茄堿通過(guò)調(diào)控Stat3信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞Panc-1中MMP-2和MMP-9表達(dá)

吳素娜，劉樂(lè)偉，黃智銘

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·論著 基礎(chǔ)研究·

茄堿通過(guò)調(diào)控Stat3信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞Panc-1中MMP-2和MMP-9表達(dá)

吳素娜1，劉樂(lè)偉1，黃智銘2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂(lè)清市人民醫(yī)院 消化內(nèi)鏡科，浙江 溫州 325600；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

目的 探討茄堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)的影響及Stat3信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用。方法 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和藥物組，藥物組分別采用濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L的茄堿對(duì)Panc-1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，明膠酶譜法觀察茄堿對(duì)細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP-2和MMP-9基因的表達(dá)變化；Western blotting法檢測(cè)總蛋白中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）蛋白的磷酸化表達(dá)變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，藥物組（7.0、10.5 μmol/L）MMP-2活性明顯下降（t值分別為2.4、6.4，P＜0.05）；MMP-9活性亦下降（t值分別為3.2、4.8，P＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，藥物組（7.0 μmol/L、10.5 μmol/L）MMP-2基因表達(dá)下調(diào)（t值分別為8.7、13，P＜0.05）；MMP-9基因表達(dá)下調(diào)（t值分別為3.2、16.3，P＜0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，隨著茄堿濃度的增加，Panc-1細(xì)胞中Stat3蛋白磷酸化受到明顯抑制（t值分別為10.2、6.4、6.2，P＜0.05），延長(zhǎng)藥物處理的時(shí)間（12 h、18 h、24 h）亦可抑制Stat3蛋白磷酸化（t值分別為11.4、26.1、20.4，P＜0.05）。結(jié)論 茄堿可抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-1中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力。其具體機(jī)制可能與調(diào)控Sata3信號(hào)通路有關(guān)。

茄堿；胰腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶；轉(zhuǎn)移；Stat3通路

胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，其年病死率幾乎等于其發(fā)病率。世界范圍內(nèi)，胰腺癌在引起男性和女性因癌癥死亡的原因中分別排名第8位和第9位［1］。在中國(guó)，僅有8％～10％的胰腺癌患者能在確診后的1年存活，平均存活期為4～5個(gè)月［2］，98％～99％的患者會(huì)在5年之內(nèi)死亡。如此差的預(yù)后與胰腺癌本身臨床表現(xiàn)的隱匿性與其高轉(zhuǎn)移能力有直接關(guān)系，因此，提高胰腺癌早期診斷及遏制其強(qiáng)轉(zhuǎn)移性，對(duì)于患者預(yù)后的提高有重要意義。現(xiàn)階段，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物，特別是中草藥物，以提高胰腺癌的預(yù)后水平，已成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。茄堿（Solanine）是馬鈴薯中一種主要的甾體類(lèi)生物堿［3］，可抑制人肝癌、胃癌等細(xì)胞的增殖［4］，亦可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［5］。腫瘤細(xì)胞可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），MMPs可水解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族中成員，它們?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［6-7］。Stat3是Stat家族中重要成員，其在Tyr705位點(diǎn)被激活后，形成p-Stat3，其二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞中，Stat的激活是短暫的，而在大多數(shù)原發(fā)腫瘤和癌細(xì)胞株中Stat蛋白（尤其是Stat3）通過(guò)酪氨酸激酶持續(xù)性的激活和（或）脫磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的減少而保持活性［8］。大量研究證實(shí)，活化的Stat3可調(diào)控腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤侵襲及血管形成等參與腫瘤進(jìn)展。有研究指出，p-Stat3表達(dá)與結(jié)直腸癌標(biāo)本，且其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期相關(guān)，表明Stat3的活化參與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。國(guó)內(nèi)亦有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中存在p-Stat3高表達(dá)，通過(guò)雙變量相關(guān)分析進(jìn)一步證實(shí)p-Stat3與MMP-2和MMP-9正相關(guān)，提示p-Stat3可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移［10］。本研究主要通過(guò)應(yīng)用茄堿體外處理胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，觀察其對(duì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響，揭示其是否能夠發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力，并探討Stat3通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1藥品與試劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；茄堿，美國(guó)Sigma公司，用二甲亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解至50 μg/mL，用培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM均為Gibco公司產(chǎn)品；Stat3、p-Stat3等兔抗，美國(guó)ABCAM公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，美國(guó)Bioworld公司；其余試劑均有為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞Panc-1用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，分為對(duì)照組（不用藥物處理）和藥物組（加入茄堿，使終濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L）。

1.2.2PANC-1細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性檢測(cè)：采用明膠酶譜法。藥物處理PANC-1細(xì)胞24 h后收集各組上清液離心備用。各組上清液經(jīng)蛋白定量后，依次取等量蛋白的上清液4 ℃進(jìn)行SDS-PAGE電泳100 V約1.5 h，洗脫液振蕩邊洗脫2次，每次40 min，漂洗液漂洗2次，每次20 min；接著把凝膠放在孵育液中37 ℃孵育42 h，孵育完成后用染色液染色3 h，及脫色液A、B、C分別脫色0.5 h、1 h、2 h后，有MMP-2（72 KD）和MMP-9（92 KD）在藍(lán)色背景上的條帶，分析條帶灰度值，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3MMP-2和MMP-9 mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。藥物處理PANC-1胰腺癌細(xì)胞24 h后，TRIZOL提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)純度濃度檢測(cè)后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)的條件：37 ℃、15 min→98 ℃、5 min。反應(yīng)完成后將cDNA用RNase-free水稀釋5倍，置于-20 ℃保存。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒配置反應(yīng)體系在ABI 7500 Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min→（95 ℃、15 s→60 ℃、60 s）×40。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCT方法，算出相對(duì)值，以對(duì)照組的相對(duì)倍數(shù)的形式表示。引物序列（5'-3'）：MMP-2，上游：AATGCCATCCCCG ATAACC，下游：GCTCAGCAGCCTAGCCAGTC；MMP-9上游：GGGGGAAGATGCTGCTGTT，下游：AGCGGTCCTGGCAGAAA TAG；GAPDH上游：GGGTGTGAACCATGAGAAGTATG，下游：GATGGCATGGACTGTGGTCAT。

1.2.4目的蛋白的表達(dá)檢測(cè)：采用Western blotting法。細(xì)胞經(jīng)不同濃度茄堿處理后，冷PBS洗3次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育Stat3、p-Stat3等抗體（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床1 h，ECL顯色。用10.5 μmol/L茄堿處理細(xì)胞，分別在6、12、18、24 h收集細(xì)胞蛋白，處理方法同上。用Quantity one軟件分析灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1茄堿對(duì)MMP-2和MMP-9活性的影響

不同濃度（3.5、7.0和10.5 μmol/L）的茄堿處理細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性見(jiàn)圖1、表1。

2.2茄堿對(duì)MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

不同濃度的茄堿處理細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)見(jiàn)表2、圖2。

圖1　MMP-2和MMP-9活性變化

表1　不同濃度茄堿處理24 h后Panc-1細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性相對(duì)值

圖2　MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)變化

2.3茄堿對(duì)Stat3蛋白磷酸化表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，細(xì)胞總蛋白中藥物組p-Stat3表達(dá)明顯低于對(duì)照組。細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理后p-Stat3表達(dá)與對(duì)照組相比降低，t值分別為10.2，6.4，6.2，P＜0.05，隨著處理時(shí)間增加（12 h、18 h、24 h），p-Stat3表達(dá)與對(duì)照組相比亦降低，t值分別為11.4，26.1，20.4，P＜0.05。該結(jié)果提示茄堿可阻止Stat3的磷酸化進(jìn)程。見(jiàn)圖3。

3 討論

表2　不同濃度茄堿處理24 h后Panc-1細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)值

茄堿廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等茄科植物中。有研究表明，茄堿具有明顯的抗腫瘤作用，其可抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖［11］，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，抑制BCL-2的表達(dá)，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［12-14］。本研究中，我們通過(guò)明膠酶譜法及PCR法研究了茄堿對(duì)Panc-1細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證其潛在的抗腫瘤特性。

因茄堿本身具有毒性，課題組前期已通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)篩選出茄堿對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性的各藥物濃度及時(shí)間點(diǎn)，在本文中所采用的藥物濃度及時(shí)間下，茄堿對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，在此前提下，研究茄堿所發(fā)揮的抗腫瘤作用。我們?cè)诿髂z酶譜實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)茄堿（7.0 μmol/L、10.5 μmol/L）處理細(xì)胞24 h后，MMP-2的表達(dá)活性明顯低于對(duì)照組（t值分別為2.4、6.4，P＜0.05），MMP-9的表達(dá)亦表現(xiàn)出相似結(jié)果（t值分別為3.2、4.8，P＜0.05）。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步證實(shí)了茄堿可以在mRNA水平抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)（t值分別為8.7、13，P＜0.05；t值分別為3.2、16.3，P＜0.05），結(jié)果提示茄堿可以削弱胰腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，我們通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度茄堿處理細(xì)胞后，p-Stat3的表達(dá)均明顯下降（t值分別為10.2、6.4、6.2，P＜0.05），并且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，p-Stat3表達(dá)亦表現(xiàn)出下降趨勢(shì)（t值分別為11.4、26.1、20.4，P＜0.05）。數(shù)據(jù)揭示了p-Stat3與MMP-2和MMP-9正相關(guān)，在一定程度上提示p-Stat3可能參與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

圖3　不同濃度（A、C）和不同時(shí)間（B、D）茄堿處理對(duì)Stat3及p-Stat3蛋白表達(dá)的影響

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（本文編輯：魯翠濤）

Solanine effects the expression of MMP-2 and MMP-9 in PANC-1 by regulating Stat3 pathway

WU Su-na1， LIU Le-wei1， HUANG Zhi-ming2.1Department of Digestive Endoscopy， The People’s Hospital of Yueqing， Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325600；2Department of Gastroenterology， The First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000

Objective To investigate the effects of Solanine on MMP-2 and MMP-9 in pancreatic cancer cell line Panc-1 and to explore the involved function of Stat3 pathway. Methods The experiment was divided into Control group and Solanine group. In Solanine group， Panc-1 cells were treated with various concentrations of Solanine （3.5， 7.0 and 10.5 μmol/L）. Activities of MMP-2 and MMP-9 were analyzed by Gelatin Zymography. A quantitative analysis of MMP-2 and MMP-9 mRNA expression was performed by using Real-time PCR. The protein expression of p-Stat3 were evaluated with Western blotting. Results Compared with the Control group，Solanine group （7.0 μmol/L， 10.5 μmol/L） significantly inhibited activities of MMP-2 in Panc-1 cells （t=2.4，6.4， P＜0.05）， as well as the MMP-9 activities （t=3.2， 4.8， P＜0.05）. The mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 showed the same results （t=8.7， 13， P＜0.05； t=3.2， 16.3， P＜0.05）. The protein expression of p-Stat3 was depressed by Solanine in a dose- and time- dependent manner （t=10.2， 6.4， 6.2， P＜0.05； t=11.4， 26.1， 20.4， P＜0.05）. Conclusion Solanine may possess anti-metastasis efficacy by inhibiting the expression of MMP-2 and MMP-9 in Panc-1 cells at least in part via Stat3 signaling pathways.

Solanine； pancreatic cancer； matrix metalloproteinases （MMPs）； metastasis； Stat3 pathway

R735.9

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.013

2016-01-04

吳素娜（1984-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師。

簡(jiǎn)介］黃智銘，主任醫(yī)師，教授，E-mail：wyyyhzhiming@126.com。