基于G—四聯(lián)體門控制效應(yīng)的鉛離子適配體傳感器

鄧歡 孫覓 魏小平 黎洪增 李建平

摘要將富鳥嘌呤（G）序列核酸適配體與門控制效應(yīng)相結(jié)合，通過控制門的開關(guān)實(shí)現(xiàn)信號放大，構(gòu)建了新型電化學(xué)生物傳感器，用于鉛離子（Pb2+）的高靈敏檢測。首先將單6巰基β環(huán)糊精（6SHβCD）自組裝在金電極上，形成有序排列的分子自組裝膜，且分子之間留有空隙，可作為探針通過的門結(jié)構(gòu)。隨后將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的富含G序列的核酸適配體修飾在環(huán)糊精次面端口，制得可特異性識別Pb2+的電化學(xué)生物傳感器。富G序列適配體結(jié)合Pb2+后可折疊形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)（G4Pb2+），覆蓋住電極表面的探針通道，產(chǎn)生關(guān)門效應(yīng)，使探針氧化還原電流強(qiáng)度減小，進(jìn)而形成門控制效應(yīng)，利用該效應(yīng)可進(jìn)行Pb2+的定量檢測。門控制效應(yīng)顯著提高了信噪比和檢測的靈敏度，在1×10

Symbolm@@ 13 ～ 5×10 Symbolm@@ 11 mol/L濃度范圍內(nèi)，Pb2+濃度的負(fù)對數(shù)與DPV響應(yīng)電流呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.6×10

Symbolm@@ 14 mol/L（DL=3δb/K）。傳感器用于實(shí)際水樣品中Pb2+的測定，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 電化學(xué)傳感器； 門控制； G四聯(lián)體； 二價鉛離子

1引言

Pb2+是一種在生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的穩(wěn)定、不可降解的污染物[1]，可在環(huán)境中長期積累，并對人體產(chǎn)生持續(xù)性影響。因此，檢測水環(huán)境中的Pb2+濃度顯得尤為重要[2]。近年來，發(fā)展了一些檢測Pb2+的方法，包括比色法[3]、熒光法[4]、原子吸收法[5]和伏安法[6]等。核酸適配體（Aptamer）是采用配體進(jìn)化指數(shù)富集方法（SELEX），從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選得到的一類能夠與靶分子特異性結(jié)合的人工合成的寡核苷酸序列，包括RNA、ssDNA 或dsDNA[7，8]。核酸適配體具有良好的穩(wěn)定性和選擇性[3]，一些適配子可以特異性識別金屬離子。Li等[9]利用具有脫氧核酶（DNAzyme）活性的核酸適配體，結(jié)合氧化石墨烯，建立了比色檢測Pb2+的方法。此外，研究者們利用Pb2+與發(fā)夾型富含鳥嘌呤（G）的核酸適配體結(jié)合，使其折疊形成G四聯(lián)體的強(qiáng)特異性配位作用，構(gòu)建了多種基于G4Pb2+結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器 [6，10～13]以及熒光傳感器[14]，然而這些傳感器產(chǎn)生信號的效率低，靈敏度不高。

門控制效應(yīng)[15] 通過利用待測物控制探針分子穿過修飾電極表面的空隙到達(dá)電極表面的數(shù)量，進(jìn)而間接測定待測物濃度。門控制效應(yīng)通過含量極低的待測物來控制門的閉合，從而引起高濃度探針氧化還原電流值的改變，可以提高信噪比，最終實(shí)現(xiàn)對檢測信號的放大。

β環(huán)糊精（βCD）是由7個葡萄糖單元首尾相連成環(huán)的大環(huán)類化合物，具有疏水性空腔結(jié)構(gòu)。本研究將門控制效應(yīng)和核酸適配體結(jié)合，制備基于G四聯(lián)體門控制效應(yīng)的新型Pb2+適配體傳感器。將巰基β環(huán)糊精自組裝在金電極表面時，βCD分子間形成可以使鐵氰化鉀探針通過的空隙[16， 17]，構(gòu)成了對探針氧化還原電流起控制作用的“門”。利用連接在βCD上的富G序列適配體特異性識別Pb2+離子并折疊生成G四聯(lián)體，覆蓋βCD分子間空隙并阻擋探針通過，形成門控制效應(yīng)，使探針在電極上的氧化還原電流減小，通過測定差分脈沖伏安電流響應(yīng)值實(shí)現(xiàn)了對Pb2+高靈敏的定量檢測。2實(shí)驗部分

2.1儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；ZHJHC2112B垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GSP7703磁力磁力攪拌器（蘇北分析儀器廠）。

核酸適配體G4序列（5′TCATGGGTGGGTGGGTGGGTGANH23′，上海生工生物工程股份有限公司）； 6巰基β環(huán)糊精（6SHβCD， 山東濱州智源生物科技有限公司）；對甲基苯磺酰氯（PTSC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；吡啶（C5H5N，廣東汕頭西隴化工廠）；氨基乙酸（C2H5NO2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； HCl、N羥基琥珀酰亞胺 （NHS）、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺（EDC）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、Pb（NO3）2等均為分析純；所用緩沖液為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）；實(shí)驗用水為超純水。

2.2核酸適配體溶液的配制

TrisHClEDTA（TE）緩沖溶液：配制1 mol/L TrisHCl緩沖液，取1 mL與0.2 mL的 0.5 mol/L ETDA溶液混合，用水定容至100 mL，得到TE緩沖液（pH 7.4）。

將TE緩沖液、玻璃棒、移液槍頭于120℃高溫高壓下滅菌20 min。冷卻后取出，同移液槍一起置于超凈工作臺上，于紫外燈下輻射30 min滅菌。將裝有適配體的離心管解凍，4800 r/min離心15 min。用移液槍移取適量的滅菌TE緩沖液，小心地注入離心管，搖勻，室溫下放置過夜使其完全溶解，于

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