二維Otsu和改進(jìn)區(qū)域生長(zhǎng)法的熒光免疫層析試條濃度的定量檢測(cè)*

高躍明，伊騰增，韋孟宇，杜民，潘少恒

（1.福州大學(xué)物理與信息工程學(xué)院，福州350116；2.福州大學(xué)福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002；3.澳門大學(xué)科技學(xué)院電機(jī)及電腦工程系，澳門特別行政區(qū)999078；4.澳門大學(xué)模擬與混合信號(hào)超大規(guī)模集成電路國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門特別行政區(qū)999078）

二維Otsu和改進(jìn)區(qū)域生長(zhǎng)法的熒光免疫層析試條濃度的定量檢測(cè)*

高躍明1，2*，伊騰增1，2，韋孟宇2，3，4，杜民1，2，潘少恒4

（1.福州大學(xué)物理與信息工程學(xué)院，福州350116；2.福州大學(xué)福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002；3.澳門大學(xué)科技學(xué)院電機(jī)及電腦工程系，澳門特別行政區(qū)999078；4.澳門大學(xué)模擬與混合信號(hào)超大規(guī)模集成電路國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門特別行政區(qū)999078）

目前熒光免疫層析試條的定量檢測(cè)方法絕大多數(shù)采用光電反射法，該方法需要對(duì)試條進(jìn)行高精度的定位并且需要復(fù)雜的傳動(dòng)裝置。利用CMOS圖像傳感器獲取熒光免疫層析試條的圖像信息，采用圖像分割方法用于熒光免疫層析試條檢測(cè)線和質(zhì)控線進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，首先對(duì)采集到的原始圖像進(jìn)行增強(qiáng)預(yù)處理，并進(jìn)行初步分割。然后選定處理后圖像的種子點(diǎn)并通過改進(jìn)的二維Otsu法選取生長(zhǎng)閾值對(duì)圖像進(jìn)行區(qū)域生長(zhǎng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)圖像檢測(cè)線和質(zhì)控線的分割。結(jié)果表明該方法能夠在目標(biāo)和背景對(duì)比度很低的情況下，將圖像檢測(cè)線和質(zhì)控線的輪廓清晰的分割出來，且區(qū)域一致性測(cè)度和對(duì)比度都比較理想。該方法檢測(cè)不同濃度的試條，得到的特征值重復(fù)性小于5%，線性度大于0.99，準(zhǔn)確度大于0.98。實(shí)驗(yàn)證明用該方法對(duì)熒光免疫層析試條進(jìn)行定量檢測(cè)是可行的，且較對(duì)比儀器具有更寬的檢測(cè)范圍。

熒光免疫層析試條；圖像采集；區(qū)域生長(zhǎng)；二維Otsu；定量檢測(cè)

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.010

免疫層析法將待測(cè)抗原/抗體通過層析的手段與帶有標(biāo)記物的抗體/抗原進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)，進(jìn)而采用光學(xué)或電磁學(xué)方法檢測(cè)標(biāo)記物光強(qiáng)或電信號(hào)大小，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物濃度的間接檢測(cè)。該方法具有特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、可單人份檢測(cè)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品安全、毒品抽檢等現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試領(lǐng)域［1-2］。

熒光免疫層析試條將熒光顆粒作為顯色標(biāo)記物，通過定量檢測(cè)熒光信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)抗原/抗體的檢測(cè)。熒光標(biāo)記物的引入使免疫層析法升級(jí)成一種定量檢測(cè)手段。ESE公司研制的Quant定量側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱Quant），被認(rèn)為是POCT領(lǐng)域熒光層析檢測(cè)的標(biāo)桿［3］。國(guó)內(nèi)推出了一些熒光免疫層析分析系統(tǒng)。如［4］中所提出的基于免疫層析技術(shù)的時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，以及［3］中所提到的熒光免疫層析定量檢測(cè)儀。但這些儀器大多采用光電掃描的方式來實(shí)現(xiàn)。光電掃描法在檢測(cè)過程中需要對(duì)光學(xué)傳感器和試條進(jìn)行準(zhǔn)確定位。一旦裝配過程中存在定位不準(zhǔn)，將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的偏差。光電掃描法還需要傳動(dòng)裝置，傳動(dòng)裝置會(huì)帶來機(jī)械振動(dòng)噪聲對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。本文擬采用圖像傳感器獲取熒光試條的圖像，并進(jìn)行定量檢測(cè)使得檢測(cè)噪聲減少，并使檢測(cè)的結(jié)果精確度提高。根據(jù)熒光免疫層析試條的特點(diǎn)，本文采用一種改進(jìn)的區(qū)域生長(zhǎng)法提取試條測(cè)試窗口中的檢測(cè)線和質(zhì)控線并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。首先通過圖像增強(qiáng)提高圖像目標(biāo)和背景的對(duì)比度，再通過閾值法對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)分割去除部分干擾信息，根據(jù)灰度直方圖的分布特性及目標(biāo)區(qū)域的連通性作為生長(zhǎng)判決條件，用一種改進(jìn)的二維Otsu法選擇生長(zhǎng)閾值，并進(jìn)行區(qū)域生長(zhǎng)，然后從分割出來的熒光信號(hào)圖像中獲取特征值，最后采用C-反應(yīng)蛋白CRP（C-Reactive Protein）試條作為檢測(cè)對(duì)象，分析算法的分割精度以及對(duì)試條的定量檢測(cè)精度。

1　定量檢測(cè)原理

熒光免疫層析檢測(cè)試條結(jié)構(gòu)如圖1所示。待測(cè)液通過層析作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上固化的熒光標(biāo)記物后與之結(jié)合。當(dāng)待測(cè)液移動(dòng)至抗原的檢測(cè)帶時(shí)，待測(cè)物和試劑的復(fù)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合后被截留，結(jié)合物在檢測(cè)線上富集，附著的結(jié)合物含量與樣品中待測(cè)物含量成線性關(guān)系。熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下，能產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的發(fā)射光。產(chǎn)生的發(fā)射光的強(qiáng)度與試條上富集的反應(yīng)結(jié)合物數(shù)量具有相關(guān)性［5-6］。

由于熒光試條背景含熒光物質(zhì)較少，所以被激發(fā)出的熒光較微弱。COMS光電圖像傳感器的光電轉(zhuǎn)換特性是線性的，當(dāng)單色光入射到COMS光敏單元上時(shí)光敏單元的輸出信號(hào)I與入射光的強(qiáng)度成正比。由于COMS圖像傳感器采用等間隔均勻量化，所以圖像的灰度級(jí)正比于COMS對(duì)應(yīng)的光敏單元的輸出信號(hào)［7］。熒光定量檢測(cè)主要依據(jù)：熒光強(qiáng)度F的值為

其中，φf為熒光α效率，I0為入射光強(qiáng)度，ic為流過平面光發(fā)光二極管（LED）的電流強(qiáng)度。α為I0與ic的比例系數(shù)，ε為物質(zhì)溶液的摩爾吸光系數(shù)，c為待測(cè)溶液濃度，b為液層厚度。這就是熒光定量分析的理論公式。上式表明，在滿足待測(cè)物為均勻的稀溶液、氣體等，溶質(zhì)分子間相互影響可以忽略不計(jì)時(shí)，且入射光為單色平行平面光。LED用恒流源供電，其電流強(qiáng)度ic為定值，熒光強(qiáng)度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比。因此可將檢測(cè)到的檢測(cè)線的像素灰度值之和除以質(zhì)控線像素灰度值之和作為檢測(cè)結(jié)果。

圖1　免疫層析檢測(cè)試條結(jié)構(gòu)圖

2　試條信號(hào)采集及預(yù)處理

本文采用面陣CMOS作為圖像采集裝置，如圖2所示。圖像采集裝置由波長(zhǎng)375 nm的LED光源、CMOS圖像傳感器和透射波長(zhǎng)（615±15）nm的濾光片組成。圖像傳感器用于采集經(jīng)過濾光片的圖像信號(hào)，經(jīng)過濾光片采集到的圖像信號(hào)如圖3所示。采集到的圖片由USB 2.0接口傳送到上位機(jī)，上位機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行處理得到表示試條濃度的特征值。

由于熒光圖像采集時(shí)會(huì)引入噪聲。這些噪聲會(huì)對(duì)熒光信號(hào)的提取以及對(duì)特征值的提取產(chǎn)生影響［8］，并且圖像目標(biāo)和背景的對(duì)比度非常低，為了能成功的將圖像分割出來必須對(duì)原始圖像進(jìn)行圖像增強(qiáng)，本文采用二維高斯低通濾波的方法對(duì)圖像進(jìn)行增強(qiáng)。二維高斯低通濾波函數(shù)為如式（5）所示。D0為截止頻率，D（u，v）是距傅里葉變換平面原點(diǎn)的距離。令式中D0=80。對(duì)圖像進(jìn)行增強(qiáng)。圖4為增強(qiáng)后的圖像。

圖2　熒光免疫層析試條圖像采集裝置

圖3　熒光免疫層析試條圖像信號(hào)

圖4　經(jīng)過增強(qiáng)后的試條圖像

由于熒光試條檢測(cè)線和質(zhì)控線的亮度比背景要高且檢測(cè)線和質(zhì)控線占整幅圖像的面積不超過10%，假設(shè)在一幅熒光檢測(cè)圖像中圖像背景的灰度值不超過T，整幅圖像的像素?cái)?shù)為n，灰度值不超過T的像素?cái)?shù)為m，當(dāng)m/n＜10%，且（m+1）/n＞10%時(shí)的T值作為分割閾值，進(jìn)行預(yù)分割。

3　基于改進(jìn)的區(qū)域生長(zhǎng)算法

一般來說圖像分割就是將圖像按照顏色、強(qiáng)度、紋理等劃分為若干個(gè)特定的互不重疊的區(qū)域，并且從這些區(qū)域中提取感興趣的目標(biāo)區(qū)域的技術(shù)和過程［9］。區(qū)域生長(zhǎng)方法需要先選取生長(zhǎng)種子點(diǎn)，在滿足一定的同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)前提下，逐漸聚集種子點(diǎn)周圍的像點(diǎn)，形成一個(gè)漸漸增大的同質(zhì)區(qū)域，直到所有滿足同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的點(diǎn)都被加到該區(qū)域中結(jié)束。該方法可以看作是一個(gè)連續(xù)的聚集過程，運(yùn)行結(jié)果取決于圖像像素點(diǎn)的處理順序，優(yōu)點(diǎn)是所得到的同質(zhì)區(qū)域在空間上不僅相互關(guān)聯(lián)而且緊湊，缺點(diǎn)是可能造成過分割［10］。

本文選取檢測(cè)線和質(zhì)控線的中間線作為邊界線，將試條圖像分為檢測(cè)線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域分別進(jìn)行處理。首先必須選擇合適的種子點(diǎn)，由于試條的熒光信號(hào)波長(zhǎng)是615 nm，鏡頭前的濾光片透射波長(zhǎng)（615± 15）nm，所以在熒光物質(zhì)富集的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶上，熒光信號(hào)亮度要普遍大于背景區(qū)域的亮度。針對(duì)該特征，我們采用3×3的矩陣去遍歷整個(gè)圖片，將矩陣內(nèi)像素點(diǎn)的平均灰度值最大的區(qū)域的中間灰度作為區(qū)域生長(zhǎng)的生長(zhǎng)起點(diǎn)。然后，選用相鄰點(diǎn)閾值差法作為生長(zhǎng)準(zhǔn)則。設(shè)圖像中某一符合生長(zhǎng)要求的點(diǎn)，記灰度值為f（x，y），當(dāng)該點(diǎn)8連通區(qū)域的相鄰點(diǎn)f（x1，y1）的像素值與生長(zhǎng)點(diǎn)之差小于某個(gè)閾值（threshold）時(shí)，則認(rèn)為該點(diǎn)符合生長(zhǎng)準(zhǔn)則，判斷該點(diǎn)為新的生長(zhǎng)起點(diǎn)。

式中，seed為種子點(diǎn)，t為選取的生長(zhǎng)閾值。

由于增強(qiáng)后圖像的灰度直方圖的波峰和波谷不那么明顯。本文引入二維灰度直方圖的Otsu法。該方法不僅充分利用了圖像像素點(diǎn)的信息，而且考慮到了像素點(diǎn)與其鄰域的空間有相關(guān)信息，具有較好的抗噪性。本文采用論文［11］提出的改進(jìn)二維Otsu法求取閾值t和s，其中t為原圖像的閾值，s為平滑后圖像的閾值。

對(duì)原圖像進(jìn)行3×3領(lǐng)域平均平滑得到一平滑圖像，這一平滑圖像與原圖像構(gòu)造出一個(gè)二維直方圖。二維直方圖上任意一點(diǎn)的值是pij，下標(biāo)i和j表示二維直方圖的橫縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為原圖像灰度統(tǒng)計(jì)值縱坐標(biāo)為平滑后圖像的灰度統(tǒng)計(jì)值，該值表示圖像在原圖像灰度為i平滑圖像上灰度為j的概率。假設(shè)圖像被閾值對(duì)（s，t）分成C0和C1，其中C0為目標(biāo)圖像C1為背景圖像，它們的概率分別是w0和wb，L為灰度值上限，計(jì)算公式如式（7）所示。

類內(nèi)均值矢量m0和mb。分別為

二維Otsu法的類間方差的跡為

最佳閾值為

將求出的閾值分別作為平滑圖像和原始圖像的區(qū)域生長(zhǎng)的閾值對(duì)圖像進(jìn)行分割。分割結(jié)果如圖5所示。

圖5　圖像分割結(jié)果

4　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本文選用WP-UF500M相機(jī)采集圖像。光譜響應(yīng)范圍350 nm～1 100 nm，曝光時(shí)間在0.038 ms～3 000 ms范圍可調(diào)，信噪比為38.1 dB，動(dòng)態(tài)范圍70.1 dB。實(shí)驗(yàn)采用TH-UV365T3WA-3535-B發(fā)光二極管作為激發(fā)光源。該發(fā)光二極管經(jīng)過凸透鏡的聚焦后，在一定的圓形范圍內(nèi)產(chǎn)生均勻的平面光。檢測(cè)設(shè)備實(shí)物圖如圖6所示。

圖6　檢測(cè)裝置實(shí)物圖

本文選取區(qū)域一致性測(cè)度UM和區(qū)域?qū)Ρ榷菴R［12］作為評(píng)價(jià)準(zhǔn)則，其定義見式（13）～式（15）。

式中A為歸一化因子，這里指整幅圖像的像素?cái)?shù)。

式中，f（x，y）為像素（x，y）的灰度值，mi為對(duì)應(yīng)分割區(qū)Ri內(nèi)的像素?cái)?shù)，為方差，下標(biāo)i等于1表示目標(biāo)圖像方差為2表示背景圖像方差。

式中f0、fb分別為目標(biāo)區(qū)域和背景區(qū)域的平均灰度級(jí)。CR取值范圍在0～1之間，CR越大目標(biāo)與背景的對(duì)比度越大分割效果越好。不同濃度的熒光試條分割后的評(píng)價(jià)結(jié)果如表1所示。

表1　分割性能評(píng)價(jià)

表1顯示本文的分割算法比較理想，此外可以看出隨著試條熒光物質(zhì)含量的升高，其檢測(cè)線和背景的灰度對(duì)比度會(huì)變得比較高，所以CR值也會(huì)變得比較高。

要實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)必須先求取特征值，本文將分割后檢測(cè)線的灰度值全部相加得到檢測(cè)線特征值t，將分割后質(zhì)控線的灰度值全部相加得到質(zhì)控線特征值c，將檢測(cè)線的特征值和控制線的特征值的比值t/c作為特征值。特征值與免疫層析標(biāo)準(zhǔn)試條的濃度成正比，反應(yīng)了試條的濃度。由特征值t/c所表示的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2　6種濃度試條的特征值及重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)6種濃度的CRP試條，并選擇變異系數(shù)來判斷檢測(cè)結(jié)果效果的重復(fù)性。變異系數(shù)CV（variable coefficient）的定義如式（16）

其中，SD為所測(cè)樣本特征值的標(biāo)準(zhǔn)差，MN為所測(cè)樣本特征值的平均值。

從表2可以看出本文方法得到的CV值不超過5%，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性較好。

選用ESE公司的Quant檢測(cè)儀作為參照來驗(yàn)證本文的檢測(cè)精度。Quant對(duì)不同濃度的試條檢測(cè)得到的特征值如表3所示。

表3　Quant檢測(cè)不同濃度的試條得出的特征值

Quant檢測(cè)儀雖然檢測(cè)精確度高，但是量程有限，對(duì)表2中810 ng/mL和2 430 ng/mL兩種濃度試條檢測(cè)結(jié)果為超量程。本文選用濃度為10 ng/mL、30 ng/mL、90 ng/mL、270 ng/mL的4種試條驗(yàn)證儀器的檢驗(yàn)精度。圖7表示本文檢測(cè)結(jié)果與Quant檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，R2＞0.98，具有很高的相關(guān)性。

圖7　本實(shí)驗(yàn)特征值和Quant特征值的線性關(guān)系

進(jìn)一步，挑選6種濃度試條的測(cè)量值均值進(jìn)行刻度曲線擬合，擬合結(jié)果如圖8所示。

圖8　熒光信號(hào)特征值與濃度間的擬合曲線

線性關(guān)系為

式中，y為特征值t/c，x為待測(cè)液濃度，線性度R2＞0.99。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文算法得到的特征值有較好的線性度。

5　結(jié)論

本文闡述了熒光免疫層析試條的定量檢測(cè)原理，設(shè)計(jì)了基于圖像采集法的熒光免疫層析試條定量檢測(cè)裝置，針對(duì)圖像檢測(cè)結(jié)果，提出了基于二維Otsu和區(qū)域增長(zhǎng)算法的圖像分割和定量檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本文研制系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)CV不大于5%；刻度曲線的線性度為0.997 8；與Quant檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性大于0.98，說明檢測(cè)精度良好。

同時(shí)，本文檢測(cè)裝置的測(cè)量范圍較Quant檢測(cè)儀更寬，具有更好的適用性。此外，由于本文采用的圖像檢測(cè)方法無需的試條傳動(dòng)裝置，以及精確的試條定位裝置，簡(jiǎn)化了儀器的加工流程和裝配工藝，且易于擴(kuò)展到多通道試條檢測(cè)。

（注：由于通過圖像分割方法檢測(cè)熒光試條的研究較少，僅論文［8］采用圖像分割方法進(jìn)行定量檢測(cè)。但該論文未對(duì)變異系數(shù)CV值做分析。本文所提出方法的變異系數(shù)、刻度曲線線性度，以及所測(cè)得的特征值與Quant檢測(cè)儀所測(cè)得的特征值的相關(guān)性均可與Quant檢測(cè)儀相比，且檢測(cè)范圍優(yōu)于Quant。這些指標(biāo)的獲得都是建立在前期良好的分割精度基礎(chǔ)之上。）

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高躍明（1982-），2010年于福州大學(xué)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)為福州大學(xué)副研究員，主要研究方向?yàn)樯镫娮訉W(xué)等，fzugym@ 163.com；

伊騰增（1986-），男，福建福州人，現(xiàn)為福州大學(xué)碩士研究生，主要從事數(shù)字圖像處理方面的研究，1537582009@qq.com。

Fluorescent Immune-Chromatographic Strip Quantitative Detection Based on Two-Dimensional Otsu Method and Region Growth Algorithm*

GAO Yueming1，2*，YI Tengzeng1，2，WAI Mangi2，3，4，DU Min1，2，PUN Siohang4
（1.College of Physics and Information Engineering，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350116，China；2.Key Lab of Medical Instrumentation&Pharmaceutical Technology of Fujian Province，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350002，China；3.State Key Laboratory of Analog and Mixed Signal VLSI，University of Macau，Macau SAR，999078，China；4.Department of Electrical and Computer Engineering，F(xiàn)aculty of S&T，University of Macau，Macau SAR，999078，China）

Existing immunofluorescence chromatographic quantitative detection technology methods are mostly based on photoelectric reflex method.High precision for the strip position，and complex strip transmission unit are required in this method.In this paper，image of fluorescent immune-chromatographic strip was captured by the CMOS image sensor.A method for automatic recognition of test line and control line was proposed，In this method，seed points was chosen after the image was enhanced and initial segmented.Then the growth threshold was set via the improved two-dimensional Otsu method.Finally，the region growth algorithm was implemented to segment test line and control line.Experimental results showed that the algorithm could precisely segment the test line and con?trol line，and finally realized the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip.The experi?ments proved that the segmented test line and control line is clear，complete and had excellent performance，even in conditions of a low contrast or a changeable background.The proposed method indexes on quantitative evaluation of the segmentation result，such as Uniformity Measure（UM），Regional Contrast（CR），were both well.In the quantita?tively detect step，the coefficient variation of the measured characteristic values was less than 5%and the linearity was mare than 0.99.The experimental results shown that the method was feasible for the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip，and had wider detection limit than the comparing instrument.

fluorescent immune-chromatographic strip；image capture；region growth；two-dimensional Otsu；quan?titative detection

TP212.3

A

1004-1699（2016）09-1356-05

項(xiàng)目來源：科技部臺(tái)港澳合作項(xiàng)目（2012DFM30040）；福建省產(chǎn)學(xué)合作重大項(xiàng)目（2011Y4007）；福建省重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2014YZ0001）

2015-12-23修改日期：2016-04-29