PM2.5對(duì)人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo遷移與侵襲力的影響及機(jī)制研究

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張立文，韓斌，陳亞瓊，吳思雨，姚婷

·論著·

PM2.5對(duì)人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo遷移與侵襲力的影響及機(jī)制研究

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張立文，韓斌，陳亞瓊，吳思雨，姚婷

目的：探討PM2.5對(duì)人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-SVneo存活率以及遷移與侵襲能力的影響，尋找PM2.5致不良妊娠結(jié)局可能的機(jī)制。方法：不同濃度PM2.5染毒HTR8-SVneo細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，CCK8（Cell Counting Kit-8）法分析細(xì)胞增殖情況，最終選取0、30、60、120和200μg/mL 5個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中以0 μg/mL染毒組為對(duì)照組。激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)分析細(xì)胞遷移力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲力；qPCR和Western Blot分別檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、MMP9及其組織抑制劑TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平；明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞分泌的明膠酶MMP2和MMP9活性。結(jié)果：PM2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞增殖有顯著抑制作用（P＜0.05）；PM 2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞遷移距離和穿膜細(xì)胞數(shù)均減少（P＜0.05）；qPCR和Western Blot結(jié)果顯示，PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），且MMPs升高程度低于TIMPs；明膠酶譜結(jié)果顯示，HTR8-SVneo細(xì)胞MMP9活性在30、60、120和200μg/m L染毒組均升高（P＜0.05）。結(jié)論：PM2.5在造成HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的同時(shí)，可能通過(guò)打破MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡影響人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-SVneo的遷移與侵襲力，從而造成不良妊娠結(jié)局，而具體信號(hào)機(jī)制有待深入研究。

空氣污染物；滋養(yǎng)層；細(xì)胞遷移分析；基質(zhì)金屬蛋白酶2；基質(zhì)金屬蛋白酶9；金屬蛋白酶1組織抑制劑；金屬蛋白酶2組織抑制劑

【Abstract】Objective:To investigate the effect of PM2.5 on the survival rate，themigration ability and the invasion ability of human chorionic trophoblast cell line，HTR8-SVneo，and to explore the possiblemechanism of the adverse pregnancy outcome induced by PM2.5.Methods:The in vitro cultured HTR8-SVneo cells were treated with PM2.5.The cell proliferation was analysed by CCK8.Five concentrations of 0，30，60，120 and 200 μg/mL were selected.The cell migration was detected by Laser holographic cell analysis and imaging system，while the cell invasion by the Transwell experiment.ThemRNA and protein expressions ofMMP2，MMP9，TIMP1 and TIMP2 were measured by qPCR and Western Blot，while the activities of MMP2 and MMP9 by a gelatin zymography.Resu lts:The proliferation of HTR8-SVneo cellswas significantly inhibited by PM 2.5 treatment（P＜0.05），while themigration distance and the number of cells penetrating themembrane were decreased（P＜0.05）. The mRNA and protein expressions of MMP2，MMP9，TIMP1 and TIMP2 were significantly increased in PM2.5 exposed groups（P＜0.05），and the increased degree ofMMPswas lower than TIMPs.The activities ofMMP9 in all PM2.5 treatment groups were significantly increased when compared with the control group（P＜0.05）. Conclusions:PM 2.5 can induce the cellular damage of HTR8-SVneo cells，while PM2.5 can decrease the cell migration and invasion by inducing the imbalance between MMPs and TIMPs.These pathophysiological changes are related with the adverse pregnancy outcomes.

【Keywords】Air pollutants；Trophoblasts；Cell migration assays；Matrix metalloproteinase 2；Matrix metalloproteinase9；Tissue inhibitorofmetalloproteinase-1；Tissue inhibitorofmetalloproteinase-2

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：357-361，386）

目前，直徑≤2.5μm的可吸入顆粒物（PM2.5）對(duì)人類健康的影響成為了研究熱點(diǎn)，除造成呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病外，大量流行病學(xué)研究表明PM2.5與不良妊娠結(jié)局有關(guān)［1］。妊娠成功是依賴于滋養(yǎng)細(xì)胞適度侵入蛻膜組織促進(jìn)胚胎著床、重建細(xì)胞外基質(zhì)及血管以維持胎盤正常生理功能?；|(zhì)金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase 2，MMP2）和MMP9因可降解Ⅳ型膠原（子宮基底膜的主要成分），而在妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor ofmetalloproteinases 1，TIMP1）和TIMP2是調(diào)節(jié)上述兩種蛋白活性的關(guān)鍵酶，可通過(guò)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵入過(guò)程而將侵襲范圍限定在特定區(qū)域，這也是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性與腫瘤細(xì)胞的不同之處。正常情況下，體內(nèi)的MMPs與TIMPs間可形成動(dòng)態(tài)平衡，并在時(shí)間和空間上精確調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能［2］。研究證實(shí)，MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡一旦被破壞，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能將出現(xiàn)異常，可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜侵入過(guò)深或過(guò)淺、子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙、胎盤缺氧缺血及母體全身血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起各種不良妊娠結(jié)局及妊娠期疾病的發(fā)生，如：胎兒生長(zhǎng)受限、胚胎停育、胎盤早剝、子癇前期和妊娠期糖尿病等［3-5］。有研究表明，空氣污染物可通過(guò)胎盤直接滲透或產(chǎn)生活性產(chǎn)物對(duì)妊娠結(jié)局造成影響，尤其以可深入肺泡并沉積入血的PM2.5為主［1］。因此，本研究旨在探討PM2.5是否通過(guò)破壞MMPs/TIMPs間的動(dòng)態(tài)平衡影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與侵襲性，繼而引起流產(chǎn)、胎盤早剝等不良妊娠結(jié)局，甚至可引發(fā)絨毛膜癌、子癇等。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-SVneo細(xì)胞系由加拿大Graham教授惠贈(zèng)。

1.1.2試劑胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），CCK8（Cell Counting Kit-8）檢測(cè)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），Transwell小室（美國(guó)corning公司），基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司），細(xì)胞總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、qPCR試劑盒（北京天根生物科技公司），RIPA細(xì)胞裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），β-actin抗體、抗MMP2抗體、抗MMP9抗體、抗TIMP1抗體、抗TIMP2抗體、辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（英國(guó)Abcam公司），化學(xué)發(fā)光HRP底物（美國(guó)西美杰科技有限公司）。qPCR引物序列如下，MMP2上游：5′-ATAACCTGGATGCCG TCGTGGA-3′，下游：5′-AAGCAGCCTAGCCAGTCGGATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：139 bp。MMP9上游：5′-GGCACCACCA CAACATCACCTA-3′，下游：5′-CGGGCAAAGGCGTCGTCA AT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：82 bp。TIMP1：上游：5′-TGGCTTCT GGCATCCTGTTGTT-3′，下游：5′-ACGCTGGTATAAGGTG GTCTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：161 bp。TIMP2上游：5′-ACGA GTGCCTCTGGATGGACTG-3′，下游：5′-GCACAGGAGC CGTCACTTCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：97bp。GAPDH上游：5′-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′，下游：5′-TTAAAAGCAGCC CTGGTGACC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：115 bp。

1.1.3儀器TH-1000C型空氣采樣器（武漢天虹儀器有限責(zé)任公司），CO2恒溫三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司），超凈工作臺(tái)（新加坡藝思高科技有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)（瑞典Phiab公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），PikoReal Real-Time PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）。

1.2方法

1.2.1PM2.5懸濁液的配置中國(guó)環(huán)境科學(xué)院提供儀器和技術(shù)支持，利用玻璃纖維濾膜，使用TH-1000C型空氣采樣器采集2015年11月天津醫(yī)科大學(xué)周圍大氣中的PM 2.5顆粒物，吸氣流量約為1.2m3/min，1次連續(xù)采樣24 h。

將吸附有PM2.5的石英濾膜剪成1 cm×1 cm的方塊，置于250mL的廣口玻璃瓶中，加入100mL超純水，將盛有剪好的濾膜和超純水的廣口瓶置于超聲波清洗儀中，4℃恒溫，超聲清洗60min后用8層紗布過(guò)濾，將濾液4℃，12 000 r/min，30 min離心棄上清，沉淀真空冷凍干燥24 h，凍干后PM2.5呈灰黑色絮狀物，紫外照射0.5h后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配置成20mg/m L的染毒母液。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)HTR8-SVneo細(xì)胞用含有10%胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS），1%谷氨酰胺，1%丙酮酸鈉，1%青-鏈霉素，1%4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，10%O2，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔密度接種細(xì)胞于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，1500 r/min，離心5min，棄上清，實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度染毒溶液（10、20、40、60、80、100、120、160和200μg/mL PM2.5）培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每孔加入20μLCCK8，孵育3 h后，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)A450吸光度值。存活率=（實(shí)驗(yàn)組-空白對(duì)照組）/（陰性對(duì)照組-空白對(duì)照組）×100%。

1.2.4全息細(xì)胞儀分析PM2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞遷移力的影響常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔密度接種細(xì)胞于6孔板常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度染毒溶液（0、30、60、120和200μg/mLPM2.5）后，用激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)24 h中的細(xì)胞遷移情況。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞侵襲力的影響Matrigel基質(zhì)膠以1∶8比例用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后加入到小室中，將小室放入孵箱4～5 h直至Matrigel基質(zhì)膠凝固。常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，上室加入由200μL無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基配置的染毒液，且每個(gè)上室含有105個(gè)細(xì)胞，下室加入600μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h，吸去上室液體，用棉簽輕輕拭去上室中的細(xì)胞后，PBS洗小室2次，無(wú)水甲醇固定進(jìn)入下室的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色1～2min后鏡下計(jì)數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6qPCR檢測(cè)MMP2、MMP9及其抑制劑TIMP1、TIMP2的基因表達(dá)水平常規(guī)收集各組細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，RNA的濃度= OD260×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL（比色皿光徑1 cm）。利用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用real-Time PCR試劑盒將cDNA擴(kuò)增為雙鏈DNA，反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)PCR擴(kuò)增儀得到的結(jié)果計(jì)算出各基因相對(duì)表達(dá)水平，其中以GAPDH作為內(nèi)源性參照。

1.2.7Western Blot檢測(cè)MMP2、MMP9及其抑制劑TIMP1、TIMP2的蛋白表達(dá)水平常規(guī)收集各組細(xì)胞，加入400μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，超聲破碎細(xì)胞，4℃，12 000 r/min，離心10min后取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩CA蛋白定量，60μg蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）電泳分離，經(jīng)0.22μm硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2（1∶1 000）稀釋溶液孵育膜，4℃孵育過(guò)夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液加Tween（Tris Buffered saline Tween，TBST）洗膜5min×3次，HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）稀釋溶液孵育，TBST洗膜10min×4次，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，ScnImage軟件進(jìn)行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參。

1.2.8明膠酶譜法檢測(cè)MMP2、MMP9活性將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分別設(shè)立0μg/m L組（對(duì)照組）、30μg/mL組、60μg/mL組、120μg/mL組、200μg/mL組。染毒24 h后用無(wú)菌PBS清洗各孔，每孔加入2mL無(wú)血清1640培養(yǎng)基24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)以校正蛋白上樣量；4℃，100 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，直至溴酚藍(lán)跑至膠外，切取包含72 ku、92 ku合適大小的膠，洗脫液（2.5% TritonX-100，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L CaCl2，1 mmol/L ZnCl2）中洗脫2次，每次45min，漂洗液（50mmol/L Tris-HCl，5 mmol/LCaCl2，1mmol/LZnCl2，0.02%Brij-35）中漂洗2次，每次20min，孵育液中37℃孵育48 h，染色液（0.05%R-250，30%甲醇，10%乙酸）中搖床震蕩染色3 h，將膠依次置入脫色液（A液，甲醇∶乙酸∶ddH2O=2∶1∶6；B液，甲醇∶乙酸∶ddH2O=2∶1∶7；C液，甲醇∶乙酸∶ddH2O=2∶1∶17）中，分別震蕩脫色0.5 h、1 h和2 h。在72 ku、92 ku處觀察條帶，凝膠經(jīng)掃描儀成像捕捉照片，圖像分析系統(tǒng)讀取各條帶面積和灰度值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CCK 8檢測(cè)PM 2.5對(duì)細(xì)胞增殖的影響各組間細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.30，P＜0.05），在60～120μg/m L濃度范圍PM2.5可抑制HTR8-SVneo細(xì)胞增殖，且高濃度抑制作用顯著，見(jiàn)圖1。

圖1　PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞增殖活力的影響

2.2全息細(xì)胞儀分析PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞遷移力的影響各組HTR8-SVneo細(xì)胞遷移力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.97，P＜0.05），120μg/mL和200μg/mL濃度的PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞遷移距離減小，見(jiàn)圖2。

圖2　PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞遷移力的影響

2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞侵襲力的影響0、30、60、120和200μg/mL濃度組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為295.0±9.6、220.0±13.2、117.0± 8.2、82.0±12.0和63.0±11.6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 401.3，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，其他各組穿膜細(xì)胞數(shù)減少，穿膜能力減弱，見(jiàn)圖3和圖4。

圖3　不同濃度PM 2.5的Transwell小室細(xì)胞穿膜情況（正置熒光顯微鏡×200）

圖4　PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞侵襲力的影響

2.4qPCR檢測(cè)PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞中MMP2、MMP9以及組織抑制蛋白TIMP1、TIMP2水平的影響PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞中MMP2、 MMP9、TIMP1、TIMP2基因水平上調(diào)（P＜0．05）。MMP2mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的1．15、1．23、1．46、1．59倍（F＝5．89，P＜0．05）；MMP9mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的1．13、1．44、1．57、1．90倍（F＝87．06，P＜0．05）；TIMP1 mRNA分別是對(duì)照組的1．15、1．68、2．04、3．10倍（F＝195．00，P＜0．05）；TIMP2mRNA分別是對(duì)照組的1．37、1．87、2．30、3．46倍（F＝311．30，P＜0．05），并且TMP1、TIMP2的上調(diào)程度分別高于MMP9與MMP2，見(jiàn)圖5。

2.5Westem Blot檢測(cè)PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞中MM P2、MM P9以及組織抑制蛋白TIMP1、TIMP2表達(dá)水平的影響PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞中MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（F分別為7.30和17.33，P＜0.05），且呈劑量依賴性；各組細(xì)胞中TIMP1和TIMP2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為43.35和26.04，P＜0.05），與對(duì)照組相比，200μg/ mL PM2.5染毒組TIMP1表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），60、120和200μg/mLPM2.5染毒組中TIMP2表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖5　qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞MMP2、MMP9、TIMP1以及TIMP2表達(dá)水平

圖6　W estern Blot檢測(cè)各組MMP2、MM P9、TIMP1及TIMP2表達(dá)水平

2.6明膠酶譜法檢測(cè)MMP2、MMP9活性對(duì)照組與不同濃度PM2.5組在92 ku與72 ku處均有透明條帶，見(jiàn)圖7A。MMP2活性在各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.82，P＞0.05）；PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞中MMP9活性升高（F=73.49，P＜0.05），見(jiàn)圖7B。

圖7　明膠酶譜法檢測(cè)不同濃度PM 2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞MMP2、MMP9酶活性的影響

3　討論

人類胚胎著床類似于腫瘤的侵入過(guò)程，具有一定侵襲性的滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷侵入母體子宮內(nèi)膜，同時(shí)子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)也不斷發(fā)生降解和重建并伴隨有大量血管發(fā)生。滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的適度侵襲，在成功妊娠過(guò)程中起重要作用。對(duì)環(huán)境污染物調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為的機(jī)制研究，將有利于闡明環(huán)境污染物與滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育不良性疾病導(dǎo)致的不良妊娠結(jié)局之間的關(guān)系，為這些疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。HTR8-SVneo細(xì)胞是永生化的人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞，因?yàn)槠涔δ芎捅硇投己芙咏谠隗w滋養(yǎng)細(xì)胞，故很多學(xué)者應(yīng)用該細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究多種不良妊娠結(jié)局及妊娠期疾病的相關(guān)機(jī)制［6-8］。本研究以HTR8-SVneo細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞的增殖能力有一定影響，且高濃度抑制作用顯著，與許多同類研究結(jié)果類似［9-10］。滋養(yǎng)細(xì)胞的正常增殖與分化是胎盤形成的先決條件，PM2.5可通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力而阻礙正常妊娠過(guò)程。苯并芘（BaP）是一種廣泛存在于空氣、水體中的持久性有機(jī)污染物，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BaP可損傷HTR8-SVneo細(xì)胞DNA，造成其凋亡，使細(xì)胞存活率下降［7-8］，而B(niǎo)aP是PM2.5中多環(huán)芳烴類污染物的代表，進(jìn)一步說(shuō)明了PM2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞的損傷作用。

滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力主要依賴MMPs和其特異性抑制因子TIMPs之間形成動(dòng)態(tài)平衡，這樣既有利于胚胎著床，又限制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲范圍，若二者之間的平衡被破壞則可能會(huì)造成病理妊娠的發(fā)生。研究表明，在眾多MMPs家族中，明膠酶家族MMP2和MMP9及其抑制因子TIMP1和TIMP2在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮的作用最大。因此人們開(kāi)始更多地關(guān)注MMPs/TIMPs對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。已有研究表明，細(xì)胞侵襲力與MMPs/TIMPs關(guān)系密切，并且MMPs/TIMPs受多種因素調(diào)控，例如，Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子可增強(qiáng)TIMP1的表達(dá)和分泌，減弱MMP2和MMP9的活動(dòng)，從而阻止細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的退化，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲［11］。惡性腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的上游因子調(diào)節(jié)細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲力［12］。鈣結(jié)合蛋白S100P能夠通過(guò)MMP2和P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖力、遷移力和侵襲力［13］。曲古霉素（TSA）可抑制MMP2、MMP9和尿激酶型纖溶酶原（uPA）的表達(dá)，同時(shí)激活其抑制劑TIMP1和TIMP2，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵入［14］。除了以上化學(xué)因子作用外，張娟等［15］利用150mV/mm的直流微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，由此發(fā)現(xiàn)生理性微電場(chǎng)能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲力，且可能與MMP2表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)。隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，環(huán)境污染物也成為了危害女性生殖系統(tǒng)健康的主要因素，研究發(fā)現(xiàn)HTR8-SVneo細(xì)胞在BaP影響下，MMP2、MMP9表達(dá)增加，提示其功能和活性隨著B(niǎo)aP濃度劑量的增加，其活性和功能呈現(xiàn)劑量依賴性下降［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)100μmol/L以上濃度的增塑劑鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）通過(guò)P38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路上調(diào)MMP2、MMP9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HTR-8/ SVneo細(xì)胞侵襲和遷移［17］。本研究通過(guò)對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞24 h運(yùn)動(dòng)路線的追蹤和12 h穿膜情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的PM2.5會(huì)造成HTR8-SVneo細(xì)胞遷移性及侵襲性減弱；PM2.5會(huì)使HTR8-SVneo細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，且MMPs的表達(dá)上調(diào)程度低于TIMPs，這證實(shí)了PM2.5可打破HTR8-SVneo細(xì)胞中MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致該細(xì)胞遷移性減弱，并削弱其對(duì)子宮內(nèi)膜的侵襲力。

綜上所述，PM2.5對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞有一定毒性作用，且可能與染毒濃度有關(guān)；PM2.5可使HTR8-SVneo細(xì)胞遷移與侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9及其組織抑制因子TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平同時(shí)升高并影響MMPs的蛋白活性。由此推測(cè)，PM2.5在造成HTR8-SVneo細(xì)胞損傷的同時(shí)，通過(guò)打破MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡影響人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-SVneo的遷移與侵襲力，從而造成不良妊娠結(jié)局。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明PM2.5對(duì)人類生殖的影響積累資料，為環(huán)境導(dǎo)致的出生缺陷的預(yù)防尋找新的線索，為人類生殖健康研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of PM 2.5 on M igration and Invasion of Human Chorionic Trophoblast Cells and its Mechanism

QIN Zhe，HOU Hai-yan，XU Zhong-wei，ZHANG Li-wen，HAN Bin，CHEN Ya-qiong，WU Si-yu，YAO Ting.
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese Peop le′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（QIN Zhe，HOU Hai-yan，CHEN Ya-qiong，WU Si-yu，YAO Ting）；Peking Union Medical College Hospital，China Academy of Sciences，Beijing 100730，China（HOU Hai-yan）；C entral Laboratory，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（XU Zhong-Wei）；School of Public Health，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China（ZHANG Li-wen）；State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Scienc es，Beijing 100012，Chi na（HAN Bin）
Corresponding author:CHEN Ya-qiong，E-mail:chenyq82@hotmail.com

2016-06-14）

［本文編輯秦娟］

國(guó)家自然科學(xué)基金（81402691）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（15JCZDJC36000）

300162天津，中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（秦喆，侯海燕，陳亞瓊，吳思雨，姚婷）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院（侯海燕）；中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室（徐忠偉）；天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（張立文）；中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（韓斌）

陳亞瓊，E-mail:chenyq82@hotmail.com