山西省雞傳染性法氏囊病病毒的分離鑒定

孟冬霞，宇文延青，武果桃，任　杰，曹水清，趙　娟，孟　帆，劉一飛，馬政禹

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；3.陽泉市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西陽泉 045000；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801)

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山西省雞傳染性法氏囊病病毒的分離鑒定

孟冬霞1，宇文延青2*，武果桃1，任杰1，曹水清3，趙娟1，孟帆1，劉一飛1，馬政禹4

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；3.陽泉市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西陽泉 045000；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801)

為了解山西省雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)流行毒株的遺傳變異規(guī)律，將近5年來采集自山西不同地區(qū)發(fā)病雞群的法氏囊組織病料，通過接種易感雛雞分離出15株IBDV。用絨毛尿囊膜接種法測定雞胚半數(shù)致死量，其ELD50在10-2.18～10-2.91；測定所有分離株對非免疫雞的致死率，結(jié)果為63.3%～86.7%，屬于超強(qiáng)毒株；利用RT-PCR擴(kuò)增病毒VP2基因并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，所分離的15株病毒均具有傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株的主要分子特征，即222A(WS2為S)、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S及七肽區(qū)SWSASGS，綜合其對非免疫雞的致死率，確認(rèn)所有分離毒株屬于超強(qiáng)毒病毒株。說明在山西省境內(nèi)存在傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株。

傳染性法氏囊病病毒；流行毒株；分離鑒定

傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseas virus，IBDV)是傳染性法氏囊病(Infectious bursal diseas，IBD)的病原，屬雙RNA病毒科(Birnaviridae)的成員，基因組包括A、B兩個(gè)節(jié)段，共編碼VP1、VP2、VP3、VP4、VP5等5種蛋白，其中VP2為主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒總蛋白的51%，是重要的毒力基因，VP2高變區(qū)(206-350位)一些位點(diǎn)氨基酸殘基突變與病毒抗原和毒力變異有關(guān)[1-4]。目前IBDV標(biāo)準(zhǔn)毒株、超強(qiáng)毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)及變異株在中國并存，致使免疫接種過疫苗的雞群經(jīng)常發(fā)病，加劇了傳染性法氏囊病的防控難度[5-9]。分離鑒定地方流行毒株，有助于合理使用疫苗、研制新型疫苗和建立有效的防控措施。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料于2008年—2012年從山西省不同地區(qū)發(fā)病雞場采集疑似IBD病雞的法氏囊，凍存后帶回實(shí)驗(yàn)室備用，相關(guān)資料見表1。

1.1.2雞胚及易感雛雞SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在實(shí)驗(yàn)室中孵化至使用；21日齡非免疫雞，由太谷某養(yǎng)殖戶提供。

1.1.3試劑SuperscriptTMRT-PCR Systems試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；ExTaq、RNAiso Plus、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記兔抗鼠熒光二抗，Sigma公司產(chǎn)品。其他所用試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1病毒分離所有病料均按OIE手冊中《診斷試驗(yàn)與疫苗》標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理。病毒分離按歐盟關(guān)于IBDV分離的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，即取病毒懸液經(jīng)滴鼻或點(diǎn)眼接種3周齡非免疫雛雞(0.1 mL/只)，接種后4 d，處死，收集病變法氏囊，按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法處理后，置-70℃凍存?zhèn)溆谩Ａ硗庖徊糠址ㄊ夏矣糜贗BDV的熒光檢測，同時(shí)采集瀕死雞法氏囊、盲腸扁桃體和胸腺制備病理切片。

1.2.2病毒RT-PCR鑒定根據(jù)GenBank提供的日本OKYM株A節(jié)段VP2基因序列(登錄號(hào)為D49706)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增分離毒株VP2基因ORF全長的特異性引物：上游引物(P1)，5′-ggGAATTCatgacgaacctgcaagat-3′ ；下游引物(P2)，5′-gcGTCGACccggattatgtctttgaag-3′，大寫字母為加入的酶切位點(diǎn)，P1在5′端加入EcoR Ⅰ，P2在5′端加入SalⅠ，引物由Invitrogen公司合成。病毒RNA提取根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明書進(jìn)行。第1鏈cDNA合成按M-MLV試劑盒說明書進(jìn)行，為增強(qiáng)PCR特異性，在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入1 μL(2 U)RNaseH，37℃水浴20 min。PCR擴(kuò)增體系為100 μL：模板5 μL ，10 × Ex buffer 10 μL，dNTP(2.5 pmol/L)8 μL，上游引物P1(10 pmol/L)1 μL, 下游引物P2 (10 pmol/L) 1 μL，ExTaq1.5 μL, 補(bǔ)ddH2O至100 μL；PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 2 min,35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測?；厥崭髂康臈l帶連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表1　病料及病毒相關(guān)資料Table 1　The information of samples and isolated strains

注：“L”蛋雞；“B”肉雞;“ZZ”長子；“WS”文水；“TY”太原；“TG”太谷；“YQ”陽泉。

Note: "L"Layer;"B"Broiler;"ZZ"Zhangzi;"WS"Wenshui;"TY"Taiyuan;"TG"Taigu;"YQ"Yangquan.

1.2.3雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測定用滅菌PBS分別將分離株病毒懸液10倍遞次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4等4個(gè)不同稀釋度，每個(gè)稀釋度經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)途徑接種8日齡SPF雞胚10枚(0.1 mL/枚)，37℃孵化，剔除24 h內(nèi)死亡雞胚，觀察至144 h，記錄雞胚死亡情況及胚體病變，最后根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的ELD50。同時(shí)設(shè)陰性對照組。

1.2.4病毒致病性試驗(yàn)每組10只3周齡非免疫雞，經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼攻毒，劑量為10×ELD50/0.1 mL，同時(shí)設(shè)陰性對照，每組3個(gè)重復(fù)，記錄死亡情況，并計(jì)算平均致死率。

1.2.5組織學(xué)病變將采集的法氏囊、盲腸扁桃體和胸腺，用100 mL/L的中性福爾馬林溶液固定制作病理切片，觀察病理變化。

1.2.6序列分析將所得的15個(gè)地方株目的基因序列與GenBank中14個(gè)參考株比較(表2)。利用DNA Star 5.01對VP2基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性進(jìn)行比較和變異分析。用MEGA5.5對29個(gè)序列的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析(NJ法、bootstrap為1 000次)。

注：SⅡ.血清Ⅱ型；.CS.經(jīng)典毒株；AS.弱毒株；VS.變異毒株；VVS.超強(qiáng)毒株。

Note:SⅡ.Serotype Ⅱ;CS.Classical strain;AS.Attenuated strain;VS.Variant strain;VVS.Very virulent strain.

2　結(jié)果

2.1病毒的致病性

非免疫雞接種15株分離株后，全部出現(xiàn)精神沉郁，呆立不動(dòng)，拉白色稀糞等臨床癥狀，3 d～4 d出現(xiàn)死亡高峰。剖檢死雞可見法氏囊腫脹、水腫、出血，呈“紫葡萄樣”外觀，腿肌出血，腎呈“花斑樣”，腺胃與肌胃交界處有斑塊狀出血。死亡率為63.3%～86.7%(表1)，根據(jù)國際毒力標(biāo)準(zhǔn)判定為超強(qiáng)毒株。

2.2組織學(xué)病變

病雞法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞壞死崩解呈空泡狀，有出血或淤血。盲腸扁桃體內(nèi)淋巴小結(jié)淋巴細(xì)胞壞死，出血，腸黏膜脫落。胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞有少量壞死崩解，出血。對照組無明顯病理變化(圖1)。

1～3.對照組；4～6.發(fā)病雞；1、4.法氏囊；2、5.胸腺；3、6.盲腸扁桃體

1-3.Control groups;4-6.Test groups;1,4.Bursa;2,5.Thymus;3,6.Cecum tonsi

圖1組織病理學(xué)變化(HE,100 ×)

Fig.1Histopathological lesions caused by IBDVs(HE,100 ×)

2.3雞胚半數(shù)致死量測定

IBDV懸液經(jīng)CAM途徑接種雞胚后，試驗(yàn)組與對照組雞胚相比，出現(xiàn)胚體出血，頭部水腫。根據(jù)雞胚死亡情況，利用Recd-Muench法計(jì)算出每0.1 mL病毒的ELD50為10-2.81～10-2.18(表1)。

2.4VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

提取的各分離株的RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后均獲得長度約1 320 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符，電泳圖及質(zhì)粒鑒定圖略。

2.5分離株VP2基因序列分析

用RT-PCR對分離株的VP2全基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序和序列分析。測序分析結(jié)果表明，IBDV VP2全長為1 323 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，編碼441個(gè)氨基酸。核苷酸與氨基酸序列同源性分析顯示，二者均與vvIBDV參考株UK661株同源性較高，核苷酸序列同源性為97.5%～99.4%，氨基酸序列同源性為99.1%～100%(圖2)。高變區(qū)氨基酸：222A(WS2為S)、249Q、254G、256I、279D、284A、294I和299S，七肽區(qū)為SWSASGS，符合vvIBDV VP2蛋白的分子生物學(xué)特征(圖3)。遺傳進(jìn)化分析表明，所有分離毒株與來源于其他國家或地區(qū)的vvIBDV聚為一群，Bootstrap值達(dá)79%(圖4)。

3　討論

自從1957年首次在美國發(fā)現(xiàn)IBD以來，該病迅速蔓延至世界各地，對各國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重威脅。隨著疫苗的使用，該病一度得到較好的控制，但20世紀(jì)80年代末變異毒株和vvIBDV的出現(xiàn)，使該病的控制面臨著嚴(yán)峻考驗(yàn)[10]。

根據(jù)目前發(fā)表的文獻(xiàn)資料，vvIBDV毒株VP2蛋白高變區(qū)氨基酸具有以下特征：七肽區(qū)(326-332)氨基酸序列為SASWSGS，279位和284位氨基酸分別為D和A，這是毒力的必要條件；222A、256I、294I和299S可使病毒局部親水性增加，使毒力增強(qiáng)[2,11-12]。一般認(rèn)為vvIBDV對SPF雞的致死率均超過60%，但Jackwood D J等[13-14]認(rèn)為，IBDV的最終判定應(yīng)根據(jù)臨床癥狀、致病性并結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行。本文收集2008年—2012年期間山西省不同地區(qū)疑似患IBD病雞法氏囊病料75份，根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)分離出15株IBDV毒株，測定了病毒毒力。病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)病雞法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞壞死崩解，呈空泡狀，有出血或淤血；盲腸扁桃體內(nèi)淋巴小結(jié)淋巴細(xì)胞壞死，出血，腸黏膜脫落；胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞有少量壞死崩解，出血，屬于IBDV感染引起的典型病變。VP2蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，除TY-3(279N)、TY-2(284T)、WS-2(222S)和ZZ-3(294V)4株外，其余11株具vvIBDV分子特征，即222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S及七肽區(qū)SWSASGS，相似率達(dá)100%[5,7,9,11]，所有毒株對非免疫雞的致死率均大于60%，根據(jù)vvIBDV的判定標(biāo)準(zhǔn)所有分離毒株應(yīng)屬于vvIBDV。因此，僅根據(jù)分子特征判定IBDV是否為超強(qiáng)毒株并不一定準(zhǔn)確，還應(yīng)結(jié)合致死率判定。

A.核苷酸序列同源性比較；B.氨基酸序列同源性比較

A.Homology analysis of nucleotide sequences;B.Homology analysis of amino acid sequences

圖2分離毒株與UK661序列同源性比較

Fig.2Comparison of the homology between isolated strains and UK661

圖3　分離毒株與UK661 VP2高變區(qū)比較

圖4　分離毒株的遺傳進(jìn)化分析

總之，2008年—2012年流行于山西部分地區(qū)的IBDV可能以超強(qiáng)毒株為主，但其主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的高變區(qū)域、關(guān)鍵毒力位點(diǎn)并沒有發(fā)生太大變異，之所以還有IBD的發(fā)生可能與疫苗的貯藏、使用方法及管理有關(guān)。因此，在雞傳染性法氏囊病防控方面除加強(qiáng)對病原的監(jiān)控外，還應(yīng)加強(qiáng)對相關(guān)疫苗的管理和規(guī)范使用。

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?毒株資料 Table 2Information of

名稱Strains毒株類型Type登錄號(hào)Accessionnumbers來源Origions23-82SⅡAF362773美國USASerotype2SⅡU30818加拿大CanadaCJ801CSAF006701中國ChinaF52/70CSD00869法國FranceGtASAY368653中國ChinaD78ASAF499929荷蘭NetherlandEvariantVSAF133904美國USAUK661VVSX92760英國EnglandSH95VVSAY134874中國上海ShanghaiChinaSD-2VVSEU042147中國山東ShandongChinaGxVVSAY444873中國廣西GuangxiChinaHKVVSAF092943中國香港HongkongChinaYN-hVVSEU328335中國云南YunnanChinaHarbin-1VVSAF454945中國黑龍江HeilongjiangChina

Isolation and Identification of Chicken Infectious Bursal Disease Virus Strains In Shanxi Province

MENG Dong-xia1,YUWEN Yan-qing2, WU Guo-tao1, REN Jie1,CAO Shui-qing3，ZHAO Juan1,MENG Fan1, LIU Yi-fei1, MA Zheng-yu4

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan,Shanxi,030032,China;2.LifeandScienceCollege,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan,457003,China;3.CommissionofAgricultureofYangquanCity,Yangquan,Shanxi,045000,China;4.ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi,030801,China)

In order to investigate the genetic variation of chicken infectious bursal disease virus in Shanxi province,15 IBDV strains were isolated by inoculating susceptible chickens with the supernatant of homogenized epidemic materials from bursae,which were collected from the onset chickens in different areas of Shanxi nearly five years.Median lethal dose were determined by embryo allantois membrane inoculation method,and its ELD50within 10-2.18-10-2.91.The fatality rate of all isolates to the experimental chickens were determined,the results showed that the fatality rate of all isolates were 63.3%-86.7%,the criteria for the very virulent IBDV (vvIBDV).The VP2 genes of isolates were amplificated by RT-PCR and sequenced, the sequence analysis showed that the 15 isolates had molecular characteristics of vvIBDV-222A(WS2 S),249Q,254G,256I,279D,284A,294I,299S and the conserved seven peptide domains of SWSASGS.All results suggested that the isolats belong to the vvIBDV group.

Infectious bursal disease virus;epidemic strains;isolation and identification

2016-04-05

山西省國際科技合作項(xiàng)目(2012081012)

孟冬霞(1968-)，女，山西翼城人，主要從事中獸醫(yī)藥及動(dòng)物疾病防治研究。*通訊作者

S852.659.4

A

1007-5038(2016)10-0070-05