大鼠胰島細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

蘇力擔卡扎·仇曼，林海，何鐵英，程坤，王松，郝曉文，陳啟龍，韓瑋

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 胰腺外科，新疆 烏魯木齊 830054）

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大鼠胰島細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

蘇力擔卡扎·仇曼，林海，何鐵英，程坤，王松，郝曉文，陳啟龍，韓瑋

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 胰腺外科，新疆 烏魯木齊 830054）

目的 探討胰島細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。方法 從實驗室中挑選出30只成年雄性大鼠，將膠原酶注入大鼠的胰腺導管，聚蔗糖梯度離心法分離胰島細胞，并培養(yǎng)與鑒定胰島細胞。培養(yǎng)1周后用雙硫腙（DTZ）行胰島細胞鑒定。用丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI）檢測胰島細胞活性。結果 經過分離與純化，大鼠胰島細胞的獲得率較高且較穩(wěn)定；分離后的胰島細胞在適宜環(huán)境中生長，生長狀態(tài)較佳，在培養(yǎng)后的12～24 h可貼壁，在培養(yǎng)后4～5 d細胞生長狀態(tài)達到頂峰，細胞完好，且折光性能優(yōu)異。利用免疫組化法鑒定胰島細胞，分離的細胞SMA及PDGFR表達呈陽性，少數(shù)細胞vWF表達呈陽性。結論 我科此次分離純化大鼠胰島細胞的方法為逆行灌注膠原酶+原位消化+Ficoll液梯度分離法，實驗結果顯著，能在一定程度上獲取純度較高的大鼠胰島細胞。分離后的胰島細胞在培養(yǎng)4～5 d后達到最佳狀態(tài)，適用于作為實驗室胰島細胞功能深入研究的實驗材料。

胰島細胞；分離；培養(yǎng)；鑒定；大鼠

20世紀90年代末期以來，國內及國外許多優(yōu)秀的醫(yī)學研究學者把實驗室大鼠胰島細胞的分離與培養(yǎng)作為研究胰島細胞功能的一項重要科學課題［1-2］。該課題開展的原理為，通過研究大鼠胰島細胞的各種生化、生理機制，如細胞膜中陰、陽離子通道的開啟與閉合會影響胰島細胞進行多種激素的分泌及后續(xù)一系列的神經內分泌反應，來進行人類糖尿病發(fā)病因素與機制的深入性研究及合理有效降低糖尿病患者血糖濃度方式的新型研究方案的研發(fā)。雖然在很早以前就有分離實驗室大鼠胰島細胞的方式，但由于以往醫(yī)學技術水平和實驗室設備的限制，分離出來的胰島細胞純度并沒有達到預期的標準。除此之外，由于實驗中多種外界因素和內部因素的干擾，研究人員在每次取得胰島的產量并不固定，且在分離和培養(yǎng)過程中，胰島細胞的穩(wěn)定性較低也是限制實驗取得完美結果的重要因素之一［3-5］。為了得到純度較高的可用于后續(xù)實驗研究的符合標準的胰島細胞，我科對大鼠胰島細胞的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定做了目的性研究，以下是關于此次試驗的報道。

1 材料和方法

1.1動物來源及飼養(yǎng)方法

我科于2014年1月至2014年12月期間從新疆醫(yī)科大學實驗動物養(yǎng)殖中心（許可證號scxk（新）2014-0004）購進30只成年雄性實驗室大鼠。將大鼠置于恒溫為25 ℃的實驗室中飼養(yǎng)，每日定時投喂水和食物，投喂原則為少量多次喂食。大鼠飼料與水的配比為1∶2，即大鼠進食1g飼料要飲2 mL水（注：大鼠的飲水原則以城市居民飲水衛(wèi)生要求為最低標準）。在飼養(yǎng)過程中，每周更換墊料2次，以保證大鼠飼養(yǎng)期間的健康要求。同時，實驗室每日進行通風，保證優(yōu)質的空氣供應，并設定12 h的日光燈照射模擬外界環(huán)境。

1.2實驗試劑

聚蔗糖Ficoll 400，10 g/支，生興生物技術（南京）有限公司；膠原酶V，25 mg/支，北京方程生物科技有限公司；胰蛋白酶，2 000 U/g，東恒華道生物科技有限公司；DNase I，規(guī)格為15 KU，上海前塵生物有限公司，產地瑞典。雙硫腙（DTZ）、丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI），Sigma公司。

1.3胰島分離與純化

30只雄性大鼠在實驗前12 h給予禁食，予10％水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后于大鼠腹腔做一縱行切線，于該切線下刀逐層鈍性剝離腹腔軟組織。當?shù)竭_腹腔后，可見到被腹膜覆蓋的剛臟和部分胰腺組織。將表面筋膜、脂肪等軟組織剝離后暴露肝臟、部分胰腺及周圍臟器等。操作人員在胰管十二指腸的腸壁部分取1號泰絲線作結扎，結扎完畢后，將導管從胰膽管開口處—十二指腸乳頭逆行插入至胰膽管。之后將留置針置入膽管內部約1 cm處，并夾閉膽管的近肝端。大鼠心臟放凈全身血液后，在置入胰腺膽管的導管內逆行注射入膠原酶V，待胰腺反應完成至水腫膨脹后，立即將胰腺摘除置入提前冷卻完畢的裝有Hanks液的消化瓶中。將含有胰腺的消化液置于38 ℃的恒溫水浴箱中靜置約10 min，取出消化瓶水平震蕩，待瓶中溶液變?yōu)榧毶碃罘娇赏Ｖ埂Ｖ蠹尤? ℃的牛血清和Hanks液中終此繼續(xù)消化。操作人員用濾網對含有胰腺細胞的消化液進行過濾，將濾過的消化液進行離心處理，轉速為1 000 r/min，取下層沉淀物又加入與先前相同的Hanks液洗滌，相同步驟洗滌一次，再加入消化液后將平分到兩個試劑瓶中，再次離心，設定離心指標與之前相同。取沉淀物加入濃度為25％的Ficoll 400溶液攪拌均勻，按濃度梯度從高至低分別添加23％、20％、11％的Ficoll 400溶液及Hanks液2 mL，離心處理，轉速為3 000轉/min，離心溫度為4 ℃，時間為20 min，之后分別吸出位于11％～20％和20％～23％界面的胰島細胞［6］，再次加入Hanks液后置入50 mL離心裝置中離心2次，再次洗滌，留待以下操作。

1.4胰島細胞的培養(yǎng)

將前個步驟獲取的胰島放入5 mL的含有2 mmol/L的Hanks液燒杯中，并將燒杯置于水溫為37 ℃，轉速為200 r/min的搖床中，時間為10 min。之后將轉速調為100 r/min進行離心處理，時間為2 min，取下層沉淀液。操作人員向下層沉淀液添加酶液，充分反應4 min后，讓其自然靜置1 min。用滴管吸取頂層少量消化液置于另一離心器中，再添加同等體積的酶液。以上步驟進行3次方可將胰島組織分離為數(shù)個單細胞。離心機運轉指標設定：轉速為1 000 r/min，時間為5 min。下層沉淀物取Hanks液洗滌，重復2次。再次離心，離心機運轉指標設定：轉速為600 r/min，時間為8 min。取0.5 mL的消化液及底部細胞，混合充分反應并輕擊瓶身使得細胞懸浮在瓶體中而不沉底，轉入培養(yǎng)成分含有濃度為10％的牛血清、相同濃度的谷氨酰胺及100 U/mL的雙抗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：37 ℃、CO25％。

1.5胰島細胞的鑒定

以上步驟結束后，按以下步驟對胰島細胞進行鑒定：（1）將所獲取的胰島細胞用甲醛溶液進行固定；（2）Triton X-100溶液10 min；（3）用PBS溶液對胰島細胞沖洗，牛血清30 min；（4）按1∶100的比例分別添加PDGFR（血小板衍生生長因子受體）、SMA（抗平滑肌抗體），存放于4 ℃冰箱中，時間為24 h；（5）再次用PBS溶液對胰島細胞沖洗，按1∶1 000比例加入驢抗兔IgG，之后置于37 ℃水浴箱中，時間為1 h，過程中嚴密避光；第3次用PBS溶液對胰島細胞沖洗。采用丫啶橙（AO）和碘丙啶（PI）雙熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據使用SPSS19.0進行統(tǒng)計學處理。計量資料使用（±s）表示，組間比較應用方差分析；計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，應用x2檢驗進行兩組比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1胰島分離、純化效果

將胰島制備物玻片與DTZ溶液混合后發(fā)現(xiàn)，在整個玻片中，約有80％的細胞團塊紅染，這是實驗得到的分離純化完整或不完整的胰島細胞成品；每只大鼠胰島培養(yǎng)前獲得的胰島細胞數(shù)量為（381±39）個。見圖1。

2.2胰島細胞培養(yǎng)情況

在培養(yǎng)開始后的12～24 h，胰島細胞開始貼附至培養(yǎng)器皿表面，此階段的接種細胞生長狀態(tài)較好（見圖2）；培養(yǎng)開始后的48～72 h，接種的細胞處于迅速繁殖階段；培養(yǎng)開始后的96～120 h（4～5 d），接種的胰島細胞生長繁殖狀態(tài)達到頂峰，此時，細胞膜完好無破損，且細胞折光性能優(yōu)異（見圖3）；培養(yǎng)開始后的6 d起，不能緊密貼附至培養(yǎng)器皿表面的胰島細胞開始增多，細胞大體形態(tài)及內部結構異常，表明大多數(shù)細胞已結束生長狀態(tài)。該階段過后，細胞基本步入死亡階段，細胞萎縮，內部結構開始出現(xiàn)一些列變化，死亡的胰島細胞日益增加，存活的胰島細胞數(shù)量不斷下降。

2.3胰島細胞的活性

將純化的胰島用AO/PI染色，在熒光顯微鏡下見胰島細胞團均呈亮綠色熒光，證明胰島細胞存活良好。見圖4。

2.4不同狀態(tài)下分離的胰島細胞數(shù)量

將酶濃度和反應時間作為變量，比較不同酶濃度下分離胰島細胞的數(shù)量。從實驗可見，反應時間10 min、酶濃度1.7 mg/mL組可獲得較高數(shù)量胰島細胞，反應時間20 min及30 min時，在酶濃度0.5 mg/mL組胰島細胞獲得率均較高。反應時間為20 min時不同酶濃度組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），反應時間為10 min及30 min時三組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體見表1。

2.5胰島細胞免疫組化鑒定

分離的胰島細胞SMA、PDGFR表達呈陽性，少數(shù)細胞血管性血友病因子（vWF）表達呈陽性，提示分離出的細胞中可能存在少量的血管內皮細胞。見圖5～7。

圖1　DTZ染色胰島細胞（×20）

圖 2胰島細胞培養(yǎng)24 h圖片（×20）

圖3　胰島細胞培養(yǎng)5 d圖片（×20）

圖4　AO/PI染色胰島細胞（×20）

表1　不同狀態(tài)下胰島分離的數(shù)量

3 討論

胰腺是人體重要的消化器官之一，按分泌功能可分為內、外兩種腺體組成部分。胰腺的外分泌部分主要由胰腺腺泡和胰腺導管組成，胰腺的內分泌腺主要由胰島組成。目前，在實驗室中進行胰島移植研究課題的主要困難為胰島細胞來源少。雖然在醫(yī)學文獻中有報道，在一定的體外條件下，研究人員可利用胰腺導管上皮細胞和胚胎干細胞獲取胰島細胞［7-9］。實際上，在現(xiàn)有的醫(yī)學模式中從胰腺器官中分離提純出胰島仍是獲取的主要途徑。

本實驗中的胰島細胞活力、狀態(tài)均較良好。通過一系列的Hanks液、膠原酶消化等步驟獲取了高濃度、高活性、功能良好的胰島細胞。通過此次試驗總結了以下幾點注意事項：（1）摘除胰島的整個過程一定要快、狠、準，徹底地清楚淋巴、神經、血管等軟組織，且操作輕柔，不能損傷胰島。如此一來，才能保證胰島的純度和產量，避免外界因素的影響導致實驗結果與其他參考文獻的數(shù)據有出入或達不到預期水平。（2）在實驗中，利用消化液逆行灌注導管進行胰腺消化仍是分離胰島細胞的有效方式。本研究選擇Hanks消化液消化胰腺，胰腺外分泌部位的腺泡可經此遭到破壞。研究未直接利用膠原酶進行該步驟的原因為，后者屬于生物酶，對待溫度、pH、時間都需有嚴格的要求。消化過深和消化不足都會影響胰島細胞的的得率。（3）一定程度的消化胰腺組織可使實驗成功率提升，然而，國內目前尚沒有對消化程度有統(tǒng)一的規(guī)定。在消化的過程中，影響細胞得率關鍵的一點是要減少膠狀物的形成，如此一來，必須嚴格把控時間、溫度和溶液的pH值。本研究發(fā)現(xiàn)，消化液與胰腺的體積比必須大于5∶1，且在反應完成時，消化液剩余的量必須超過胰腺。（4）本次實驗純化后胰島細胞可達90％以上，而在純化前則不足50％，表明用本實驗可有效提高胰島細胞獲得率。接種的胰島細胞在培養(yǎng)4～5 d后狀態(tài)達到最佳，而往后，胰島細胞便逐漸走向死亡，這提示可使用分離純化的方式獲取接種細胞，進行目的性實驗。

圖5　SMA表達（AO/PI染色，×400）

圖7　vWF表達（AO/PI染色，×400）

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（本文編輯：魯翠濤）

Isolation， culture and identification of islet cells in rats

Sulidankazha·Chouman， LIN Hai， HE Tieying， CHENG Kun， WANG Song， HAO Xiao-wen， CHEN Qi-long， HAN Wei. Department of Pancreatic Surgery， The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Objective To study the isolation， culture and identification of islet cells in rats. Methods A total of 30 adult male rats were selected from the lab， the collagenase was retrogradely perfused into rats pancreatic duct. Islet cells were isolated by Ficoll liquid gradient centrifugation， and then for further cultivation and identification. Dithizone （DTZ） was used for islet cell identification after 1 week of culture. Cell activity was detected with Acridine orange and Iodide iodide. Results After separation and purification， the obtain rate of rat islet cells was high and stable. Islet cells achieved a good growth status in the appropriate environment， attached the wall in 12 to 24 h， and reached the growth peak in 4～5 d of culture. The cells were intact， with excellent refraction performance. Immunohistochemical identification showed positive expression of SMA and PDGFR， and positive expression of vWF in a few cells. Conclusion In this study， retrograde perfusion of collagenase in situ+Ficoll liquid gradient separation can obtain high purity of islet cells in rats. Islet cells achieve the best condition in 4～5 d of culture， which can be suitable for further laboratory study.

islet cells； isolation； culture； identification； rats

Q813

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.010

2016-02-22

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金聯(lián)合基金（2016DO1C272）。

蘇力擔卡扎·仇曼（1982-），新疆烏魯木齊人，主治醫(yī)師，碩士。

簡介］韓瑋，主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導師，E-mail：13999846637@139.com。