土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的反硝化細(xì)菌法測(cè)定

徐春英，李玉中，李巧珍，毛麗麗，林　偉，強(qiáng)曉晶，鄭　欠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)部旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的反硝化細(xì)菌法測(cè)定

徐春英，李玉中*，李巧珍，毛麗麗，林偉，強(qiáng)曉晶，鄭欠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)部旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

本研究?jī)?yōu)化了采用反硝化細(xì)菌法同時(shí)測(cè)定土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的方法。在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用5000～8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心、高純氮?dú)獯祾? h、減少加樣量及改造儀器自動(dòng)進(jìn)樣器等措施對(duì)已發(fā)表方法進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品USGS34的分析表明，0.1～0.8 μg-N樣品量即可以得到較穩(wěn)定、準(zhǔn)確的測(cè)定值和校正值；同一時(shí)間內(nèi)制備的硝酸鹽δ15N的SD介于0.05‰～0.09‰之間，δ18O的SD介于0.28‰～0.48‰之間；在三個(gè)月之內(nèi)δ15N和δ18O的測(cè)定值基本一致，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性。通過(guò)研究浸提劑、保存條件以及加熱對(duì)測(cè)定土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的影響，結(jié)果表明：常用的去離子水、KCl、CaCl2可能都含有微量的硝酸鹽，隨著加樣量增大，浸提劑中含有的硝酸鹽可能就會(huì)影響δ15N和δ18O的測(cè)定；對(duì)于土壤硝酸鹽的浸提液，冷凍保存效果較好，保證了土壤硝酸鹽氮氧同位素的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；盡管加熱對(duì)硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品USGS34和IAEA-NO3的δ15N沒(méi)有顯著影響，但δ18O顯著升高，說(shuō)明加熱易引起氧同位素分餾；而土壤硝酸鹽浸提液樣品加熱前后的δ15N和δ18O的測(cè)定值沒(méi)有顯著變化，因此為避免產(chǎn)生氧同位素分餾和節(jié)省測(cè)試時(shí)間，建議同時(shí)測(cè)定土壤浸提液硝酸鹽δ15N 和δ18O時(shí)直接和反硝化細(xì)菌反應(yīng)。應(yīng)用本方法對(duì)不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素組成進(jìn)行了測(cè)定。

反硝化細(xì)菌法；土壤浸提液；硝酸鹽；氮氧同位素組成

徐春英，李玉中，李巧珍，等.土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的反硝化細(xì)菌法測(cè)定［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（9）：1829-1836.

XU Chun-ying，LI Yu-zhong，LI Qiao-zhen，et al.Determination of15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method［J］. Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1829-1836.

我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在氮肥過(guò)量施用現(xiàn)象，這不僅造成氮肥利用率低，經(jīng)濟(jì)效益下降，而且長(zhǎng)期過(guò)量施用氮肥會(huì)造成土壤氮素嚴(yán)重冗余［1-3］。土壤氮素形成的硝態(tài)氮極易通過(guò)淋溶作用進(jìn)入水體，造成地表水富營(yíng)養(yǎng)化、地下水的硝酸鹽含量超標(biāo)［4-8］及溫室氣體N2O排放［9］等問(wèn)題。硝態(tài)氮是土壤氮循環(huán)及遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程的中心形態(tài)，已有研究表明硝態(tài)氮中的氮、氧同位素組成是識(shí)別其來(lái)源和主要氮循環(huán)過(guò)程的有用工具［10-11］。

國(guó)內(nèi)硝酸鹽氮氧同位素組成的同時(shí)分析主要前處理方法為離子交換樹(shù)脂法和反硝化細(xì)菌法。盡管離子交換樹(shù)脂法是收集和富集的一個(gè)重要發(fā)展［12］，但是運(yùn)用該方法分析硝酸鹽氮氧同位素組成需要將樣品富集、洗脫、中和過(guò)量的Cl-、冷凍干燥等，操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；另外，需要用到離子交換樹(shù)脂、濾膜、Ag2O等耗材和試劑，前處理的費(fèi)用很高，這也成為該方法使用的一個(gè)限制因子［13］。反硝化細(xì)菌法是近幾年硝酸鹽氮氧同位素測(cè)試技術(shù)的重要進(jìn)展，最早由美國(guó)普林斯頓大學(xué)的Sigman等［14］提出用于海水和淡水的硝酸鹽氮同位素自然豐度測(cè)定。該方法由自然存在的缺乏N2O還原酶的反硝化細(xì)菌將水中轉(zhuǎn)化為N2O，再由質(zhì)譜儀測(cè)定N2O氣體的氮氧同位素組成，從而得到硝酸鹽的氮氧同位素組成［14-15］。與離子交換樹(shù)脂法相比，反硝化細(xì)菌法具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）所需樣品量低，該方法可同時(shí)分析濃度低至μg·L-1的硝酸鹽氮氧同位素組成，同時(shí)也由于降低了樣品量而降低了樣品的空白，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確；（2）可在常溫常壓下進(jìn)行，不受有機(jī)氮及其他離子的影響；（3）樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，并且氮氧同位素可同時(shí)分析，分析時(shí)間明顯縮短，測(cè)試成本也極大降低。反硝化細(xì)菌法的諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為目前國(guó)際上先進(jìn)的硝酸鹽氮氧同位素組成測(cè)試技術(shù)［16-18］。

國(guó)外研究者已經(jīng)應(yīng)用反硝化細(xì)菌法對(duì)土壤浸提液的硝酸鹽氮氧同位素進(jìn)行測(cè)定［19-21］，并用于土壤硝酸鹽溯源與氮轉(zhuǎn)化過(guò)程研究［21］；相比而言，國(guó)內(nèi)土壤中硝態(tài)氮氮氧同位素自然豐度運(yùn)用較少，尤其是氧同位素應(yīng)用更少，其主要原因是缺乏合適有效的分析方法。盡管?chē)?guó)內(nèi)已經(jīng)報(bào)道了反硝化細(xì)菌法測(cè)定水體硝酸鹽氮氧同位素方法［22-24］，但是用于土壤浸提液硝酸鹽氮氧同位素分析的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本文在前期研究結(jié)果［23］的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些技術(shù)改進(jìn)，使反硝化細(xì)菌法不但可以用于水體硝酸鹽氮氧同位素的同時(shí)測(cè)定，而且適于土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素的同時(shí)測(cè)定。該方法的完善，有助于促進(jìn)該方法在國(guó)內(nèi)的推廣和應(yīng)用，從而加強(qiáng)土壤氮循環(huán)和遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究。

1　材料與方法

1.1儀器

同位素比質(zhì)譜儀Deltaplus（Thermo-Finnigan，美國(guó)），連接有PreCon痕量氣體預(yù)濃縮裝置（Thermo，美國(guó)），CTC-Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器（瑞士CTC Analytics AG），高速離心機(jī)（HITACHI，himac CR21G，High-Speed Refrigerated Centrifuge，日本HITACHI公司），氮?dú)獯祾邇x（美國(guó)Organomation公司），高壓滅菌鍋（日本SANYO公司），流動(dòng)注射分析儀（Lachant QC8000，美國(guó)Lachant公司）。

1.2試劑

胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（美國(guó)BD公司），試劑（NH4）2SO4、K3PO4、KCl、KNO3（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CaCl2（分析純，西隴化工股份有限公司）、H3PO4（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磺胺（美國(guó)Sigma公司），N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），國(guó)際同位素標(biāo)準(zhǔn)樣品：USGS32、USGS34、USGS35（購(gòu)自美國(guó)USGS），IAEA-NO3（購(gòu)自IAEA）。

1.3溶液的配制

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1菌株的培養(yǎng)

選用缺乏N2O還原酶活性的反硝化細(xì)菌，即致金色假單胞菌P.aureofaciens（ATCC13985，Pseudomonas aureofaciens購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部菌種保存中心），將該菌株接種并培養(yǎng)7 d待用。

稱(chēng)取10 g新鮮土壤樣品，加入50 mL 2 mol·L-1的KCl溶液，振蕩1 h，懸液靜置3～5 min后過(guò)濾。取15 mL濾液上流動(dòng)注射分析儀（Lachant QC8000）測(cè)定土壤硝態(tài)氮濃度。

將培養(yǎng)7 d的菌液在高速離心機(jī)5000～8000 r· min-1的轉(zhuǎn)速下，18℃離心20 min，倒出上層清液，剩余菌體用無(wú)的TSB-B培養(yǎng)液懸浮，并濃縮成2倍濃度的菌液，然后加入幾滴止泡劑。吸取2～3 mL濃縮菌液注入容積為20 mL的鉗口頂空瓶后，用高純氮?dú)猓魉贋?0～40 mL·min-1）吹掃1～3 h，然后用氣密性注射器將0.4～3.5 μg的樣品注入頂空瓶充分混勻，為避免瓶?jī)?nèi)壓力過(guò)高，加樣體積一般小于4 mL，最后將頂空瓶倒置放入恒溫箱中26℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日注入0.15 mL濃度為10 mol·L-1的NaOH，裂解細(xì)菌并終止反應(yīng)，同時(shí)吸收產(chǎn)生的CO2。

1.4.4N2O氮氧同位素測(cè)定

采用PreCon痕量氣體預(yù)濃縮裝置、同位素比質(zhì)譜儀（IRMS，Deltaplus）測(cè)定反硝化細(xì)菌反應(yīng)產(chǎn)生的N2O氣體氮氧同位素，PreCon配有CTC-Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器。載氣為高純氦氣，流量為50～60mL·min-1，參考標(biāo)準(zhǔn)氣體為校正過(guò)的99.9%N2O氣體。通過(guò)CTC-Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器將頂空瓶中N2O氣體輸送至PreCon，經(jīng)PreCon濃縮和捕集N2O氣體，最后由同位素比質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定氮氧同位素組成。

1.4.5氮氧同位素測(cè)試結(jié)果的校正

氮同位素校正方程如下：

氧同位素校正方程如下：

根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)樣品的真實(shí)值（T）和測(cè)定值（M，meas），計(jì)算出m和b，得到校正方程，根據(jù)測(cè)定值和校正方程計(jì)算出樣品的真實(shí)值。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)過(guò)程優(yōu)化

2.1.1離心轉(zhuǎn)速

在初期的試驗(yàn)中［23］，采用30 000 r·min-1的超高速離心，該步驟對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室較難操作，本實(shí)驗(yàn)中分別采用了3000、5000、8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min進(jìn)行菌液濃縮，對(duì)比各自上清液的OD600值發(fā)現(xiàn)，離心轉(zhuǎn)速為3000 r·min-1時(shí)OD600值要顯著高于5000 r·min-1和8000 r·min-1（表1），而5000 r·min-1和8000 r·min-1沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明離心轉(zhuǎn)速為5000 r·min-1時(shí)已經(jīng)基本將所有的菌體離心沉淀，并且濃縮后菌量也滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求，因此，菌液濃縮采用5000～8000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心均可，這對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室較易實(shí)現(xiàn)。

表1　離心轉(zhuǎn)速對(duì)菌液OD600值的影響Table 1 Effect of centrifugal rotational speed on OD600 value for denitrifier bacterial solution

2.1.2吹掃時(shí)間

表2　不同吹掃時(shí)間對(duì)USGS34標(biāo)樣氮氧同位素實(shí)測(cè)值的影響（n=5）Table 2 Effect of purging time on δ15N and δ18O measured values in USGS34（n=5）

2.1.3自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)的優(yōu)化

在初期的試驗(yàn)中［23］，TraceGas標(biāo)準(zhǔn)配置是Gilson自動(dòng)進(jìn)樣器和容量為12 mL的樣品瓶，但是該樣品瓶不能直接作為反硝化細(xì)菌和樣品的反應(yīng)瓶，需要抽取2 mL反硝化產(chǎn)生的N2O氣體注入到預(yù)抽真空的12 mL樣品瓶中才能進(jìn)行測(cè)定。本研究改用連接CTCCombi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器，通過(guò)設(shè)置儀器自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)及改造樣品盤(pán)，采用20 mL的頂空鉗口瓶進(jìn)行反硝化反應(yīng)，同時(shí)根據(jù)樣品濃度加入0.4～3.5 μg，為避免瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生過(guò)高的壓力，加樣體積應(yīng)盡量小于4 mL，這個(gè)加樣量低于前期試驗(yàn)樣品量［23］，更明顯低于傳統(tǒng)離線方式同位素測(cè)試所需6～20 μg的樣品量［22］。這樣采用20 mL的頂空鉗口瓶可以反硝化反應(yīng)后直接進(jìn)樣，無(wú)需將N2O氣體另外進(jìn)行轉(zhuǎn)移［22-23］，從而避免了因N2O氣體轉(zhuǎn)移而可能產(chǎn)生的同位素分餾及實(shí)驗(yàn)誤差。

2.1.4進(jìn)樣量

為確定PreCon分析系統(tǒng)結(jié)合同位素比質(zhì)譜儀合適的進(jìn)樣量，本研究考察了不同進(jìn)樣量下標(biāo)準(zhǔn)樣品USGS34的硝酸鹽氮氧同位素值（表3）。從表3結(jié)果可以看出，在0.1～0.8 μg-N樣品量之間，PreCon預(yù)濃縮分析系統(tǒng)結(jié)合同位素比質(zhì)譜儀分析，測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，均能得到較穩(wěn)定、準(zhǔn)確的測(cè)定值和校正值，比傳統(tǒng)離線方式同位素測(cè)試所需1.4～4.5 μg-N的樣品量要低很多［14］。本研究推薦一般用量為0.2～0.4 μg-N。

2.2準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性

表4對(duì)不同制備時(shí)間獲得的USGS34的δ15N和δ18O實(shí)測(cè)值進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，δ15N和δ18O值非常穩(wěn)定，從2014年9月12日—2015年3月16日測(cè)定的15N值非常接近，位于-2.32‰～-2.39‰之間；而δ18O測(cè)定值穩(wěn)定性稍差一些，測(cè)定值位于-23.96‰～-24.23‰之間，測(cè)定值之間也沒(méi)有顯著差異，以上結(jié)果表明，在6個(gè)月內(nèi)反硝化細(xì)菌法同時(shí)測(cè)定硝酸鹽的δ15N和δ18O是準(zhǔn)確的、穩(wěn)定的、可行的。同樣從表4可以看出，同一制備時(shí)間的5個(gè)平行樣品之間δ15N的SD介于0.05‰～0.09‰之間，δ18O的SD介于0.28‰～0.48‰之間，均低于USGS34給定的δ15N和δ18O的標(biāo)準(zhǔn)偏差（σδ15N≤0.2‰，σδ18O≤0.6‰），表明該方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性較好。

表4　不同制備時(shí)間USGS34氮氧同位素比值測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性（n=5）Table 4 Precision and stability of δ15N and δ18O in USGS34 under different date of sample preparation（n=5）

表3　不同硝態(tài)氮進(jìn)樣量下δ15N和δ18O值（USGS34）（n=5）Table 3 Raw values of δ15N and δ18O of USGS34 solution with different amount of-N（n=5）

表3　不同硝態(tài)氮進(jìn)樣量下δ15N和δ18O值（USGS34）（n=5）Table 3 Raw values of δ15N and δ18O of USGS34 solution with different amount of-N（n=5）

δ15N/‰標(biāo)準(zhǔn)樣品Nitrate standards加樣量Amount of N/μg δ18O/‰實(shí)測(cè)值Raw values±SD/‰校正值Corrected values±SD/‰真實(shí)值True values±SD/‰實(shí)測(cè)值Raw values±SD/‰校正值Corrected values±SD/‰真實(shí)值True values±SD/‰0.1　-2.34±0.15　-1.85±0.15 USGS34 -23.81±0.30　-27.87±0.33 0.2　-2.30±0.07　-1.81±0.08　-23.96±0.40　-27.65±0.42 0.4　-2.26±0.07　-1.75±0.08　-23.98±0.25　-27.89±0.28 0.8　-2.36±0.04　-1.82±0.04　-24.01±0.31　-27.89±0.33 -1.80±0.2-27.9±0.6

但是需要指出的是，不同樣品制備時(shí)間測(cè)定的氮氧同位素值仍然有差異，這可能主要與不同批次反應(yīng)菌株的差異有關(guān)［15］。為減少此類(lèi)誤差，本研究建議盡量采用新活化或者轉(zhuǎn)接代數(shù)較少的菌株進(jìn)行反硝化反應(yīng)。

2.3浸提劑對(duì)土壤硝酸鹽氮氧同位素值的影響

目前國(guó)內(nèi)較多采用2 mol·L-1KCl或者0.01 mol· L-1CaCl2溶液來(lái)浸提土壤中的硝酸鹽，已有研究發(fā)現(xiàn)該兩種浸提劑對(duì)土壤中硝酸鹽的測(cè)定結(jié)果并無(wú)顯著差異［25］。由于不同生產(chǎn)廠商及不同批次的去離子水、KCl以及CaCl2可能質(zhì)量不同，難以保證研究人員采用的浸提劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置采用的試劑質(zhì)量完全一致，因此，本研究比較了有代表性的去離子水（H2O）、2 mol·L-1KCl及0.01 mol·L-1CaCl2作為樣品加入反硝化菌液后產(chǎn)生的N2O的豐度和面積，以此來(lái)探究浸提劑是否影響土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素值的測(cè)定（表5）。從表5可以看出，本研究所用的0.01 mol·L-1CaCl2中可以檢測(cè)出微量硝酸鹽，而去離子水（H2O）和2 mol·L-1KCl中未檢出硝酸鹽。PreCon結(jié)合同位素質(zhì)譜儀進(jìn)一步檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的N2O發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是吹掃后的空白反硝化細(xì)菌菌液、去離子水（H2O）還是2 mol·L-1KCl和0.01 mol·L-1CaCl2都能檢測(cè)到一個(gè)N2O峰，14N14N16O的豐度空白最低，面積也是空白最小。在本實(shí)驗(yàn)室通常的0.15 mL的加樣量下，各個(gè)處理之間豐度和面積沒(méi)有顯著差異，但是隨加樣量增加一倍（0.30 mL），0.01 mol·L-1CaCl2產(chǎn)生N2O的豐度和面積要顯著高于其他處理，其他處理之間沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明此次試驗(yàn)的浸提劑CaCl2自身含有的硝酸鹽可能會(huì)影響樣品的測(cè)定，而本實(shí)驗(yàn)用KCl和H2O中的硝酸鹽對(duì)樣品測(cè)定不會(huì)產(chǎn)生影響。

表5　不同浸提劑對(duì)硝酸鹽氮氧同位素比值測(cè)定的影響Table 5 Effect of different extracting agents on δ15N and δ18O of nitrate

本研究同時(shí)考察了去離子水和2 mol·L-1KCl分別配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品USGS32、USGS34、USGS35、IAEANO3的反硝化細(xì)菌法測(cè)定的氮氧同位素值（表6），從表6可以看出，盡管各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品氮氧同位素測(cè)定值存在差異，但是差異不顯著（α=0.05）。這表明2 mol· L-1KCl浸提劑自身并不影響反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的測(cè)定，這點(diǎn)與M?rkved等［19］認(rèn)為2 mol·L-1KCl通過(guò)改變反硝化效率而影響測(cè)定值的結(jié)果不同，但Rock等［20］通過(guò)測(cè)定2 mol·L-1KCl浸提液中硝酸鹽的氮氧同位素組成來(lái)進(jìn)行土壤硝酸鹽溯源，也并未指出浸提劑對(duì)反硝化效率的影響。

盡管如此，空白試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，H2O、2 mol·L-1KCl及0.01 mol·L-1CaCl2溶液的反硝化反應(yīng)可能也都產(chǎn)生了微量N2O氣體（見(jiàn)表5，m/z 44面積），這說(shuō)明H2O、KCl、CaCl2可能都含有微量的硝酸鹽，這可能也是不同溶液的標(biāo)準(zhǔn)樣品氮氧同位素測(cè)定值存在差異的原因。因此，為了減少系統(tǒng)和測(cè)定誤差，一是建議購(gòu)買(mǎi)純度較高的浸提劑和去離子水，二是建議土壤硝酸鹽浸提液統(tǒng)一采用去離子水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)校正，且每一次測(cè)定都應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)樣品重新做校正曲線。

表6　水配制及KCl配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定值（n=5）Table 6 Raw δ15N and δ18O values of NO-standards prepared with3H2O and KCl solution（n=5）

2.4保存條件對(duì)土壤中硝酸鹽氮氧同位素值的影響

以2 mol·L-1的KCl溶液為浸提劑，考查了保存條件對(duì)土壤中硝酸鹽氮氧同位素測(cè)定值的影響。結(jié)果顯示，土壤浸提液的保存方式顯著影響了土壤浸提液中硝酸鹽的氮氧同位素值（表7）。由表7可見(jiàn)，-18℃冷凍保存效果較好，即使冷凍保存30 d，土壤浸提液硝酸鹽的δ15N和δ18O實(shí)測(cè)值仍然與新鮮樣品當(dāng)日測(cè)定值相近，沒(méi)有顯著差異。在4℃冷藏條件下，各土層硝酸鹽的δ15N在冷藏30 d內(nèi)均與新鮮樣品當(dāng)日測(cè)定值相近，沒(méi)有顯著差異；但是，各層次土壤硝酸鹽的δ18O在10 d之內(nèi)沒(méi)有顯著變化，在20 d和30 d，除40～60 cm土層外，其余均顯著低于新鮮樣品當(dāng)日測(cè)定值，δ18O最大降低了3.88‰，變化非常大，其比例范圍為19.27%～213%。由此可見(jiàn)，土壤樣品浸提后，為保證其δ15N和δ18O的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，一方面應(yīng)冷凍保存，另一方面應(yīng)盡快測(cè)定。

2.5加熱對(duì)土壤硝酸鹽氮氧同位素組成測(cè)定的影響

土壤微生物組成復(fù)雜，其浸提液可能含有土壤原生反硝化細(xì)菌及其N(xiāo)2O還原酶，從而干擾反硝化細(xì)菌還原產(chǎn)生N2O的氮氧同位素測(cè)定。對(duì)此，M?rkved等［19］建議將土壤浸提液80℃加熱1 h，以消除土壤原生反硝化細(xì)菌對(duì)其硝酸鹽氮同位素測(cè)定的干擾。為考察加熱對(duì)同時(shí)測(cè)定硝酸鹽氮氧同位素的影響，同時(shí)鑒于每個(gè)研究者的土壤浸提液含有的原生反硝化細(xì)菌不盡相同，本研究比較了將USGS34、IAEA-NO3標(biāo)準(zhǔn)樣品以及土壤樣品加熱與否的氮氧同位素測(cè)定值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，δ15N測(cè)定值沒(méi)有顯著差異（表8），表明加熱與否對(duì)δ15N測(cè)定值沒(méi)有顯著影響，這與M?rkved等［19］的結(jié)果是一致的；但是加熱后標(biāo)準(zhǔn)樣品的δ18O測(cè)定值要顯著升高（表8），這說(shuō)明加熱可能促使標(biāo)樣的O與空氣中O2的氧發(fā)生了交換，導(dǎo)致反硝化作用產(chǎn)生的N2O氣體產(chǎn)生了同位素分餾，而空氣中的δ18O-O2為23.5‰，比USGS34（δ18O=-23.77‰）及IAEA-NO3 （δ18O=21.33‰）中δ18O的實(shí)測(cè)值都要高，所以加熱過(guò)程可能導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)樣品的O與空氣中的O2發(fā)生了交換，使其δ18O測(cè)定值顯著升高，也說(shuō)明了加熱影響了標(biāo)準(zhǔn)樣品δ18O的準(zhǔn)確測(cè)定。與標(biāo)準(zhǔn)樣品不同的是，土壤樣品加熱之后δ18O測(cè)定值有的升高（表8），有的降低，沒(méi)有明顯的規(guī)律性，這說(shuō)明不加熱時(shí)土壤原生反硝化細(xì)菌可能產(chǎn)生一定作用，但是加熱又會(huì)產(chǎn)生同位素的熱交換，所以加熱前后δ18O測(cè)定值沒(méi)有顯著差異，δ15N測(cè)定值同樣也沒(méi)有顯著差異。因此，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性及節(jié)省測(cè)試時(shí)間，本研究建議對(duì)于土壤浸提液硝酸鹽氮氧同位素的同時(shí)測(cè)定，浸提液可以直接和反硝化細(xì)菌反應(yīng)，而無(wú)需加熱，這也與Rock等［20］直接采用2 mol·L-1KCl土壤浸提液進(jìn)行反硝化反應(yīng)測(cè)定其硝酸鹽氮氧同位素組成的方法是一致的。

表7　不同保存條件對(duì)不同土壤層次硝態(tài)氮氮氧同位素值的影響（n=4）Table 7 Effect of preservation condition on δ15N and δ18O values of soil nitrate in different depth（n=4）

表8　硝酸鹽樣品的氮氧同位素值（加熱與否）Table 8 δ15N and δ18O values in the nitrate samples （heating or not heating）

2.6實(shí)際樣品測(cè)定

3　結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了已發(fā)表的反硝化細(xì)菌結(jié)合Tracegas-同位素比質(zhì)譜儀測(cè)定硝酸鹽氮氧同位素的方法，并應(yīng)用PreCon-同位素質(zhì)譜儀測(cè)定。該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性，且僅需很小的樣品量，并且在普通實(shí)驗(yàn)室即可完成前處理過(guò)程，具有很好的推廣應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)用去離子水及浸提試劑大多也含有微量的硝酸鹽，隨加樣量增多，有可能會(huì)影響浸提液中氮氧同位素的測(cè)定，因此建議購(gòu)買(mǎi)純度較高的浸提劑和去離子水，二是建議土壤硝酸鹽浸提液統(tǒng)一采用去離子水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)校正，且每一次測(cè)定都應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)樣品重新做校正曲線。冷凍保存效果較好，δ15N和δ18O值基本沒(méi)有變化，因此土壤樣品浸提后，一方面應(yīng)冷凍保存，另一方面應(yīng)盡快測(cè)定。加熱對(duì)硝酸鹽氮同位素測(cè)定沒(méi)有顯著影響，但會(huì)引起氧同位素的分餾，因此建議土壤浸提液直接和反硝化細(xì)菌進(jìn)行反應(yīng)來(lái)測(cè)定硝酸鹽氮氧同位素組成。需要指出的是，反硝化細(xì)菌可以將土壤中硝酸鹽（）和亞硝酸鹽（NO-2）同時(shí)還原為N2O氣體，故測(cè)定結(jié)果實(shí)際為二者混合物的平均氮同位素組成，因此當(dāng)亞硝酸鹽同時(shí)存在時(shí)，可以預(yù)先從樣品中除去。其方法是，加足夠量的抗壞血酸使溶液的pH至3.5左右，抗壞血酸不與硝酸鹽作用，而僅與亞硝酸鹽選擇性反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)換為NO并被惰性氣體氦氣連續(xù)移走?？箟难釋?duì)反硝化細(xì)菌無(wú)毒，不影響后續(xù)硝酸鹽的分析。因本研究土壤樣品中未檢測(cè)到亞硝酸鹽，故省去該步驟。綜上所述，反硝化細(xì)菌法適用于土壤浸提液中硝酸鹽氮氧同位素組成的同時(shí)測(cè)定。

表9　不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素校正值Table 9 Corrected δ15N and δ18O values ofof soil extract samples in different fertilizer fields

表9　不同肥料處理田間土壤浸提液硝酸鹽的氮氧同位素校正值Table 9 Corrected δ15N and δ18O values ofof soil extract samples in different fertilizer fields

土壤提取液樣品Soil extract samples　δ15Nnitrate校正值Corrected values±SD/‰　δ18Onitrate校正值Corrected values±SD/‰有機(jī)肥田Applied organic fertilizer field　9.40±1.54　1.48±0.97施尿素田Applied urea field　-3.26±0.74　-5.23±1.03農(nóng)戶(hù)施肥田Fertilized field as farmers　-3.45±1.04　3.96±0.88

［1］巨曉棠，張福鎖.中國(guó)北方土壤硝態(tài)氮的累積及其對(duì)環(huán)境的影響［J］.生態(tài)環(huán)境，2003，12（1）：24-28.

JU Xiao-tang，ZHANG Fu-suo.Nitrate accumulation and its implication to environment in North China［J］.Ecology and Environment，2003，12（1）：24-28.

［2］Ju X T，Kou C L，Zhang F S，et al.Nitrogen balance and groundwater nitrate contamination：Comparison among three intensive cropping systems ontheNorthChinaPlain［J］．EnvironmentalPollution，2006，143：117-125.

［3］畢曉慶，山楠，杜連鳳，等.氮肥用量對(duì)設(shè)施滴灌栽培番茄產(chǎn)量品質(zhì)及土壤硝態(tài)氮累積的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（11）：2246-2250.

BI Xiao-qing，SHAN Nan，DU Lian-feng，et al.Effects of Nitrogen rates on tomato yield and quality and soil nitrate accumulation under drip irrigationinsolargreenhouse［J］.JournalofAgro-EnvironmentScience，2013，32（11）：2246-2250.

［4］Kol D C，Mayer B，Lee K S，et al.Land-use controls on sources and fate of nitrate in shallow groundwater of an agricultural area revealed by multiple environmental tracers［J］.Journal of Contaminant Hydrology，2010，118（1/2）：62-78.

［5］王慶鎖，孫東寶，郝衛(wèi)平，等.密云水庫(kù)流域地下水硝態(tài)氮的分布及其影響因素［J］.土壤學(xué)報(bào)，2011，48（1）：141-150.

WANG Qing-suo，SUN Dong-bao，HAO Wei-ping，et al.Nitrate concentration distribution in groundwater of the Miyun Reservoir Water－shed［J］.Acta Pedologica Sinica，2011，48（1）：141-150.

［6］徐春英，李玉中，李巧珍，等.山東濰坊地下水硝酸鹽污染現(xiàn)狀及δ15N溯源［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31（21）：6579-6587.

［7］劉興權(quán)，許晶玉，江麗華，等.山東省種植區(qū)地下水硝酸鹽污染空間變異及分布規(guī)律研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（6）：1172-1179.

LIU Xing-quan，XU Jing-yu，JIANG Li-hua，et al.Spatial variability and distribution pattern of groundwater nitrate pollution in farming regions of Shandong Province，China［J］.Journal of Agro-Environment Science，2010，29（6）：1172-1179.

［8］張麗娟，巨曉棠，劉辰琛，等.北方設(shè)施蔬菜種植區(qū)地下水硝酸鹽來(lái)源分析：以山東省惠民縣為例［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（21）：4427-4436.

ZHANG Li-juan，JU Xiao-tang，LIU Chen-chen，et al.A study on nitrate contamination of ground water sources in areas of protected vegetables-growing fields：A case study in Huimin County，Shandong Province ［J］.Scientia Agricultura Sinica，2010，43（21）：4427-4436.

［9］Senbayram M，Chen R，Budai A，et al.N2O emission and the N2O/（N2O+ N2）product ratio of denitrification as controlled by available carbon substrates and nitrate concentrations［J］.Agriculture，Ecosystems&Environment，2012，147（15）：4-12.

［10］Rock L，Ellert B H，Mayer B.Tracing sources of soil nitrate using the dual isotopic composition of nitrate in 2 M KCl-extracts［J］.Soil Biology &Biochemistry，2011，43（12）：2397-2405.

［11］Kelley C J，Keller C K，Evans R D，et al.Nitrate-nitrogen and oxygen isotope ratios for identification of nitrate sources and dominant nitrogen cycle processes in a tile-drained dryland agricultural field［J］.Soil Biology&Biochemistry，2013，57：731-738.

［12］賈小妨，李玉中，徐春英，等.氮、氧同位素與地下水中硝酸鹽溯源研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（14）：233-239.

JIA Xiao-fang，LI Yu-zhong，XU Chun-ying，et al.Research advanced in N，O isotope and sources of nitrate in groundwater［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（14）：233-239.

［13］李玉中，王利民，徐春英，等.地下水硝酸鹽污染治理研究［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2014：113-121.

LI Yu-zhong，WANG Li-min，XU Chun-ying，et al.Research on study of nitrate pollution in groundwater［M］.Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2014：113-121.

［14］Sigman D M，Casciotti K L，Andrean M，et al.A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater［J］，Analytical Chemistry，2001，73（17）：4145-4153.

［15］Casciotti K L，Sigman D M，Hastings M G，et al.Measurement of the oxygen isotopic composition of nitrate in seawater and freshwater using the denitrifier method［J］.Analytical Chemistry，2002，74（19）：4905-4912.

［16］McIlvin M R，Casciotti K L.Technical updates to the bacterial method for nitrate isotopic analyses［J］.Analytical Chemistry，2011，83（5）：1850-1856.

［17］Révész K，Casciotti K L.Methods of the reston stable isotope laboratory ［S］.U.S.Geological Survey，Reston，Virginia 2007，http：//www.usgs. gov/.

［18］Fenech C，Rock L，Nolan K，et al.The potential for a suite of isotope and chemical markers to differentiate sources of nitrate contamination：A review［J］.Water Research，2012，46（7）：2023-2041.

［19］M?rkved P T，D?rsch P，S?vik A K，et al.Simplified preparation for the δ15N-analysis in soilby the denitrifier method［J］.Soil Biology& Biochemistry，2007，39（8）：1907-1915.

［20］Rock L，Ellert B H.Nitrogen-15 and oxygen-18 natural abundance of potassiumchlorideextractablesoilnitrateusingthedenitrifiermethod［J］. Soil Science Society of America Journal，2007，71（2）：355-361.

［21］Minet E，Coxon C E，Goodhue R，et al.Evaluating the utility of15N and18O isotope abundance analyses to identify nitrate sources：A soil zone study［J］.Water Research，2012，46（12）：3723-3736.

［22］張翠云，張俊霞，馬琳娜，等.硝酸鹽氮同位素反硝化細(xì)菌法測(cè)試技術(shù)的建立［J］.核技術(shù)，2011，34（3）：237-240.

ZHANG Cui-yun，ZHANG Jin-xia，MA Lin-na，et al.A technique for measuring nitrogen isotopic composition of nitrate using the denitrifier method［J］.Nuclear Techniques，2011，34（3）：237-240.

［23］徐春英，李玉中，郝衛(wèi)平，等.反硝化細(xì)菌法結(jié)合痕量氣體分析儀/同位素比質(zhì)譜儀分析水體硝酸鹽氮同位素組成［J］.分析化學(xué)，2012，40（9）：1360-1365.

XU Chun-ying，LI Yu-zhong，HAO Wei-ping，et al.Analysis of nitrogen isotopic composition of nitrate in water by denitrifier method and trace-gas/isotope ratio mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40（9）：1360-1365.

［24］岳甫均，李思亮，劉叢強(qiáng)，等.利用反硝化細(xì)菌法測(cè)試水體硝酸鹽氮氧同位素［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（8）：2152-2157.

YUE Fu-jun，LI Si-liang，LIU Cong-qiang，et al.Measurement of waters nitrate dual isotopes based on denitrifier method［J］.Chinese Journal of Ecology，2012，31（8）：2152-2157.

［25］陜紅，張慶忠，張曉娟，等.保存、分析方法等因素對(duì)土壤中硝態(tài)氮測(cè)定的影響［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（12）：1466-1471.

SHAN Hong，ZHANG Qing-zhong，ZHANG Xiao-juan，et al.Effect of preservation，analysis method on determination of nitrate in soils［J］. Journal of Instrumental Analysis，2013，32（12）：1466-1471.

Determination of15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method

XU Chun-ying，LI Yu-zhong*，LI Qiao-zhen，MAO Li-li，LIN Wei，QIANG Xiao-jing，ZHENG Qian
（Key Laboratory of Dryland Agriculture，Ministry of Agriculture in China，Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

A method has been established for determing simultaneouslyN andO isotope abundance in the extractable soil nitrate using denitrifier bacteria.The method was optimized by using 5000～8000 r·min-1centrifugal rotational speed，purging 1 h with high pure N2，reducing the amounts of samples and improving the autosampler based on the preliminary findings.Analysis of international standard of USGS34 showed that the method presented better accuracy，precision，and stability.The standard deviations（SD）of δ15N and δ18O were 0.05‰～0.09‰and 0.28‰～0.48‰respectively in the same sample at the same time within 3 months.Additionally，the effects of some factors such as the extracting agents，storage condition and heating on δ15N and δ18O of soil nitrate were analyzed.The results showed that the extracted solution such as KCl or CaCl2had no effect on the determination of δ15N and δ18O if sampling amount was small.Nevertheless，the significant difference would be found under bigger sampling amount with impure extracting agents.Moreover，the results also indicated that the cryopreservation method was better than the cold preservation for the δ15N and δ18O in the soil nitrate.Analysis of δ15N and δ18O shouldbe finished as soon as possible；on the other hand，the soil extracted solution should be cryopreserved.No significant effect of the heat treatment was observed for δ15N values of USGS34 and IAEA-NO3.However，the raw δ18O values showed that there were significant differences in heating，and this caused oxygen isotopic fractionation.But no significant differences were observed for δ15N and δ18O in the extracted soil nitrate samples.Therefore，we suggested that the soil nitrate extracts can directly react with denitrifier in order to avoid the oxygen isotopic fractionation and save the test time.Based on these，15N and18O isotope abundance in the extractable soil nitrate under the different fertilizer fields were investigated by using this method.

denitrifier method；soil extract；nitrate；15N and18O isotope abundance

S151.9

A

1672-2043（2016）09-1829-08doi：10.11654/jaes.2016-0551

2016－04－19

國(guó)家自然科學(xué)基金（41301553，41473004）；中央級(jí)公益性科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金；中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目（農(nóng)業(yè)水生產(chǎn)力與水環(huán)境創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)）

徐春英（1978—），女，副研究員，博士，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)水環(huán)境。E-mail：xuchuny@126.com

李玉中E-mail：liyuzhong@caas.cn