發(fā)酵后期補(bǔ)加2種氮源對(duì)克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影響

祃棟猛，陸信曜，陳文強(qiáng)，宗紅，諸葛斌*，宋健，戚夢(mèng)杰

1(江南大學(xué),糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)　2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)　3(陜西理工大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723001)　4(江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

?

發(fā)酵后期補(bǔ)加2種氮源對(duì)克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影響

祃棟猛1,2，陸信曜1,2，陳文強(qiáng)3，宗紅1,2，諸葛斌1,2*，宋健4，戚夢(mèng)杰1,2

1(江南大學(xué),糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)3(陜西理工大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723001)4(江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

為探尋解決重要平臺(tái)化合物1,3-丙二醇發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)和1,3-丙二醇合成受限的方法，通過(guò)從菌體量、產(chǎn)物和關(guān)鍵酶活性及基因轉(zhuǎn)錄水平等方面，較全面地考察了發(fā)酵后期補(bǔ)加酵母膏和硫酸銨對(duì)克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)合成1,3-丙二醇的影響，結(jié)果為：添加兩種氮源均有利于菌體生長(zhǎng)；補(bǔ)加10 g/L酵母膏和硫酸銨，1,3-丙二醇產(chǎn)量由58.6 g/L分別提高到70.6 g/L和77.2 g/L；相對(duì)于酵母膏，硫酸銨對(duì)關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng)更為明顯，并使甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase，DhaD)在發(fā)酵后期始終維持較高水平，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。此外，與補(bǔ)加酵母膏相比，補(bǔ)加硫酸銨后關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)并不顯著。表明硫酸銨主要通過(guò)直接激活關(guān)鍵酶活性促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。綜上所述，發(fā)酵后期補(bǔ)加硫酸銨更利于1,3-丙二醇的生物合成，是提高發(fā)酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。

1,3-丙二醇；氮源；克雷伯氏菌；補(bǔ)料-分批發(fā)酵

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)可作為新型聚酯纖維聚對(duì)苯二酸丙二醇酯(polytrimethylene-tereph-thalate，PTT)的單體，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。當(dāng)前1,3-PDO的生產(chǎn)以化學(xué)合成法為主，其生產(chǎn)成本高且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。而生物法生產(chǎn)流程簡(jiǎn)單且對(duì)環(huán)境友好，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

克雷伯氏菌屬是已有報(bào)道能夠高效轉(zhuǎn)化甘油合成1,3-PDO的自然菌屬之一[1]。為提高K.pneumoniae發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-PDO水平，季廣建等[2]研究得出采用混合碳源策略能夠激活K.pneumoniae的1,3-PDO合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)，提高1,3-PDO的產(chǎn)量，證實(shí)了混合碳源發(fā)酵策略的優(yōu)越性。ZENG等[3]研究指出,K.pneumoniae在分批補(bǔ)料發(fā)酵相比持續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵具有更高的產(chǎn)量。K.pneumoniae合成1,3-PDO為半生長(zhǎng)耦聯(lián)型[4]，因此分批補(bǔ)料下發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)是限制高產(chǎn)的重要原因。前述研究多集中在碳源補(bǔ)料策略，相比之下，發(fā)酵后期氮源濃度可能是菌體生長(zhǎng)代謝更為重要的限制因素。

為探尋解決1,3-PDO發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)和合成受限的方法，本研究對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中兩種常用氮源組分(硫酸銨與酵母膏)分別進(jìn)行補(bǔ)加，考察兩種氮源補(bǔ)加對(duì)生物量、1,3-PDO合成及關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平和活性的影響，旨在通過(guò)氮源優(yōu)化方式提高K.pneumoniae分批補(bǔ)料發(fā)酵1,3-PDO產(chǎn)量及探究其原因，并為生物法生產(chǎn)1,3-PDO打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

K.pneumoniaeZG25由本實(shí)驗(yàn)室保藏；1,3-PDO標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；Trizol總RNA提取試劑、HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒及Ultra SYBR Mixture均購(gòu)自康為世紀(jì)公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；發(fā)酵罐(BIOG-M 5L)，韓國(guó)BIOTRO公司；320-S pH計(jì)，METTLER TOLEDO；分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；生物傳感儀SBA-40B，山東省科學(xué)院；HPLC高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司；液相色譜柱，Aminex HPX-87H column；酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器公司；實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5。

5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 20，葡萄糖 6，酵母膏 8，KH2PO47.5，MgSO4·7H2O 2，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，VB120.015，微量元素溶液 0.1 mL/L，KOH調(diào)pH 8.5。

微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.7，MnCl2·4H2O 1，H3BO30.6，CoCl2·6H2O 2，CuCl20.2，NiCl2·6H2O 0.25，Na2MoO4·2H2O 0.35。

1.3培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)，接種量1%、37 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h。

分批補(bǔ)料發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐裝液量為2.5 L，接種量4%，初始甘油濃度20 g/L，37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量0.1 L/min。pH通過(guò)在線pH電極監(jiān)控，用10 mol/L的KOH調(diào)節(jié)控制pH維持在7，維持發(fā)酵過(guò)程甘油濃度范圍在10～40 g/L。

1.4分析方法

生物量的測(cè)定：采用分光光度計(jì)測(cè)量OD600值，細(xì)胞干重(DCW)根據(jù)吸光度與干重對(duì)應(yīng)關(guān)系， OD600=0.36 g/L。

代謝產(chǎn)物的測(cè)定：采用高效液相色譜法，發(fā)酵液中1,3-PDO、甘油、琥珀酸、乙酸、2,3-丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BDO)用Dionex高效液相色譜儀測(cè)定，色譜柱：Amines HPX-87H(Bio-Rad)有機(jī)酸離子交換柱；柱溫60 ℃；流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；檢測(cè)器：為紫外及示差折光檢測(cè)器；定量方法：外標(biāo)法。

粗酶液的提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]，酶活測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法[7]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)

RT-PCR方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]，內(nèi)參基因選用NCBI公布的K.pneumoniae的16S rRNA基因，根據(jù)NCBI公布的K.pneumoniae的甘油脫水酶基因(dhaB)、1,3-丙二醇氧化還原酶基因(dhaT)與甘油脫氫酶基因(dhaD)的基因序列設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1， 所有實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)均在Bio-Rad CFX96TMreal-time System中進(jìn)行。

表1　本研究所用RT-PCR引物

2　結(jié)果與討論

2.1不同濃度酵母膏和硫酸銨補(bǔ)加下生物量與1,3-PDO合成的比較

在穩(wěn)定發(fā)酵期(12 h后)分別補(bǔ)加5、10、20 g/L的酵母膏和硫酸銨，菌體生長(zhǎng)、1,3-PDO合成及發(fā)酵終產(chǎn)物情況如圖1所示。

分析可知，分別補(bǔ)加不同濃度的酵母膏與硫酸銨均能顯著提高發(fā)酵后期的生物量。由發(fā)酵終產(chǎn)物情況可知，補(bǔ)加5 g/L酵母膏與硫酸銨條件下，1,3-PDO產(chǎn)量均未見(jiàn)明顯提高，副產(chǎn)物略有增加。補(bǔ)加10 g/L酵母膏后，1,3-PDO產(chǎn)量達(dá)到70.6 g/L，提高17.3%，單位菌體產(chǎn)率為0.298 g/(g干菌體·h)，2,3-BDO增加43.6%；而補(bǔ)加10 g/L硫酸銨后，1,3-PDO產(chǎn)量達(dá)到77.2 g/L，提高29.9%，單位菌體產(chǎn)率為0.315 g/(g干菌體·h)，2,3-BDO增加45.2%，相比酵母膏，1,3-PDO產(chǎn)量及合成效率均進(jìn)一步提高。在補(bǔ)加20 g/L酵母膏或硫酸銨的情況下，1,3-PDO產(chǎn)量未見(jiàn)明顯提高，副產(chǎn)物略有增加。綜上表明，發(fā)酵后期補(bǔ)加硫酸銨或酵母膏均能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且在一定程度上提高1,3-PDO的合成。與此類(lèi)似，陶春平等[9]研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中后期補(bǔ)加適當(dāng)濃度的氨水有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。此外，本研究中添加不同種類(lèi)的氮源對(duì)發(fā)酵后期1,3-PDO合成的影響也存在一定差異，其中添加10 g/L酵母膏和硫酸銨更利于發(fā)酵后期1,3-PDO的積累。為揭示該現(xiàn)象的本質(zhì)原因，進(jìn)一步考察了補(bǔ)加不同氮源對(duì)甘油還原途徑與氧化途徑中關(guān)鍵酶活性和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。

圖1　補(bǔ)加不同濃度酵母膏與硫酸銨對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.1　Effects of different concentrations of yeast extract and ammonium nitrogen feeding on fed-batch fermentation

2.2補(bǔ)加10 g/L酵母膏或硫酸銨下代謝關(guān)鍵酶活性的變化

在K.pneumoniae發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PDO過(guò)程中，甘油還原途徑中甘油脫水酶(glycerol dehydratase，DhaB)催化甘油合成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)，1,3-丙二醇氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase，DhaT)則將3-HPA轉(zhuǎn)化為1,3-PDO；而DhaD則是甘油氧化途徑關(guān)鍵酶，該途徑為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量(ATP)、碳骨架和1,3-PDO的合成提供還原力(NADH)[10-11]。圖2結(jié)合圖3分析可知，與對(duì)照相比，添加酵母膏與硫酸銨后DhaB與DhaD活性均有所提高，DhaT峰值活性則分別提高了約76%與120%，有利于1,3-PDO的積累。

與酵母膏相比，添加硫酸銨對(duì)關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng)更明顯。其中，添加硫酸銨后DhaD在12 h后保持更高活性，提高了甘油氧化途徑通量，使得生物量在發(fā)酵中后期要高于酵母膏組；同時(shí)提供更多NADH，有利于1,3-PDO的合成。此外，添加硫酸銨組的DhaB和DhaT活性在25～50 h內(nèi)高于酵母膏組，使得該段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物積累速率高于酵母膏組。而在50 h后兩實(shí)驗(yàn)組的DhaB和DhaT酶活基本相似，但酵母膏組DhaD活性顯著上升，同時(shí)產(chǎn)物積累速率增加，表明發(fā)酵后期NADH的供給可能是產(chǎn)物合成的限制因素。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的乳酸脫氫酶活性無(wú)明顯區(qū)別，但酵母膏組的2,3-丁二醇脫氫酶

(2,3-butanediol dehydrogenase，BudC)活性略高。因此，添加硫酸銨組積累略多副產(chǎn)物的原因并非酶活差異，可能是因?yàn)楦视脱趸緩椒e累更多的NADH。綜上所述，添加硫酸銨對(duì)關(guān)鍵酶(特別是DhaD)具有更明顯的增強(qiáng)作用，從而積累較多1,3-PDO。

事實(shí)上，已有研究表明，NH4+對(duì)DhaD具有顯著的激活作用[12-14]。因此，本研究添加硫酸銨后，游離NH4+激活DhaD活性，強(qiáng)化了甘油氧化途徑，加速ATP和NADH再生。而ATP供應(yīng)的增加又有利于DhaB的復(fù)活[15-16]，使得1,3-PDO合成途徑得到強(qiáng)化，進(jìn)而提高了發(fā)酵后期產(chǎn)物的合成水平。

圖2　分別補(bǔ)加10 g/L酵母膏與10 g/L硫酸銨發(fā)酵還原途徑關(guān)鍵酶活性變化曲線Fig.2　Time curves of key enzymes activities of the reductive pathway in fed-batch fermentation through 10 g/L yeast extract and 10 g/L ammonium sulphate feeding, respectively

圖3　分別補(bǔ)加10 g/L酵母膏與10 g/L硫酸銨發(fā)酵氧化途徑關(guān)鍵酶活性變化曲線Fig.3　Time curves of key enzymes activities of the oxidative pathway in fed-batch fermentation through 10 g/L yeast extract and 10 g/L ammonium sulphate feeding, respectively

2.3補(bǔ)加10 g/L酵母膏或硫酸銨對(duì)1,3-PDO合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平影響

為從轉(zhuǎn)錄水平探明硫酸銨對(duì)1,3-PDO合成關(guān)鍵酶的影響，以添加10 g/L酵母膏組為對(duì)照，添加10 g/L硫酸銨為實(shí)驗(yàn)組，利用qRT-PCR考察補(bǔ)料前后不同時(shí)間1,3-PDO合成關(guān)鍵酶基因(dhaB、dhaT與dhaD)相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的變化。如圖4，相對(duì)于添加酵母膏，添加硫酸銨并未顯著影響dhaB在發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄，雖然32 h時(shí)dhaT與dhaD相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度值有顯著變化(P< 0.05)，但實(shí)際相對(duì)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)僅有25%左右，而DhaT與DhaD的酶活此時(shí)相對(duì)于酵母膏組均提高近2倍，進(jìn)一步表明硫酸銨主要是通過(guò)直接激活關(guān)鍵酶的活性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。

圖4　補(bǔ)加硫酸銨對(duì)K. pneumoniae ZG25中dhaB、dhaT與dhaD相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的影響Fig.4　Effects on relative gene transcription intensity of dhaB, dhaT and dhaD in K. pneumoniae ZG25 through 10 g/L ammonium sulphate feeding注：相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度計(jì)算采用2-ΔΔCt法，圖中相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度為添加硫酸銨相對(duì)于添加酵母膏的計(jì)算值

3　結(jié)論

針對(duì)K.pneumoniaeZG25發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO過(guò)程中生物量水平低且過(guò)早進(jìn)入衰退期限制1,3-PDO合成的問(wèn)題，本研究通過(guò)比較分析發(fā)酵后期補(bǔ)加酵母膏與硫酸銨對(duì)K.pneumoniaeZG25產(chǎn)1,3-PDO的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加硫酸銨對(duì)生物量水平和1,3-PDO合成產(chǎn)量的提高更為顯著。酶活與轉(zhuǎn)錄水平研究表明，硫酸銨通過(guò)直接激活1,3-PDO合成關(guān)鍵酶(特別是DhaD)活性而非調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平的方式提高1,3-PDO產(chǎn)量。綜上所述，發(fā)酵后期補(bǔ)加硫酸銨有利于1,3-PDO的生物合成，是提高發(fā)酵合成1,3-PDO水平的有效方式之一。

[1]ZENG A P,BIEBL H．Bulk chemicals from biotechnology:the case of 1,3-propanediol production and the new trends[M]．Berlin:Springer Verlag,2002:239-259．

[2]季廣建,陸信曜,諸葛斌,等．碳源對(duì)克氏菌合成PTT原料PDO的影響及對(duì)DhaB的表達(dá)調(diào)控[J]．紡織學(xué)報(bào),2014,35(8):144-149．

[3]ZENG A P,BIEBL H,SCHLIEKER H,et al．Pathway analysis of glycerol fermentation byKlebsiellapneumoniae:regulation of reducing equivalent balance and product formation[J]．Enzyme and Microbial Technology,1993,15(9):770-779．

[4]XIU Zhi-long,CHEN Xi,SUN Ya-qin,et al．Stoichiometric analysis and experimental investigation of glycerol-glucose co-fermentation inKlebsiellapneumoniaeunder microaerobic conditions[J]．Biochemical Engineering Journal,2007,33(1):42-52．

[5]黃志華,張延平,劉銘,等．甲酸脫氫酶在Klebsiellapneumoniae中的表達(dá)和功能分析[J]．微生物學(xué)報(bào),2007,47(1):64-68．

[6]ZHENG Zong-ming,XU Yun-zhen,LIU Hong-juan,et al．Physiologic mechanisms of sequential products synthesis in 1,3-propanediol fed-batch fermentation byKlebsiellapneumoniae[J]．Biotechnology and Bioengineering,2008,100(5):923-932．

[7]BRADFORD M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]．Analytical Biochemistry,1976,72(1):248-254．

[8]CHOQUER M,BOCCARA M,VIDAL-CROS A．A semi-quantitative RT-PCR method to readily compare expression levels withinBotrytiscinereamultigenic familiesinvitroand in planta[J]．Current Genetics,2003,43(4):303-309．

[9]陶春平,劉朋波,夏敏,等．控制氮源濃度提高1,3-丙二醇的發(fā)酵水平[J]．化學(xué)與生物工程,2007,24(5):38-41．

[10]BIEBL H,MENZEL K,ZENG A P,et al．Microbial production of 1,3-propanediol[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,1999,52(3):289-297．

[11]PETROV K,PETROVA P．High production of 2,3-butanediol from glycerol byKlebsiellapneumoniaG31[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,2009,84(4):659-665．

[12]陳宏文,聶金峰,陳國(guó),等．克雷伯桿菌甘油脫氫酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的動(dòng)力學(xué)機(jī)制[J]．生物工程學(xué)報(bào),2010,26(2):177-182．

[13]LIN E C C,MAGASANIK B．The activation of glycerol dehydrogenase fromAerobacteraerogenesby monovalent cations[J]．The Journal of Biological Chemistry,1960,235(6):1 820-1 823．

[14]陳宏文,吳雅紅,吳振華,等．克雷伯桿菌甘油脫氫酶的分離純化及性質(zhì)[J]．無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2005,24(1):1-6．

[15]KAJIUR H,MORI K,TOBIMATSU T,et al．Characterization and mechanism of action of a reactivating factor for adenosylcabalarnin-dependent glycerol dehydratase[J]．The Journal of Biological Chemistry,2001,276(39):36 514-36 519．

[16]張延平,饒治,杜晨宇,等．能量驅(qū)動(dòng)對(duì)Klebsiellapneumoniae發(fā)酵甘油合成1,3-丙二醇的影響[J]．過(guò)程工程學(xué)報(bào),2004,6(4):567-572．

Influences on the biosynthesis of 1,3-propanediol inKlebsiellapneumoniaby feeding two types of nitrogen source at the late stage of fermentation

MA Dong-meng1,2, LU Xin-yao1,2, CHEN Wen-qiang3, ZONG Hong1,2,ZHU Ge-bin1,2*, SONG Jian4, QI Meng-jie1,2

1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, School of Biotechnology,Research Centre of Industrial Microbiology, Wuxi 214122, China)3(School of Biological Science and Engineering, Shaanxi SCI-TECH University,Hanzhong 723001,China)4(School of Chemistry and Material, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

1,3-Propanediol (1,3-PDO) is an important platform compound. In order to solve the restriction of cell growth and 1,3-PDO production at the late stage of fermentation, feeding of two types of nitrogen source (yeast extract and ammonium sulphate) at the late stage of fermentation was studied. Biomass, products, genes transcription level and activities of key enzymes were studied. The results showed that both yeast extract and ammonium sulphate feeding improved the cell growth, and the 1,3-PDO titers were increased from 58.6 g/L to 70.6 g/L and 77.2 g/L, respectively. In comparison with yeast extract, the feeding of ammonium sulphate further improved activities of key enzymes involved in 1,3-PDO synthesis, and maintained glycerol dehydrogenase (DhaD) at a higher level at the late stage of fermentation. However, the transcription levels of the key genes of the cells incubated with the feeding of different nitrogen source were similar. All above information proved that ammonium sulphate improved the cell growth and product yield by activation of enzymes activities but did not affect their genes transcription. These results suggested that the addition of ammonium sulphate at the late stage of fermentation would be an effective way to improve the biosynthesis of 1,3-PDO.

1,3-propanediol; nitrogen source;Klebsiellapneumoniae; fed-batch fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608002

碩士研究生(諸葛斌教授為通訊作者，E-mail：Bzhuge@163.com)。

2015-12-24,改回日期：2016-03-23