0.039）。表明miR-200b降低可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而增高能抑制靶細(xì)胞視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖4。

2.3miR-200b對(duì)hRECs內(nèi)VEGF和TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)在高血糖環(huán)境下miR-200b對(duì)hRECs中VEGF和TGF-β1mRNA的表達(dá)影響。各組hRECs的VEGF和TGF-β1mRNA表達(dá)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 13.801和8.72，P=0.003和0.007）。各組hRECs的VEGF和TGF-β1mRNA表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，抑制劑組和高糖組中hRECs的VEGF和TGF-β1mRNA表達(dá)高于對(duì)照組（t=4.733和6.551，P=0.000和0.001），轉(zhuǎn)染組中hRECs的VEGF和TGF-β1 mRNA表達(dá)低于高糖組（t=4.301和6.913，P=0.025和0.010）。見(jiàn)圖5。

圖4　miR-200b對(duì)hRECs增殖的比較

圖5　miR-200b對(duì)VEGF和TGF-β1mRNA影響的比較

2.4miR-200b對(duì)hRECs中VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Western blot測(cè)定hRECs轉(zhuǎn)染miR-200b后對(duì)VEGF和TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)的影響。各組hRECs的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.131和16.303，P=0.000和0.001）。各組hRECs的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，抑制劑組和高糖組hRECs的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.443和 4.121，P=0.021和0.015），轉(zhuǎn)染組中hRECs的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.113和7.214，P=0.023和0.001）。研究表明，高糖環(huán)境可以抑制hRECs中miR-200b，促進(jìn)VEGF、TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步引起視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂。轉(zhuǎn)染miR-200b后靶向細(xì)胞促進(jìn)其表達(dá)，并下調(diào)VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而改善糖尿病視網(wǎng)膜病變。見(jiàn)圖6～7。

圖6　miR-200b對(duì)hRECs中VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

圖7　miR-200b對(duì)hRECs中VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)影響

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管進(jìn)行性損傷。其嚴(yán)重影響患者的身心健康，給社會(huì)帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[18-19]。盡管醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，治療效果仍不滿意。高血糖環(huán)境可導(dǎo)致糖尿病患者視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生一系列內(nèi)分泌代謝變化。高血糖是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素，可引起器官結(jié)構(gòu)和功能紊亂[20-21]。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變是糖尿病慢性過(guò)程的主要病理機(jī)制。高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，包括通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞增殖和新生血管形成[22-23]。

miRNA參與各種生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化、代謝和激素分泌，以及維持胚胎干細(xì)胞的潛能。其能調(diào)節(jié)人體的生長(zhǎng)發(fā)育，使人體適應(yīng)環(huán)境。

目前，有關(guān)miRNA的大量研究主要集中在其對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和其他生物特征的作用上[9]，而有關(guān)miRNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用報(bào)道較少。

miR-200b參與調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[10]，但其在糖尿病視網(wǎng)膜病變研究中的作用尚未闡明。通過(guò)hRECs培養(yǎng)和高糖環(huán)境處理，本研究證實(shí)，在高糖狀態(tài)下hRECs中miR-200b水平下降，進(jìn)一步表明細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-200b抑制hRECs異常增殖。

VEGF有多種亞型，通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體發(fā)揮作用。大部分相應(yīng)受體位于內(nèi)皮細(xì)胞表面，VEGF特異性結(jié)合可改變血管通透性，促進(jìn)血管形成。因此，對(duì)于早期的糖尿病視網(wǎng)膜病變，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)調(diào)節(jié)改變血管通透性；晚期其參與糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成[24-25]。TGF-β1是一種多肽生長(zhǎng)因子，廣泛分布于眾多細(xì)胞中，具有多種生物學(xué)功能。其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，并參與免疫調(diào)節(jié)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。TGF-β1還是一種促細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子，能上調(diào)整聯(lián)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，趨化巨噬細(xì)胞促進(jìn)新生血管形成和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。其通過(guò)抑制抗體生成和淋巴細(xì)胞增殖，抑制CTL、NK、LAK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，發(fā)揮免疫抑制作用[26-27]。目前，有關(guān)TGF-β1在糖尿病視網(wǎng)膜病變中作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者重點(diǎn)研究miR-200b對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。經(jīng)證實(shí)，高糖環(huán)境下通過(guò)抑制miR-200b表達(dá)可促進(jìn)VEGF、TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變。通過(guò)上調(diào)miR-200b表達(dá)可以減少VEGF、TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，延緩DR的進(jìn)展。

綜上所述，通過(guò)miR-200b改變VEGF和TGF-β1表達(dá)，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，可以延緩DR的進(jìn)展。

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（童穎丹編輯）

Effect ofmicroRNA-200bon function of retinal endothelial cells under high-glucose environment and related mechanism*

Qun Jiang1，Xiao-hua Zhu1，Jian-ming Liu2，Bing Li2
（1.Department of Ophthalmology，the Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410011，China；2.The Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410013，China）

Objective To investigate the effect ofmicroRNA-200b（miR-200b）on human retinal endothelial cells（hRECs）under high-glucose environment and its mechanism.Methods hRECs were cultured under high-glucose or normal environment.Real time PCR was applied to detectmiR-200bexpression.miR-200b was transfected to hRECs and MTT was used to detect its effect on hRECs proliferation under high-glucose environment.Real time PCR and Western blot were performed to determine VEGF and TGF-β1 expressions in the retina endothelial cells.Results Compared with the normal control group，VEGF and TGF-β1 mRNA and protein expressions increased markedly in the high-glucose group（P＜0.05）.AftermiR-200btransfection，miR-200bexpression increased in the hRECs，while VEGF and TGF-β1 mRNA and protein expressions decreased obviously.Compared with the high-glucose group，hRECs proliferation was inhibited（P＜0.05）. ConclusionsmiR-200bcan regulate the growth and proliferation of RECs by changing VEGF and TGF-β1 expression and delay diabetic retinopathy.

diabetic retinopathy；retinal endothelial cell；VEGF；TGF-β1

R 774.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.005

1005-8982（2016）17-0023-06

2015-12-03

湖南省科技廳項(xiàng)目（No：2014TT2024、2012TT2029)

劉建明，E-mail：liujianming101@sina.com