攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學(xué)研究

李 軍， 鄒明祥， 王海晨， 胡詠梅， 豆清婭， 晏 群， 劉文恩

·論著·

攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學(xué)研究

李 軍， 鄒明祥， 王海晨， 胡詠梅， 豆清婭*， 晏 群， 劉文恩

目的 了解臨床分離碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌中blaNDM-1基因的分布，探討NDM-1陽性菌株的分子流行病學(xué)特征。方法 收集長(zhǎng)沙地區(qū)2011年1月—2012年8月臨床分離非重復(fù)碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)篩查blaNDM-1基因，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和BLAST軟件分析。對(duì)blaNDM-1基因陽性菌株，采用E試驗(yàn)法檢測(cè)其藥物敏感性、PCR法檢測(cè)β內(nèi)酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）及多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)進(jìn)行分子生物學(xué)分型。結(jié)果 共收集到687株碳青霉烯類不敏感的革蘭陰性桿菌，其中3株被證實(shí)為blaNDM-1基因陽性菌株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株編號(hào)CS11495和CS610）和1株陰溝腸桿菌（菌株編號(hào)CS30754）。該3株菌均來源于湘雅醫(yī)院。在測(cè)試的12種抗菌藥物中，除對(duì)阿米卡星和多黏菌素B敏感外，對(duì)其余抗菌藥物幾乎全耐藥。菌株CS11495同時(shí)檢出blaSHV-12、blaTEM-1、blaCTX-M-15和blaIMP-4，菌株CS610攜帶blaDHA、blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754中blaSHV-12和blaTEM-1基因陽性。其余基因均為陰性。2株肺炎克雷伯菌PFGE分型可分為A、B兩型。MLST顯示，菌株CS11495、CS610和CS30754分別屬于ST629、ST490及ST214，其中ST490為國內(nèi)首次報(bào)道。結(jié)論 blaNDM-1陽性菌株具有廣泛的耐藥譜，與其同時(shí)攜帶多種耐藥基因有關(guān)。盡管本地區(qū)不存在克隆傳播，但分布于同一醫(yī)院的不同科室，應(yīng)預(yù)防其播散。

革蘭陰性桿菌； blaNDM-1基因； β內(nèi)酰胺酶基因； 16S rRNA甲基化酶基因； 脈沖場(chǎng)凝膠電泳； 多位點(diǎn)序列分型

2009年，YONG等［1］在臨床分離的1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌中首次檢出blaNDM-1基因。該基因?qū)儆讦聝?nèi)酰胺酶基因Ambler分子分類中的B類，即金屬酶基因。由于攜帶該金屬酶基因的菌株對(duì)目前臨床常用抗菌藥物幾乎全耐藥而被稱作“超級(jí)細(xì)菌”。近期研究發(fā)現(xiàn)，該基因大多存在于接合性的質(zhì)粒上，可通過接合的方式在同種菌甚至不同種菌中傳播，嚴(yán)重威脅著人類的健康［2-3］。

本課題組前期在本院已檢出1株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌。為進(jìn)一步明確長(zhǎng)沙地區(qū)攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學(xué)特征，此次擬采用PCR法對(duì)收集的菌株進(jìn)行blaNDM-1基因篩查，并對(duì)陽性菌株檢測(cè)其他耐藥基因并作藥敏試驗(yàn)，同時(shí)采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)分型?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 687株非重復(fù)革蘭陰性桿菌來源于2011年1月—2012年8月長(zhǎng)沙地區(qū)6所綜合性醫(yī)院（湘雅醫(yī)院、湘雅三醫(yī)院、長(zhǎng)沙市第一人民醫(yī)院、長(zhǎng)沙市第三人民醫(yī)院、湖南省第二人民醫(yī)院和長(zhǎng)沙市第四人民醫(yī)院）的臨床分離菌株，

1.1.2 試劑和儀器 水解酪蛋白瓊脂、藥敏紙片和E試驗(yàn)紙條均購自英國OXOID公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購于Sangon公司；限制性內(nèi)切酶XbaI、蛋白酶K、SDS-TE緩沖液、TE緩沖液、TBE液均購自Promega公司；PFGE所用質(zhì)控菌株（沙門菌H9812）為中國CDC傳染病所呼吸道實(shí)驗(yàn)室所贈(zèng)。VITEK-2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）；凝膠成像儀為VL（ViberLourmat）系統(tǒng)；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為Bio Rad CHEF Mapper XA系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)收集到的革蘭陰性桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的敏感性。PCR法篩查亞胺培南和（或）美羅培南中介和（或）耐藥菌株中的blaNDM-1基因陽性的菌株，相關(guān)的操作參照文獻(xiàn)［4］。NDM-1陽性菌株藥敏試驗(yàn)除慶大霉素采用VITEK-2法檢測(cè)外，其余抗菌藥物包括氨曲南、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、阿米卡星、環(huán)丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦及多黏菌素B均采用E 試驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)。大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853作同步質(zhì)控。藥敏結(jié)果的判斷參照CLSI 2014 M100-S24標(biāo)準(zhǔn)［5］。多黏菌素B的結(jié)果判斷參照EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)（http：//www.eucast. org/），即MIC≤2 mg/L 為敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 對(duì)blaNDM-1基因陽性菌株采用PCR法檢測(cè)其他β內(nèi)酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA），引物參照文獻(xiàn)［6-7］，見表1。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、無菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s→退火（退火溫度見表1） 30 s→72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳100 V、40 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照分析。PCR陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用BLAST（www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST）比對(duì)分析。

1.2.3 PFGE 以沙門菌H9812作質(zhì)控菌株，主要通過菌落收集、凝膠包埋、溶菌酶與蛋白酶K消化、限制性內(nèi)切酶XbaI酶切、電泳、成像等步驟處理。電泳條件：0.5×TBE緩沖液、溫度12 ℃、電場(chǎng)夾角120°，電壓5.5 V/cm、脈沖時(shí)間0.5～12 s 16 h，20～30 s 7 h，30～70 s 2 h。電泳后，EB染色30 min，以GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)成像。PFGE結(jié)果解釋參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］。

1.2.4 MLST PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因（rpoB、 gapA、 mdh、 pgi、 phoE、infB、 tonB）， 引物序列及退火溫度均參照http：//bigsdb.web.pasteur. fr/klebsiella/primers_used.html；產(chǎn)物測(cè)序，將序列與數(shù)據(jù)庫中儲(chǔ)存的序列比對(duì)，確定其等位基因譜型及菌株序列型（ST型）。PCR擴(kuò)增陰溝腸桿菌的7個(gè)管家基因（dnaA、 fusA、 gyrB、 leuS、 pyrG、 rplB和rpoB），引物信息參照http：//pubmlst.org/ecloacae/ info/E_cloacae_primers.pdf；產(chǎn)物測(cè)序，將序列與數(shù)據(jù)庫中儲(chǔ)存的序列比對(duì)，確定其等位基因譜型及菌株序列型（ST型）。

表1 PCR反應(yīng)所用引物Table1 Primers used in PCR amplification of relevant genes

2 結(jié)果

2.1 菌種分布及碳青霉烯類耐藥模式

687株碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌主要為鮑曼不動(dòng)桿菌（551株，80.2 %），銅綠假單胞菌（111株，16.2 %），其余依次為大腸埃希菌（7株，1.0 %）、肺炎克雷伯菌（7株，1.0 %）、陰溝腸桿菌（5株，0.6 %）、惡臭假單胞菌（3株，0.4 %）、臭鼻克雷伯菌（1株，0.2 %）、弗勞地枸櫞酸桿菌（1株，0.2 %）和奇異變形桿菌（1株，0.2 %）。

根據(jù)革蘭陰性桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，687株碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌分為3種耐藥模式：亞胺培南耐藥、美羅培南耐藥為IRMR（682株，99.3 %），亞胺培南耐藥、美羅培南中介IRMI（4 株，0.6 %），亞胺培南耐藥、美羅培南敏感IRMS（1 株，0.2 %）。比例由高到低依次為IRMR、IRMI、IRMS。

2.2 blaNDM-1基因篩查

通過PCR篩查、擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序以及與GenBank上已報(bào)道的基因序列比對(duì)，最終證實(shí)為blaNDM-1基因陽性的菌株共有3株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株編號(hào)CS11495和CS610）和1株陰溝腸桿菌（菌株編號(hào)CS30754）。本研究并未在其他類型菌株中檢出blaNDM-1基因，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌以及大腸埃希菌等。該3株菌均分離自湘雅醫(yī)院，菌株CS610分離自脊柱外科，菌株CS11495為新生兒科，菌株CS30754來源于燒傷科。該3株菌的標(biāo)本來源為痰液和傷口分泌物，見表2。攜帶菌株CS11495的患者和菌株CS30754的患者均治療痊愈，攜帶菌株CS610的患者主動(dòng)放棄了治療。

表2 blaNDM-1陽性菌株的臨床流行病學(xué)和基因型特征Table2 Clinical epidemiological and genotypic characteristics of blaNDM-1positive isolates

2.3 blaNDM-1陽性菌株的藥敏結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示，3株blaNDM-1陽性的菌株對(duì)12種被檢測(cè)的抗菌藥物幾乎全耐藥。菌株CS11495和CS30754僅對(duì)阿米卡星和多黏菌素B敏感，對(duì)其余抗菌藥物均耐藥。菌株CS610除對(duì)阿米卡星和多黏菌素B敏感外，還對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感。見表3。

2.4 其他耐藥基因檢測(cè)

blaNDM-1基因陽性的菌株同時(shí)攜帶多種其他耐藥基因。菌株CS11495同時(shí)攜帶blaSHV-12，blaTEM-1，blaCTX-M-15和blaIMP-4，而菌株CS610攜帶blaDHA，blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754同時(shí)檢測(cè)出blaSHV-12和blaTEM-1基因。3株blaNDM-1基因陽性的菌株中，blaKPC基因和6種16S rRNA甲基化酶基因均為陰性，見表2。

2.5 PFGE

PFGE結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌CS11495及CS610為兩種不同的型別，A型和B型，見圖1和表2。

2.6 MLST

MLST顯示，2株肺炎克雷伯菌為2種ST型，菌株CS11495為ST629，菌株CS610為ST490。菌株CS30754型別為ST214，見表2。

表3 3株攜帶blaNDM-1基因菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性Table3 Susceptibility of three blaNDM-1positive strains to antimicrobial agents

圖1 2株肺炎克雷伯菌PFGE凝膠電泳圖Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of the two blaNDM-1-positive K. pneumoniae strains

3 討論

碳青霉烯類抗生素是治療革蘭陰性桿菌嚴(yán)重感染的最有效藥物之一。然而，近年來隨著該類抗生素在臨床上的廣泛使用，革蘭陰性桿菌對(duì)其敏感性逐漸下降。研究顯示產(chǎn)生金屬酶是導(dǎo)致其耐藥的重要機(jī)制。金屬酶基因包括blaVIM、blaIMP、blaSPM和blaNDM-1等，其中blaNDM-1基因?yàn)樾陆l(fā)現(xiàn)的金屬酶基因。自首株blaNDM-1基因陽性菌株在印度被報(bào)道以來［1］，世界上已有多個(gè)國家或地區(qū)有其檢出的報(bào)道［9-12］。國內(nèi)，2010年3月從寧夏一所醫(yī)院出生的2名新生兒的糞便中分離到2株攜帶blaNDM-1基因的屎腸球菌，為國內(nèi)首次報(bào)道blaNDM-1基因陽性的菌株［13］。隨后，在云南、河北等多個(gè)地區(qū)亦有檢出的報(bào)道［14-16］。

本課題組前期在本地區(qū)某醫(yī)院從1名新生兒患者的痰標(biāo)本中分離到1株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌［17］，并且該基因已注冊(cè)GenBank，登錄號(hào)為JQ757003，該株菌為中國分離的首株blaNDM-1陽性的肺炎克雷伯菌，說明本地區(qū)已存在blaNDM-1陽性的菌株。為明確本地區(qū)blaNDM-1基因陽性革蘭陰性桿菌的分子流行病學(xué)情況，本課題組對(duì)本地區(qū)6所醫(yī)院2011年1月—2012年8月臨床分離碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌中攜帶blaNDM-1基因菌株進(jìn)行了相關(guān)的研究。共檢出2株blaNDM-1陽性的肺炎克雷伯菌（菌株編號(hào)CS11495和CS610）和1株blaNDM-1陽性的陰溝腸桿菌（菌株編號(hào)CS30754）。其中菌株CS610分離自一頸椎外傷患者，該患者行頸椎后路椎管擴(kuò)大減壓枕頸融合術(shù)后第5天，出現(xiàn)間歇發(fā)熱，取傷口分泌物作培養(yǎng)，結(jié)果為肺炎克雷伯菌，根據(jù)藥敏結(jié)果采用左氧氟沙星治療，經(jīng)治療后患者癥狀有所緩解，因家庭原因放棄繼續(xù)留院治療，轉(zhuǎn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院救治。菌株CS30754分離自一全身硝火燒傷患者，經(jīng)過積極的抗感染治療患者痊愈出院。有研究顯示，去過印度旅游是獲得攜帶blaNDM-1基因菌株的高危因素之一。然而，本研究中的患者均無去過印度的經(jīng)歷，更無與blaNDM-1陽性菌株患者的接觸史，推測(cè)可能來源于周圍環(huán)境等。

藥敏結(jié)果顯示該3株菌除了對(duì)多黏菌素B和阿米卡星敏感外，對(duì)其余抗菌藥物幾乎全耐藥。之前的一些報(bào)道稱攜帶blaNDM-1基因的菌株除了對(duì)氨曲南以外的β內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，而本研究中的3株陽性菌株不僅對(duì)包括氨曲南在內(nèi)的所有β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，菌株CS30754還對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物（慶大霉素）和氟喹諾酮類抗菌藥物（環(huán)丙沙星）耐藥。推測(cè)可能同時(shí)存在其他耐藥機(jī)制。為此，本研究檢測(cè)其他β內(nèi)酰胺酶基因（包括blaDHA、 blaVIM、 blaIMP、 blaGIM、 blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1基因陽性的菌株同時(shí)攜帶多種其他β內(nèi)酰胺酶基因，如blaSHV-12、 blaTEM-1、 blaIMP-4、 blaCTX-M-15和blaDHA等。值得注意的是所有blaNDM-1基因陽性的菌株中blaKPC基因均為陰性，與目前國內(nèi)的報(bào)道一致［18］。然而，國外已經(jīng)出現(xiàn)了同時(shí)攜帶2種不同類型碳青霉烯酶基因的菌株，如blaNDM-1和blaKPC等［19］。同時(shí)，本研究還對(duì)16S rRNA甲基化酶基因包括armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD等進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16S rRNA甲基化酶基因均為陰性，說明16S rRNA甲基化酶并不是導(dǎo)致其對(duì)慶大霉素耐藥的機(jī)制。

近年來，blaNDM-1基因陽性菌株已在部分地區(qū)存在克隆傳播［20］。然而，本研究中2株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌PFGE分型屬于不同的型別，說明本地區(qū)暫不存在blaNDM-1基因陽性菌株的克隆傳播。MLST結(jié)果顯示，菌株CS11495屬于 ST629，與寧長(zhǎng)秀等［21］的報(bào)道一致，而菌株CS610屬于ST490，為國內(nèi)首次報(bào)道。2株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌分別屬于2個(gè)不同的ST型別，進(jìn)一步說明本地區(qū)blaNDM-1陽性菌株為散發(fā)形式存在。但值得注意的是，3株陽性菌株均源于同一所醫(yī)院的不同科室。因此，應(yīng)該采取相應(yīng)的措施預(yù)防和控制其進(jìn)一步播散及流行。

綜上所述，本研究共檢出3株blaNDM-1陽性菌株，說明本地區(qū)已存在該基因陽性的菌株。攜帶blaNDM-1基因的菌株具有廣泛的耐藥譜，與其同時(shí)攜帶多種耐藥基因有關(guān)。盡管本次研究中并未發(fā)現(xiàn)本地區(qū)blaNDM-1基因陽性菌株存在克隆流行，但陽性菌株分布在同一醫(yī)院的不同科室，應(yīng)引起臨床和醫(yī)院感控部門的高度重視。

［1］YONG D， TOLEMAN MA， GISKE CG， et al. Characterization of a new metallo-β-latamase gene， blaNDM-1， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2009，53（12）：5046-5054.

［2］JONES LS， TOLEMAN MA， WEEKS JL， et al. Plasmid carriage of blaNDM-1in clinical Acinetobacter baumannii isolates from India ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2014，58（7）：4211-4213.

［3］WANG X， CHEN G， WU X， et al. Increased prevalence of carbapenem resistant Enterobacteriaceae in hospital setting due to cross-species transmission of the blaNDM-1element and clonal spread of progenitor resistant strains ［J］. Front Microbiol， 2015，6：595.

［4］CHEN Y， ZHOU Z， JIANG Y， et al. Emergence of NDM-1-producing Acinetobacter baumannii in China ［J］. J Antimicrob Chemother， 2011，66（6）：1255-1259.

［5］Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance stands for antimicrobial susceptibility testing ［S］. Twenty-fourth information supplement，2014，M100-S24.

［6］朱健銘， 孫曉珍， 姜如金， 等. 肺炎克雷伯菌多藥耐藥株的耐藥機(jī)制研究［J］. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2010，20（7）：2549-2552.

［7］衣美英， 李杰， 王靖， 等. 耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制和同源性研究［J］. 中國感染與化療雜志， 2012，12（4）：297-301.

［8］TENOVER FC， ARBEIT RD， GOERING RV， et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing ［J］. J Clin Microbiol， 1995，33（9）：2233-2239.

［9］Centers for Disease Control and Prevention（ CDC）. Detection of Enterobacteriaceae isolates carrying metallo-beta-lactamase United States， 2010 ［J］. MMWR Morb Mortal Wkly Rep， 2010，59（24）：750.

［10］KUS JV， TADROS M， SIMOR A， et al. New Delhi metalloβ-lactamase-1： local acquisition in Ontario， Canada， and challenges in detection ［J］. CMAJ， 2011，183（11）：1257-1261.

［11］BIRGY A， DOIT C， MARIANI-KURKDJIAN P， et al. Early detection of colonization by VIM-1-producing Klebsiella pneumoniae and NDM-1-producing Escherichia coli in two children returning to France ［J］. J Clin Microbiol， 2011，49（8）：3085-3087.

［12］HO PL， LO WU， YEUNG MK， et al. Complete sequencing of pNDM-HK encoding NDM-1carbapenemase from a multidrugresistant Escherichia coli strain isolated in Hong Kong ［J］. PLoS One， 2011，6（3）：e17989.

［13］郝瓊， 劉翔， 郭邦成， 等. 寧夏腹瀉病人群攜帶NDM-1基因菌株的初步研究［J］. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志， 2012，34（4）：289-291.

［14］尹建雯， 徐聞， 古文鵬， 等. 云南省發(fā)現(xiàn)1株攜帶NDM-1基因的產(chǎn)酸克雷伯菌［J］. 疾病監(jiān)測(cè)， 2012，27（3）：211-213，217.

［15］賈肇一， 何寶花， 王穎童， 等. 河北省3株攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌基因及耐藥性檢測(cè)［J］. 中國公共衛(wèi)生， 2014，30（4）：524-527.

［16］朱水榮， 潘軍航， 魏蘭芬. 等. 浙江省首次發(fā)現(xiàn)ST20型NDM-1鮑曼不動(dòng)桿菌［J］. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2014，24（13）：1879-1883.

［17］鄒明祥， 鄔靖敏， 李軍， 等. 產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌中國分離株的初步研究［J］. 中國當(dāng)代兒科雜志， 2012，14（8）：616-621.

［18］張芳芳， 王曉麗， 瞿洪平， 等. 腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的主要類型和流行病學(xué)分析［J］. 中國感染與化療雜志， 2014，14（6）：521-525.

［19］PEREIRA PS， BORGHI M， ALBANO RM， et al. Coproduction of NDM-1 and KPC-2 in Enterobacter hormaechei from Brazil［J］. Microb Drug Resist， 2015，21（2）：234-236.

［20］ESPINAL P， FUGAZZA G， LóPEZ Y， et al. Dissemination of an NDM-2-producing Acinetobacter baumannii clone in an Israeli Rehabilitation Center ［J］. Antimicrobial Agents Chemother， 2011，55（11）：5396-5398.

［21］寧長(zhǎng)秀， 胡龍華， 汪紅， 等. 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌多位點(diǎn)序列分型研究［J］. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2015，31（1）：17-20.

Molecular characterization and prevalence of blaNDM-1metallo-β-lactamase gene in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli

LI Jun， ZOU Mingxiang， WANG Haichen， HU Yongmei， DOU Qingya， YAN Qun， LIU Wenen.
（Department of Laboratory Medicine， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410008， China）

Objective To investigate the molecular characterization and prevalence of blaNDM-1positive isolates in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli. Methods Carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected from January 2011 to August 2012 in Changsha area. The blaNDM-1gene was detected by PCR method. The positive products were sequenced and analyzed with BLAST. Then， antimicrobial susceptibility of blaNDM-1positive isolates were determined by E-test. Other β-lactamase genes and 16S rRNA methylase genes were identified by PCR method， including blaDHA， blaVIM， blaIMP， blaGIM， blaCTX-M， blaKPC， blaTEMand blaSHV. Finally， those blaNDM-1positive isolates were typed by pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） and multilocus sequence typing （MLST）. Results A total of 687 carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected. Three isolates were confirmed as blaNDM-1positive isolates， including two K. pneumoniae isolates and one E. cloacae. All the three strains were derivedfrom Xiangya Hospital. To the 12 antibiotics tested， those blaNDM-1positive isolates were susceptible to only amikacin and polymyxin B. One K. pneumoniae strain CS11495 was found carrying blaSHV-12， blaTEM-1， blaCTX-M-15and blaIMP-4， while the other strains harbored blaDHA， blaSHV-12and blaTEM-1. E. cloacae strain CS30754 was positive for blaSHV-12and blaTEM-1. The two K. pneumoniae isolates were grouped into two types（type A and B） by PFGE. MLST results showed that CS11495，CS610 and CS30754 strains belonged to ST629， ST490 and ST214， respectively. ST490 was reported for the first time in China. Conclusions The pan-drug resistance of blaNDM-1positive strains may be associated with the co-existence of multiple resistance genes. The blaNDM-1positive strain was identified in different departments of this hospital， although no clonal spread was found. Therefore， care should be taken to prevent the outbreak of this pathogen.

gram-negative bacillus； blaNDM-1gene； β-lactamase gene； 16S rRNA methylase gene； pulsed-field gel electrophoresis； multilocus sequence typing

R378

A

1009-7708（2016）04-0631-06

10.16718/j.1009-7708.2016.04.019

2015-10-22

2015-11-30

湖南省發(fā)改委（湘發(fā)改高技［2012］1493號(hào)；湘發(fā)改投資［2014］658號(hào)）；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ7003）。

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410008； *醫(yī)院感染控制中心。

李軍（1984—），男，碩士，檢驗(yàn)師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

鄒明祥， E-mail：zoumingxiang@126.com。