動(dòng)脈球囊損傷后主動(dòng)脈組織中Atox1和Lox表達(dá)及纈沙坦對(duì)其影響

趙坤　侯勃　王茂敬　趙青　李培慧　蔡尚郎

[摘要]目的研究血管內(nèi)皮球囊損傷后銅伴侶蛋白1（Atox1）、賴氨酸氧化酶（Lox）的表達(dá)及纈沙坦對(duì)其影響，探討Atox1、Lox及纈沙坦在血管再狹窄中的作用。

方法Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組、手術(shù)組和藥物組，各12只。制備大鼠主動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄動(dòng)物模型，藥物組給予纈沙坦灌胃，對(duì)照組、手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，各組分別于術(shù)后14、28 d取6只大鼠腹主動(dòng)脈，檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜厚度，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)。

結(jié)果與對(duì)照組比較，手術(shù)組術(shù)后14、28 d主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜增厚，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)明顯上升；與手術(shù)組比較，藥物組術(shù)后14、28 d主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜增生減輕，Atox1、Lox mRNA及蛋白表達(dá)下降，差異有顯著性（F=25.73～34.16，P<0.05）。

結(jié)論Atox1、Lox參與大鼠主動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生過程；纈沙坦可抑制內(nèi)膜增生，其作用與下調(diào)Atox1、Lox的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮，血管；銅伴侶蛋白1；賴氨酸氧化酶；纈沙坦

[中圖分類號(hào)]R361.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02022504

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD）是目前常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率逐年增加，病死率較高，已經(jīng)成為威脅人類健康的首位疾病[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）已成為CHD治療的重要手段，但PCI術(shù)后再狹窄卻是一個(gè)尚未解決的難題，其半年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率高達(dá)40%。藥物洗脫支架的誕生雖明顯降低再狹窄率，但仍可達(dá)6.4%[23]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）遷移和增殖是PCI術(shù)后再狹窄的主要機(jī)制[4]，而血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）參與了此過程。AngⅡ主要通過血管緊張素1（AT1）型受體引起新生內(nèi)膜形成[5]。銅是維持人體正常生理功能的一種必不可少微量元素，其在創(chuàng)傷修復(fù)、血管再生等生理修復(fù)過程和腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)變性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過程中起重要作用[68]。研究證實(shí)銅水平影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成[9]，在血管損傷時(shí)增加銅的水平可加劇動(dòng)脈狹窄[10]。銅伴侶蛋白1（Atox1）是一種銅伴侶蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞、抵抗氧化的功能，并在細(xì)胞內(nèi)對(duì)銅轉(zhuǎn)移、儲(chǔ)存、

分布起重要作用[11]。研究表明，Atox1表達(dá)增加可引起VSMC的增殖和遷移[12]。賴氨酸氧化酶（Lox）是一種銅依賴性氨基氧化酶，能夠參與細(xì)胞外膠原和彈性纖維的賴氨酸殘基交聯(lián)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，并在VSMC遷移、細(xì)胞外基質(zhì)聚集等過程中發(fā)揮重要作用。已有研究顯示，Atox1和Lox參與球囊損傷術(shù)后再狹窄的過程[1314]，參與了AngⅡ引起的血管增生、重塑及細(xì)胞外基質(zhì)聚集等[1516]。纈沙坦是一種AngⅡ受體拮抗劑（ARB），其能夠抑制血管損傷后再狹窄的形成[1718]，但在血管損傷中使用纈沙坦對(duì)Atox1和Lox表達(dá)影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本文對(duì)Atox1、Lox及纈沙坦在血管再狹窄中的作用進(jìn)行探討。

1材料和方法

1.1動(dòng)物分組及處理

選取雄性Wistar大鼠36只（購(gòu)自青島市動(dòng)物中心），體質(zhì)量300～350 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、手術(shù)組和藥物組，各12只。手術(shù)組：用0.6 mol/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，沿頸前正中線切開皮膚，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，自頸外動(dòng)脈送入自制球囊至腹主動(dòng)脈，并且注入生理鹽水0.15～0.20 mL使球囊充分膨脹，慢速回拉球囊至主動(dòng)脈弓，反復(fù)3次；退出球囊，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，逐層縫合。術(shù)后常規(guī)用青霉素40萬(wàn)單位預(yù)防感染，常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)前1 d至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前給予生理鹽水3 mL灌胃。藥物組：手術(shù)操作同手術(shù)組，術(shù)前1 d至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)給予纈沙坦（北京諾華制藥有限公司）20 mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水3 mL灌胃。對(duì)照組：將球囊送至腹主動(dòng)脈緩慢回拉球囊至主動(dòng)脈弓，反復(fù)3次，不擴(kuò)張球囊，其余操作同手術(shù)組，術(shù)前1 d至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)給予生理鹽水3 mL灌胃。

1.2標(biāo)本制備及組織學(xué)檢查

選擇術(shù)后14、28 d為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，在相應(yīng)終點(diǎn)3組各處死6只大鼠，剪取腹主動(dòng)脈近主動(dòng)脈弓端5 mm動(dòng)脈血管，置于40 g/L甲醛中固定，制作石蠟包塊，行常規(guī)蘇木精伊紅（HE）染色和免疫組化檢查。其余血管段-80 ℃凍存。HE染色后光鏡下觀察VSMC移行、增殖及內(nèi)膜增厚情況并拍照。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血管組織中Atox1及Lox mRNA的表達(dá)

分別取各組血管標(biāo)本，充分剪碎研磨后加入Trizol試劑（美國(guó)，Invitrogen公司）1 mL裂解，在無(wú)RNA酶的環(huán)境中，Trizol法提取總RNA，紫外線分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，A260/A280為1.7～2.0，提示RNA純度較高。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RTPCR試劑盒檢測(cè)血管組織中Atox1、Lox mRNA表達(dá)水平。PCR引物及其序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（42 ℃、60 min，70 ℃、10 min），-20 ℃儲(chǔ)存。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40次。檢測(cè)得到循環(huán)閾值（Ct值），以βactin作為內(nèi)參校準(zhǔn)基因，用相對(duì)定量方法計(jì)算2-△△Ct，以其表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4免疫組化檢測(cè)Atox1蛋白表達(dá)

將腹主動(dòng)脈蠟塊切片，采用鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物法進(jìn)行Atox1免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒（美國(guó)Santan Gruz公司）說明書進(jìn)行操作。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察，Atox1表達(dá)于平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿，陽(yáng)性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核、細(xì)胞漿棕色。應(yīng)用Imageproplus Software 5.0圖像分析軟件，以累計(jì)光密度值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Lox蛋白表達(dá)

取凍存的血管片段35 mg，研磨、勻漿，3000 r/min離心20 min后提取上清液，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Lox水平，按試劑盒（武漢中美科技有限公司）說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料結(jié)果用[AKx-D]±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較用LSDt檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠主動(dòng)脈組織學(xué)比較

手術(shù)組14 d內(nèi)膜、中膜明顯增生，以內(nèi)膜為主，其中可見大量VSMC增殖，排列紊亂，內(nèi)彈力層較為迂曲；28 d增生更加明顯，其細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，但VSMC增殖已明顯減少。藥物組14 d和

28 d內(nèi)膜增生較手術(shù)組明顯減輕，增生及移行至內(nèi)膜的VSMC數(shù)量降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著減少。與對(duì)照組比較，手術(shù)組術(shù)后14、28 d主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜厚度增加；與手術(shù)組比較，藥物組主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜厚度降低，差異有顯著性（F=25.79～28.76，P<0.05）。見表1。

2.2各組Atox1、Lox mRNA表達(dá)水平比較

術(shù)后14、28 d，手術(shù)組Atox1、Lox mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，藥物組Atox1、Lox mRNA表達(dá)較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=27.13～34.16，P<0.05）。見表2。

2.3各組Atox1、Lox蛋白表達(dá)比較

術(shù)后14、28 d，手術(shù)組Atox1、Lox蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，藥物組Atox1、Lox蛋白表達(dá)較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=25.73～30.51，P<0.05）。見表2。

3討論

在CHD的治療史中，PCI的出現(xiàn)可謂里程碑事件，為CHD的治療帶來(lái)革命性的變化，但PCI術(shù)后再狹窄卻是一個(gè)尚未解決的難題。如本文實(shí)驗(yàn)所見，血管球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜及中膜明顯增生。再狹窄機(jī)制復(fù)雜，包括內(nèi)皮損傷、血栓形成、VSMC增殖遷移、細(xì)胞外基質(zhì)聚集及炎癥因子的激活等，其中VSMC遷移和增殖是PCI術(shù)后再狹窄的主要機(jī)制[3，1921]。VSMC在生理狀態(tài)下位于血管中膜，處于細(xì)胞周期的靜止期，主要通過收縮和舒張調(diào)節(jié)血管張力。當(dāng)血管損傷后，VSMC轉(zhuǎn)變表型進(jìn)入分裂周期，其從中膜遷移至內(nèi)膜，在內(nèi)膜分裂增殖，并合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)形成新生內(nèi)膜[22]。

AngⅡ是腎素血管緊張素系統(tǒng)中主要活性肽，其作用廣泛，當(dāng)血管受損時(shí)，AngⅡ表達(dá)明顯增加，其可通過AT1引起VSMC的增殖和遷移，促進(jìn)血管內(nèi)膜增生，引起血管再狹窄[2325]。銅是維持機(jī)體正常生理功能不可或缺的微量元素之一，銅與心血管疾病關(guān)系的研究由來(lái)已久[26]。Atox1是一種重要的銅伴侶蛋白，其內(nèi)含有一個(gè)獨(dú)特的序列——MXCXXC（其中M為甲硫氨酸，X為任意氨基酸，C代表半胱氨酸），能高效緊密地結(jié)合銅并將其轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)。Atox1與銅水平可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[27]，且能夠影響銅的分布。研究表明，Atox1參與平滑肌細(xì)胞的增殖[12]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Atox1參與平滑肌細(xì)胞的遷移和血管損傷后的重塑[14]。本文研究結(jié)果顯示，血管球囊損傷術(shù)后Atox1表達(dá)增加，提示其可能參與血管損傷術(shù)后再狹窄的過程。Lox是銅依賴的賴氨酸氧化酶，只有結(jié)合銅的Lox才具有較高的活性，其主要參與催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和纖維蛋白的賴氨酸殘基交聯(lián)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[28]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，降低Lox轉(zhuǎn)錄可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)活性，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加[2930]。Lox在VSMC增殖方面的作用仍有爭(zhēng)議，但其影響VSMC遷移已被肯定。本文研究結(jié)果顯示，血管球囊損傷后Lox的表達(dá)增加，提示其可能與血管球囊損傷術(shù)后再狹窄有關(guān)。纈沙坦是高選擇性ARB，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制AngⅡ的作用，抑制VSMC增殖、遷移，減少內(nèi)膜損傷后重塑。本文研究結(jié)果顯示，纈沙坦可減輕損傷后血管內(nèi)膜的增生，并且應(yīng)用纈沙坦后Atox1、Lox mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低，提示纈沙坦抑制血管內(nèi)膜增生可能與Atox1、Lox的表達(dá)變化有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)只是顯示了血管損傷術(shù)后Atox1、Lox表達(dá)增加的現(xiàn)象，卻沒有進(jìn)一步闡明其具體機(jī)制。需要進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究，以明確PCI術(shù)后再狹窄的機(jī)制及纈沙坦對(duì)其作用。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）