生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)物性能研究

石金禮，張言誠，張力浩，周　靜，周麗娜，李輝信，胡　鋒，徐　莉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)物性能研究

石金禮，張言誠，張力浩，周靜，周麗娜，李輝信，胡鋒，徐莉*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

篩選獲得一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，經(jīng)生理生化與16S rDNA鑒定，獲得菌株為銅綠假單胞菌147（Pseudomonas aeruginosa 147）。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過薄層色譜、紅外掃描分析其發(fā)酵產(chǎn)物為糖脂類生物表面活性劑（Biosurfactant，BS），單因素最佳發(fā)酵條件優(yōu)化為碳源、氮源和碳氮比分別為花生油、硫酸銨和25∶1，最佳培養(yǎng)溫度為30℃，pH值為8，NaCl濃度為5 g·L-1。在最佳條件下培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液的表面張力值比原來降低了42.08 mN·m-1，且能平穩(wěn)保持至144 h。在108 h細菌生物量最大，為2.63 g·L-1，此時產(chǎn)生的糖脂最多，可達2.02 g·L-1。生物表面活性劑對不同環(huán)數(shù)的多環(huán)芳烴類物質(zhì)（熒蒽、芘、苯［a］芘）的增溶效果實驗表明：隨生物表面活性劑添加量的增大，不同PAHs溶解度均增大；相同濃度生物表面活性劑添加條件下，高環(huán)多環(huán)芳烴（苯［a］芘）的增溶效果低于低環(huán)多環(huán)芳烴（熒蒽、芘）。

生物表面活性劑；多環(huán)芳烴；發(fā)酵條件優(yōu)化；增溶

石金禮，張言誠，張力浩，等.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)物性能研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2016，35（9）：1717-1726.

SHI Jin-li，ZHANG Yan-cheng，ZHANG Li-hao，et al.Screening of a biosurfactant-producing bacterium and biosurfactant characteristics［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1717-1726.

多環(huán)芳烴（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是一類由2個或2個以上苯環(huán)組成的稠環(huán)化合物。其水溶性低，易吸附于固體顆粒，能夠長期存在于環(huán)境中，是一類持久性有機污染物［1-2］，也是美國國家環(huán)境保護局（U.S.Environmental Protection Agency）確定的優(yōu)先控制的污染物。由于PAHs高脂溶性，低生物可利用性，使得人們將其用于環(huán)境中的修復(fù)措施和效果存在局限。因此通過利用表面活性劑的膠團化作用，顯著提高疏水性有機化合物在水相中的表觀溶解度，從而提高其生物有效性，促進修復(fù)效果的表面活性劑強化修復(fù)技術(shù)（Surfactant enhanced remediation，SER）引起人們的關(guān)注［3-5］。

目前在有機污染修復(fù)過程中使用的多為化學(xué)表面活性劑。由于化學(xué)表面活性劑不易降解、易造成二次污染、對土壤微生物產(chǎn)生毒害風(fēng)險，限制了其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用［6］。生物表面活性劑以其具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液等的作用，其主要成分糖脂、磷脂、脂蛋白或脂肽類化合物、高分子化合物和脂多糖，能夠被生物完全降解，安全無毒，且用量少，發(fā)酵成本低，逐漸成為研究熱點［7］。已有文獻報道通過篩選產(chǎn)表面活性劑的細菌，并將其應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染的修復(fù)［8］。

生物表面活性劑合成方式包括動植物細胞內(nèi)提取法、酶合成法、微生物發(fā)酵法。然而，動植物細胞內(nèi)提取法受到原料來源的制約，難以大規(guī)模生產(chǎn)，酶合成法所用酶制劑的價格亦極大限制了其發(fā)展。相比而言，微生物發(fā)酵以其生產(chǎn)工藝簡單、經(jīng)濟安全的特點，成為重要的生物表面活性劑來源。目前，已有很多微生物被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，如細菌類球擬酵母（Torulopsis bombicola）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerug-inosa）［9］，其中銅綠假單胞菌已有Pseudomonas cepacia CCT6659［10］、Pseudomonas aeruginosa S6［11］等見諸報道。它們產(chǎn)生的生物表面活性劑是目前在多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)，石油污染修復(fù)等應(yīng)用較多［12］，生物表面活性劑在增溶多環(huán)芳烴時具有生物降解性、低毒性、適應(yīng)極端環(huán)境的優(yōu)勢［13］。

本研究以PAHs為目標(biāo)污染物，篩選產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，并分析發(fā)酵產(chǎn)物為生物表面活性劑，優(yōu)化發(fā)酵條件，探討菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑對典型多環(huán)芳烴熒蒽、芘、苯［a］芘的增溶作用，研究結(jié)果將為PAHs污染環(huán)境的修復(fù)技術(shù)研究提供菌株資源和基礎(chǔ)理論支撐。

1　材料與方法

1.1供試土壤

采集南京煉油廠附近土樣、北京某加油站附近土樣、南京某河底淤泥和南京某湖底淤泥為土壤樣品。

1.2供試培養(yǎng)基與試劑

富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO410.00 g，KCl 1.10 g，KH2PO43.40 g，K2HPO44.40 g，MgSO40.50 g，EDTA 1.00 g，酵母粉0.50 g，液體石蠟5.00 mL，pH 7.0～7.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，用蒸餾水定容到1.00 L。

LB液體培養(yǎng)基：10.00 g蛋白胨，5.00 g酵母粉，10.00 g氯化鈉，用無菌水定容至1.00 L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基加入15.00～ 20.00 g瓊脂粉。

無機鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.00 g，NaCl 10.00 g，KH2PO40.20 g，K2HPO40.80 g，MgCl20.50 g，CaCl20.05 g，F(xiàn)eCl20.01 g。

血平板培養(yǎng)基：購自南京便診生物科技有限公司。

實驗試劑：甲醇為色譜純，花生油為食用級，其他試劑均為分析純。

1.3細菌篩選和鑒定

1.3.1表面活性劑產(chǎn)生菌血平板初篩

取5.00 g新鮮土樣置于裝有45 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)液混濁后，吸取5 mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新的富集培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3次。后經(jīng)濃度梯度稀釋，100μL涂布于血平板，30℃培養(yǎng)48h，選擇透明圈較大的菌落，分離純化，4℃保存。

1.3.2表面張力儀復(fù)篩

將上述純化的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1、30℃培養(yǎng)96 h后，用表面張力儀測定細菌發(fā)酵液的表面張力［14］。

1.3.3細菌鑒定

基于細菌形態(tài)與生理生化結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》做出初步鑒定。同時將菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心法收集菌體，并采用SDS-CTAB法提取總基因組DNA，以細菌通用引物27F和1492R進行16S rDNA的PCR擴增，運用分子學(xué)鑒定菌株［15］。

1.4生物表面活性劑的提取、鑒定和臨界膠束濃度測定

取培養(yǎng)72 h的細菌發(fā)酵液在4℃、5000×g離心30 min，取上清液用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，然后加入等體積的三氯甲烷/甲醇（2∶1，V∶V）混勻，萃取三次合并有機相，用無水硫酸鈉干燥后，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得到淺黃色漿狀物，即為生物表面活性劑粗產(chǎn)物［10］。

薄層色譜：取0.2 g提取的上述粗產(chǎn)物溶于1 mL的氯仿中，點樣于硅膠G板進行薄層色譜分析，三氯甲烷/甲醇/水（65∶15∶1，V∶V）為展開劑，用不同的顯色劑顯色。（1）苯酚-硫酸試劑：3 g苯酚與5 mL硫酸溶解于95 mL乙醇中，如果顯棕色斑點，則有糖脂存在，反之糖脂不存在；（2）茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，如果斑點顯紅色，則有脂肽存在，反之脂肽不存在［16-17］。

紅外掃描分析（Fouriertransforminfraredspectrometer，F(xiàn)T-IR）：將生物表面活性劑粗產(chǎn)品溶于三氯甲烷后，在制備型硅膠薄板上進行分離，依照顯色帶位置刮下目的硅膠層，用三氯甲烷/甲烷（1∶1，V∶V）提取后于40℃下減壓蒸干，得到部分純化的生物表面活性劑。將上述生物表面活性劑溶于甲醇，采用KBr壓片法（1～2 mg樣品+200 mgKBr，干燥處理后研細），混合壓成透明薄片后紅外掃描分析測定［18-20］。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度測定（Critical micelle concentration，CMC）：精確稱取上述提取所得的產(chǎn)物粗品溶于蒸餾水中，配制成不同濃度梯度（0～500 mg·L-1）的產(chǎn)物溶液，測定溶液的表面張力，并依據(jù)表面活性劑濃度-表面張力曲線求得臨界膠束濃度值。

1.5細菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1測定指標(biāo)

發(fā)酵液表面張力值以吊環(huán)法測定［21］，乳化性能采用超聲體積比法測定［22］。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集菌體，于105℃烘干至恒重后稱重，以菌體干重表示生物量。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取2次后，45℃減壓蒸干，將殘余物溶于等體積的0.05 mol·L-1NaHCO3中，以硫酸苯酚法［23］測定糖脂含量。

1.5.2碳源對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL無機鹽培養(yǎng)基，分別加入10 g·L-1的葡萄糖、甘油、花生油、可溶性淀粉、液體石蠟、麥芽糖、乳糖、蔗糖（對照組不加碳源）。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.3氮源對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

以碳源實驗中獲得的最優(yōu)碳源作為選定碳源，取10 g碳源加入1 L不含（NH4）2SO4無機鹽培養(yǎng)基中。取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述培養(yǎng)基，分別加入2 g·L-1的硝酸鈉、硫酸銨、脲、硝酸銨（對照組不加氮源）。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.4碳氮比對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL含不同碳氮源的無機鹽培養(yǎng)基。固定氮源為2 g·L-1，分別加入已優(yōu)化的碳源，控制比例為1、5、10、15、20、25、30、35、40（對照組不加氮源）。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.5溫度對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無機鹽培養(yǎng)基?？刂茡u床溫度在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.6 pH對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無機鹽培養(yǎng)基?？刂婆囵B(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.7NaCl濃度對菌株生長及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無機鹽培養(yǎng)基?？刂婆囵B(yǎng)基NaCl濃度為0、5、10、15、20、25、30、50、80、120、160 g·L-1。3 d后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.5.8菌株147發(fā)酵動態(tài)圖

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無機鹽培養(yǎng)基。在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h后分別測定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重復(fù)。

1.6生物表面活性劑對多環(huán)芳烴增溶效果

25 mL三角瓶中加入過量的苯并［a］芘、芘、熒蒽和10 mL不同濃度的生物表面活性劑粗產(chǎn)物溶液，然后加入0.02%的疊氮化鈉抑制微生物的生長。蓋好塞子并用封口膜封口后，25℃、50 r·min-1振蕩48 h后，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中5000 r·min-1離心15 min，取上清液加入等體積的二氯甲烷∶正己烷=1∶1（V∶V）萃取3次，收集洗脫液并于40℃濃縮至干，用甲醇定容到2 mL，過0.22 μm孔徑濾膜后HPLC分析［24］。

2　結(jié)果與討論

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

經(jīng)過血平板初篩得到25株菌株，表1是表面張力儀復(fù)篩結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)147號細菌發(fā)酵液的張力值明顯低于其他菌株，選擇147細菌作為目標(biāo)菌株。

觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征，可見菌體細長且長短不一，菌落較小，為扁平、濕潤的菌落。部分生理生化指標(biāo)如表 2。經(jīng) 16S rDNA測試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%，采用MEGA 5.10軟件NJ方法構(gòu)建147的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。結(jié)合生理生化特征結(jié)果，將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株 GenBank登錄號為KU921686。

表1　細菌復(fù)篩結(jié)果Table 1 Bacterium screening

表2　147菌株的生理生化特性Table 2 Physiological characteristics of strain 147

2.2147細菌產(chǎn)生表面活性劑的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

通過薄層色譜分析顯示，苯酚-硫酸試劑有棕色斑點，加入茚三酮顯色劑則無明顯變化。這說明該菌株主要產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生少量的脂肽類物質(zhì)。

將菌株147產(chǎn)物提純，紅外光譜儀（FT-IR）分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2。該物質(zhì)在3701.72cm-1處有吸收峰，表明分子中有羥基存在；2 858.77～2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類C-H的伸縮振動，1400～1200 cm-1處是C-H變角振動，1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動，而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動，因此該物質(zhì)中有一個五元環(huán)狀內(nèi)酯和糖苷鍵存在。由此進一步證明該生物表面活性劑含糖脂類物質(zhì)。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度（Critical micelle0.005 concentration，CMC）可以作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC越小，改變表/界面性質(zhì)，起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出：糖脂在0～300 mg·L-1時，表面張力值隨著糖脂濃度的升高而降低，且在300 mg·L-1時達到最小值；在300～500 mg·L-1時，表面張力值變化不大?？傻冒l(fā)酵粗提產(chǎn)物的CMC為300 mg·L-1，明顯低于普通化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的2200 mg·L-1［25］，能在較低濃度下使用，因而在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)具有廣闊應(yīng)用前景。

圖1　147菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree established using the neighbor-joining method，based on 16S rDNA sequence of strain 147 and the related strains

圖2　147菌株產(chǎn)的生物表面活性劑紅外光譜圖Figure 2 Fourier transform infrared spectrum of biosurfactant produced by strain 147

圖3　不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力Figure 3 Surface tensions of biosurfactant solution at different concentrations

2.3147細菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1碳源的影響

碳源對細菌的生長與發(fā)酵產(chǎn)物量有重要影響。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可在多種類型碳源下產(chǎn)生生物表面活性劑，包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知，以花生油為碳源，細菌發(fā)酵液的降低值為39.12 mN·m-1，明顯高于其他碳源類型；乳化值為34.17%，稍高于其他碳源，此時細菌生物量最大，糖脂含量最高，為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源，能夠促進菌株產(chǎn)生更多生物表面活性劑，但如果用于實際生產(chǎn)，成本相對較高，近年來一些研究者嘗試使用成本較低的工業(yè)副產(chǎn)物如糖蜜、廢潤滑油等作為碳源，發(fā)現(xiàn)也具有很好的促進微生物產(chǎn)生生物表面活性劑的作用［26］。因此，后期會考慮選擇用一些低成本碳源進行發(fā)酵。

2.3.2氮源的影響

細胞表面的物質(zhì)合成需要氮源，氮源的種類會對細菌細胞的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生很大影響［27］。由表4可以看出，不同氮源對細菌發(fā)酵過程中表面張力降低值的影響較小，可能與發(fā)酵液中的生物表面活性劑含量已經(jīng)達臨界膠束濃度（CMC）有關(guān)［28-29］。當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時發(fā)酵液表面張力降低值最大，同時乳化性、細菌干重、糖脂含量均達到最大值。這與錢曉勇等［30］研究結(jié)果一致，硫酸銨是促進生物表面活性劑生成的較好氮源。

表3　碳源對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of carbon sources on growth and biosurfactant production by strain 147

表4　氮源對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of nitrogen source on growth and biosurfactant production by strain 147

2.3.3碳氮比的影響

由表5可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比在5以上時，表面張力降低值與乳化性變化不大，而細菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同，說明當(dāng)碳氮比大于5時，該菌株生物表面活性劑產(chǎn)量已經(jīng)超過臨界膠束濃度。細菌干重在碳氮比為25時最大，為2.58±0.09 g·L-1，同時生物表面活性劑含量也達到最大，為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等［26］研究結(jié)果一致，25是147菌株的最適生長碳氮比，此時細菌的生物量達到最高，生物表面活性劑產(chǎn)量也最高。

2.3.4溫度的影響

溫度是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。不同細菌的最適生長溫度不同。一般細菌在4℃停止生長，在30℃左右生長良好。已報道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）最適溫度一般在27～37℃［31-32］。由圖4可以看到，表面張力值、生物量和生物表面活性劑產(chǎn)量都隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在30℃時達到最大。乳化性在15℃到30℃時保持相對穩(wěn)定，在30℃到40℃時乳化性降低。實際上大多數(shù)銅綠假單胞菌的最佳培養(yǎng)溫度都在27～37℃［31］，與實驗結(jié)果相符。

圖4　溫度對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 4 Effect of temperature on growth and biosurfactant production by strain 147

表5　碳氮比對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of C∶N ratio on growth of and biosurfactant production by strain 147

2.3.5pH的影響

pH值也是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的因素之一。由圖5可見，細菌的生物量在pH=8的時候達到最大，且在pH8～10的時候基本平穩(wěn)；表面張力值、生物表面活性劑含量與乳化性均在pH=8的時候達到最大值，兩側(cè)均有不同程度的下降。因此該菌株傾向偏堿性的條件生存，與強婧等［11］篩選的Pseudomonas aeruginosa S6最適pH一致。綜合其他報道的生物表面活性劑產(chǎn)生菌的最適pH范圍，大部分微生物都在pH6.2～8之間。

2.3.6NaCl濃度的影響

圖5　pH對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 5 Effect of pH on growth of and biosurfactant production by strain 147

圖6　NaCl濃度對147細菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 6 Effect of NaCl concentrations on growth of and biosurfactant production by strain 147

NaCl濃度通過改變細胞滲透壓影響微生物的生長與代謝［33-34］，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖6可見，鹽濃度在0～5 g·L-1之間，細菌生長受到促進，而當(dāng)鹽濃度大于5 g·L-1時，細菌的生長受到抑制，糖脂量與生物量趨勢一致。菌株的生物量、生物表面活性劑量、表面張力值與乳化性均在鹽濃度為5 g·L-1時呈現(xiàn)最大，說明該菌株具有一定的耐鹽性，與強婧等［11］研究的生物表面活性劑產(chǎn)生菌Pseudomonas aeruginosa S6也能夠耐鹽相似。此外，本菌株在最高為25 g·L-1的鹽濃度條件下依然能夠存活，但此時已不能產(chǎn)生更多的生物表面活性劑。

2.3.7細菌發(fā)酵動態(tài)

在上述花生油25 mL·L-1為碳源、硫酸銨1 g·L-1為氮源、NaCl濃度為5 g·L-1、pH=8、溫度保持為30℃的最佳培養(yǎng)條件下，追蹤細菌147的發(fā)酵動態(tài)（圖7）。菌株經(jīng)過短暫的延滯期后進入對數(shù)生長期，108 h后進入穩(wěn)定增長期，此時菌體所產(chǎn)生的生物表面活性劑含量達到最大，此后生物表面活性劑含量減少，可能是因為后期培養(yǎng)基內(nèi)的碳源已經(jīng)用盡，細菌開始以胞外分泌物糖脂為碳源維持生命。而表面張力值與乳化性在24 h后達到最大，之后維持在穩(wěn)定水平，說明細菌在24 h后產(chǎn)生的生物表面活性劑已到達生物表面活性劑的臨界膠束濃度，此后生物表面活性劑產(chǎn)量還會增加，但是表面張力降低值與乳化性只維持在一定范圍內(nèi)波動。

圖7　銅綠假單胞菌147菌株的發(fā)酵動態(tài)Figure 7 Dynamic curves of Pseudomonas aeruginosastrain 147 fermentation

最佳培養(yǎng)條件下，本實驗細菌生物量最高能達到5.22 g·L-1（表6），生物表面活性劑量達到5.09 g·L-1。相對已報道的幾株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）合成生物表面活性劑的產(chǎn)率在2.12～15.92 g·L-1范圍內(nèi)，本菌株的產(chǎn)表面活性劑能力居中。

表6　幾株銅綠假單胞菌合成生物表面活性劑的產(chǎn)率比較Table 6 Comparison of biosurfactant production by several Pseudomonas aeruginosa strains

2.4生物表面活性劑對多環(huán)芳烴增溶效果

圖8是水相中多環(huán)芳烴（苯并［a］芘、芘、熒蒽）的表觀溶解度隨著生物表面活性劑濃度的變化曲線，當(dāng)生物表面活性劑濃度大于300 mg·L-1時，各多環(huán)芳烴的濃度隨生物表面活性劑濃度增大而增大。這是由于生物表面活性劑在CMC（臨界膠束濃度）以上時會形成膠束，而膠束內(nèi)的疏水性微環(huán)境對疏水性有機溶劑具有較強的分配作用，可顯著增大溶質(zhì)的表觀溶解度［40］；當(dāng)生物表面活性劑濃度低于CMC時，生物表面活性劑分子以單體形式存在，單分子的表面活性劑對被增溶物的分配作用很弱，因而各多環(huán)芳烴在水中的溶解度變化不大或者輕微增加。

此外，由圖8可得生物表面活性劑對三種多環(huán)芳烴均具有增溶效果，且在0～300 mg·L-1增溶效果不明顯，在300～500 mg·L-1增溶明顯；四環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五苯環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低，與楊建剛等［41］的研究結(jié)果一致。這可能的原因是與多環(huán)芳烴的正辛醇-水分配系數(shù)（Octanol-water partioning coefficient，Kow）相關(guān)，熒蒽Kow＜芘Kow＜苯并［a］芘Kow［42］，即Kow值越大的多環(huán)芳烴，增溶效果越低。

圖8　生物表面活性劑多環(huán)芳烴的增溶作用Figure 8 Solubilization of polycyclic aromatic hydrocarbons by biosurfactant

3　結(jié)論

本研究篩選獲得了一株產(chǎn)生生物表面活性劑的147菌株，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物主要為糖脂類生物表面活性劑。以產(chǎn)生物表面活性劑量的能力為指標(biāo)，在本研究的發(fā)酵條件下，該菌株的最適碳、氮源分別為花生油與硫酸銨，最適碳氮比為25∶1，最適發(fā)酵溫度為30℃，最適鹽濃度為5 g·L-1，最適pH值為8。在上述最適培養(yǎng)條件下，該菌株的細菌生物量最高達到5.22 g·L-1，生物表面活性劑量達到5.09 g·L-1，而且該細菌能夠在偏堿性（pH值為8～13）條件下生存，具有耐鹽堿的特性。多環(huán)芳烴的溶解度隨表面活性劑的濃度增大而增大，生物表面活性劑對三環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低。實驗表明，147菌株產(chǎn)生物表面活性劑性能突出，可進一步研究用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。生物表面活性劑對多環(huán)芳烴污染土壤具有增溶效果，該菌株可接入多環(huán)芳烴污染的土壤增溶多環(huán)芳烴促進土著微生物修復(fù)。該菌株具有耐鹽、耐堿等特性，應(yīng)用前景廣闊。

［1］Hadibarata T，Kristanti R A.Fate and cometabolic degradation of benzo ［a］pyrene by white-rot fungus Armillaria sp.F022［J］.Bioresource Technology，2012，107：314-318.

［2］Quilliam R S，Rangecroft S，Emmett B A，et al.Is biochar a source or sink for polycyclic aromatic hydrocarbon（PAH）compounds in agricultural soils［J］.GCB Bioenergy，2013，5（2）：96-103.

［3］程國玲，李培軍，王鳳友，等.多環(huán)芳烴污染土壤的植物與微生物修復(fù)研究進展［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003，4（6）：30-36.

CHENG Guo-ling，LI Pei-jun，WANG Feng-you，et al.The progress of phytoremediationandmicrobialremediationonPAHscontaminatedsoil［J］. Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control，2003，4（6）：30-36.

［4］Zhu L，Zhang M.Effect of rhamnolipids on the uptake of PAHs by ryegrass［J］.Environmental Pollution，2008，156（1）：46-52.

［5］郭利果，蘇榮國，梁生康，等.鼠李糖脂生物表面活性劑對多環(huán)芳烴的增溶作用［J］.環(huán)境化學(xué)，2009，28（4）：510-514.

GUO Li-guo，SU Rong-guo，LIANG Sheng-kang，et al.Solubilization of polycyclic aromatic hydrocarbons by rhamnolipid biosurfactant［J］.Environmental Chemistry，2009，28（4）：510-514.

［6］李玉瑛，李冰.假單胞菌L-01產(chǎn)表面活性劑的性能分析［J］.環(huán)境工程學(xué)報，2010，4（11）：2575-2578.LI Yu-ying，LI Bing.Performance analysis of surfactant produced by Pseudomonas strain L-01［J］.Chinese Journal of Environmental Engineering，2010，4（11）：2575-2578.

［7］Kiran G S，Thomas T A，Selvin J.Production of a new glycolipid biosurfactant from marine Nocardiopsis lucentensis MSA04 in solid-state cultivation［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2010，78（1）：8-16.

［8］Liu H，Wang H，Chen X，et al.Biosurfactant-producing strains in enhancing solubilization and biodegradation of petroleum hydrocarbons in groundwater［J］.Environmental Monitoring and Assessment，2014，186 （7）：4581-4589.

［9］Reis R S，Pacheco G J，Pereira A G，et al.Biosurfactants：Production and applications［J］.Biodegradation：Life of Science，2013，2（5）：953-978.

［10］Silva E J，E Silva N M P R，Rufino R D，et al.Characterization of a biosurfactant produced by Pseudomonas cepacia CCT6659 in the presence of industrial wastes and its application in the biodegradation of hydrophobic compounds in soil［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2014，117：36-41.

［11］強婧，尹華，彭輝，等.銅綠假單胞菌S6分泌的生物表面活性劑特性［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，29（1）：102-110.

QIANG Jing，YIN Hua，PENG Hui，et al.Characteristics of a biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa S6［J］.Acta Scientiae Circumstantiae，2009，29（1）：102-110.

［12］馬滿英，施周，劉有勢.生物表面活性劑修復(fù)HOCs污染土壤的研究進展［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2008，27（5）：835-840.

MA Man-ying，SHI Zhou，LIU You-shi.Research advances in biosurfactant remediation of hydrophobic organics contaminated soil［J］.Chinese Journal of Ecology，2008，27（5）：835-840.

［13］Souza E C，Vessoni-Penna T C，de Souza Oliveira R P.Biosurfactantenhanced hydrocarbon bioremediation：An overview international［J］. Biodeterioration&Biodegradation，2014，89：88-94

［14］Jain D K，Collins-Thompson D L，Lee H，et al.A drop-collapsing test for screening surfactant-producing microorganisms［J］.Journal of Microbiological Methods，1991，13（4）：271-279.

［15］Monis P T，Giglio S，Saint C P.Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis［J］. Analytical Biochemistry，2005，340（1）：24-34.

［16］Zhang X，Xiang T.Review on microbial enhanced oil recovery technology and development in China［J］.International Journal of Petroleum Science&Technology，2010，4（1）.

［17］Liu H，Wang H，Chen X，et al.Biosurfactant-producing strains in enhancing solubilization and biodegradation of petroleum hydrocarbons in groundwater［J］.Environmental Monitoring and Assessment，2014，186 （7）：4581-4589.

［18］Saimmai A，Onlamool T，Sobhon V，et al.An efficient biosurfactantproducing bacterium Selenomonas ruminantium CT2，isolated from mangrove sediment in south of Thailand［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29（1）：87-102.

［19］趙輝，閆華曉，楊騰，等.高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌篩選及其性質(zhì)研究［J］.生物技術(shù)，2010，20（1）：76-78.

ZHAO Hui，YAN Hua-xiao，YANG Teng，et al.Screening and characterization analysis of one strain of bacterium producing high-effect biosurfactant［J］.Biotechnology，2010，20（1）：76-78.

［20］梁艷玲，駱永明，劉五星，等.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件的初步優(yōu)化［J］.土壤，2009，41（2）：243-247.

LIANG Yan-ling，LUO Yong-ming，LIU Wu-xing，et al.Screening and primaryoptimizingofculturalmediumofbiosurfactantproducingstrain［J］. Soils，2009，41（2）：243-247.

［21］Jain D K，Collins-Thompson D L，Lee H，et al.A drop-collapsing test for screening surfactant-producing microorganisms［J］.Journal of Microbiological Methods，1991，13（4）：271-279.

［22］薛燕芬，王修垣.石蠟酪桿菌B126產(chǎn)生的糖脂的理化性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報，1996，36（2）：121-125.

XUE Yan-fen，WANG Xiu-yuan.Physical and chemical properties of a glycolipid produced by Caseobacter paraffinicum B126［J］.Acta Microbiogica Sinica，1996，36（2）：121-125.

［23］Zhang Y，Miller R M.Effect of a Pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobicity and biodegradation of octadecane［J］.Applied and Environmental Microbiology，1994，60（6）：2101-2106.

［24］Gao Y，Zhu L.Plant uptake，accumulation and translocation of phenanthrene and pyrene in soils［J］.Chemosphere，2004，55（9）：1169-1178.

［25］王世榮，李相高，劉東志，等.表面活性劑化學(xué)［M］.第二版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：17.

WANG Shi-rong，LI Xiang-gao，LIU Zhi-dong，et al.Chemistry of surfactants［M］.2th Edition.Beijing：Chemical Industry Press，2010：17.

［26］Saimmai A，Udomsilp S，Maneerat S.Production and characterization of biosurfactant from marine bacterium Inquilinus limosus KB3 grown onlow-costrawmaterials［J］.AnnalsofMicrobiology，2013，63（4）：1327-1339.

［27］Mata-Sandoval J C，Karns J，Torrents A.Influence of rhamnolipids and Triton X-100 on the biodegradation of three pesticides in aqueous phase and soil slurries［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（7）：3296-3303.

［28］馬滿英，劉有勢，施周.生物與化學(xué)表面活性劑對多氯聯(lián)苯的協(xié)同增溶作用［J］.生態(tài)環(huán)境，2008，17（2）：466-470.

MA Man-ying，LIU You-shi，SHI Zhou.Solubilization of polychlorinated biphenyls synergistically solubilized by biosurfactant and chemical surfactants［J］.Ecology and Environment，2008，17（2）：466-470.

［29］李琦，黃廷林，宋進喜.生物表面活性劑對疏水性有機物的增溶特性［J］.化學(xué)工程，2011，39（9）：1-5.

LI Qi，HUANG Ting-lin，SONG Jin-xi.Solubilization of hydrophobic organic compounds by biosurfactant［J］.Chemical Engineering（China），2011，39（9）：1-5.

［30］錢曉勇，劉國慶，宗凱，等.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌篩選及其條件優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（13）：5848-5850.

QIAN Xiao-yong，LIU Guo-qing，ZONG Kai，et al.Study on the isolation of a biosurfactant-producing microorganism and its condition optimization［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2009，37（13）：5848-5850.

［31］Haba E，Espuny M J，Busquets M，et al.Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，88（3）：379-387.

［32］Guerra-Santos L H，K?ppeli O，F(xiàn)iechter A.Dependence of Pseudomonas aeruginosa continous culture biosurfactant production on nutritional and environmental factors［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1986，24（6）：443-448.

［33］楊樂.產(chǎn)表面活性劑解烴菌的篩選及其降解條件研究［J］.環(huán)境工程，2015（6）：153-157.

YANG Le.Screening of biosurfactant-producing by bacteria for degradation of petroleum hydrocarbon and its degradation conditions［J］.Environmental Engineering，2015（6）：153-157.

［34］劉搖暢.一株產(chǎn)生物表面活性劑低溫細菌的篩選與鑒定［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（4）：1075-1082.

LIU Yao-chang.Isolation and identification of a cold-adapted biosurfactant-producing bacterium［J］.Chinese Journal of Ecology，2013，32 （4）：1075-1082.

［35］李琳，趙朝成，劉其友，等.Pseudomonas sp.LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑提取及其穩(wěn)定性研究［J］.石油煉制與化工，2015，46（2）：18-21.

LI Lin，ZHAO Chao-cheng，LIU Qi-you，et al.Study on biosurfactant produced by Pseudomonas sp.LKY-5 and its stability［J］.Petroleum Processing and Petrochemicals，2015，46（2）：18-21.

［36］王大威，張健，呂鑫，等.一株銅綠假單胞菌及其產(chǎn)生的鼠李糖脂特性研究［J］.生物技術(shù)通報，2012，7：163-169.

WANG Da-wei，ZHANG Jian，LU Xin，et al.Study on characteristics of a rhamnolipid biosurfactant producing bacterium and rhamnolipid biosurfactant［J］.Biotechnology Bulletin，2012，7：163-169.

［37］Petrikov K，Delegan Y，Surin A，et al.Glycolipids of Pseudomonas and Rhodococcus oil-degrading bacteria used in bioremediation preparations：Formation and structure［J］.Process Biochemistry，2013，48（5）：931-935.

［38］Prieto L M，Michelon M，Burkert J，et al.The production of rhamnolipid by a Pseudomonas aeruginosa strain isolated from a southern coastal zone in Brazil［J］.Chemosphere，2008，71（9）：1781-1785.

［39］Wei Y，Chou C，Chang J.Rhamnolipid production by indigenous Pseudomonas aeruginosa J4 originating from petrochemical wastewater［J］. Biochemical Engineering Journal，2005，27（2）：146-154.

［40］Doong R，Lei W.Solubilization and mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas putida in the presence of surfactant［J］.Journal of Hazardous Materials，2003，96（1）：15-27.

［41］楊建剛，劉翔，余剛，等.非離子表面活性劑溶液中多環(huán)芳烴的溶解特性［J］.環(huán)境科學(xué)，2003，24（6）：79-82.

YANG Jian-gang，LIU Xiang，YU Gang，et al.Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons dissolved in non-ionic surfactants［J］.Environmental Science，2003，24（6）：79-82.

［42］黃超勝.貴嶼及周邊地區(qū)農(nóng)業(yè)土壤中多環(huán)芳烴的空間分布研究和生態(tài)風(fēng)險評價［D］.廣州：暨南大學(xué)，2012.

HUANG Chao-sheng.Spatial distribution and ecological risk assessment of PAHs in agricultural soil of Guiyu and surrounding areas［D］. Guangzhou：Jinan University，2012.

Screening of a biosurfactant-producing bacterium and biosurfactant characteristics

SHI Jin-li，ZHANG Yan-cheng，ZHANG Li-hao，ZHOU Jing，ZHOU Li-na，LI Hui-xin，HU Feng，XU Li*（College of Resources and Environment Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

A biosurfactant-producing bacterium was isolated and identified as Pseudomonas aeruginosa 147 by physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing.The fermentation products were assigned to glycolipid by Thin Layer Chromatography（TLC）and Fourier Transform Infared Spectroscopy（FT-IR）analysis.The optimal conditions for the strain to produce biosurfactants were peanut oil as initial carbon source，（NH4）2SO4as nitrogen source，carbon to nitrogen ratio of 25∶1，pH 8，temperature of 30℃，and 5 g·L-1NaCl.Under these conditions，the surface tension of the fermentation broths could be reduced by 42.08 mN·m-1，compared with the control，and stayed stable for 144 hours.During 108 hours of incubation，the bacterium achieved the maximum biomass（2.63 g·L-1）and had the maximum fermentation product（2.02 g·L-1）.The solubilization of different polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）（fluoranthene，pyrene，benzene［a］pyrene）was increased with the addition of the fermentation products.At the same rates of fermentation products，enhanced solubilization of PAHs with high-ring（benzene［a］pyrene）was lower than that with low-ring（fluoranthene，pyrene）.

bio-surfactant；polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）；fermentation optimization；solubilization

X53

A

1672-2043（2016）09-1717-10doi：10.11654/jaes.2016-0204

2016－02－21

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目（41101292，41371469）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201503121）；安徽省博士后研究人員科研活動資助經(jīng)費項目（2015 B057）；中國博士后科學(xué)基金面上項目（2016M591856）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金資助項目（y201056）；以及江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目和江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心的資助

石金禮（1989—），男，山東濰坊人，碩士研究生，從事多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)。E-mail：2013130303@njau.edu.cn

徐莉 E-mail：xuli602@njau.edu.cn