響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取馬鮫魚油

黃惠莉, 童記強(qiáng), 汪泳, 馬赫

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取馬鮫魚油

黃惠莉1, 童記強(qiáng)1, 汪泳2, 馬赫1

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)

為了提高馬鮫魚的綜合利用價(jià)值，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)馬鮫魚下腳料中魚油的提取工藝進(jìn)行研究，并對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行分析.結(jié)果表明：馬鮫魚油提取的適宜工藝條件是pH值為7，中性蛋白酶加酶量為1.5%，酶解時(shí)間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，馬鮫魚油提取率為75.38%.對(duì)馬鮫魚油的脂肪酸進(jìn)行分析，共檢出12種脂肪酸，其中，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.13%，二十碳五烯酸(EPA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.40%，二十二碳六烯酸(DHA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.06%，EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高.

馬鮫魚油； 酶解; 脂肪酸; 響應(yīng)面法

馬鮫魚(Scomberomorusniphonius)體內(nèi)含有較多的脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸和蛋白.常食可增強(qiáng)機(jī)體免疫力[1].目前，馬鮫魚的利用主要在凍品、鮮銷,以及制備馬鮫魚卷或其他魚食品方面[2].在馬鮫魚制品的加工過程中，下腳料廢棄較多，充分開發(fā)這些下腳料有利于提高馬鮫魚的附加值.近年來，關(guān)于魚類油脂提取工藝的研究較多[3-6]，但利用馬鮫魚下腳料提取魚油的研究較少[7].目前，魚油的提取方法主要有壓榨法、溶劑法、蒸煮法、淡堿水解法、酶解法與超臨界流體萃取法等[5,8-9].酶解法是利用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解，破壞蛋白質(zhì)和魚油的結(jié)合關(guān)系，從而釋放出魚油.酶解法提取魚油工藝條件溫和，提取出的魚油品質(zhì)好，且蛋白質(zhì)水解液可以再利用.本文通過酶法水解馬鮫魚下腳料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶法水解工藝，并測(cè)定其脂肪酸組成.

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)原料將馬鮫魚下腳料(主要為魚皮和魚骨，福建省泉州市惠安瑞芳食品有限公司)于-20 ℃的冰箱冷凍，再將其切碎，貯藏備用.

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品木瓜蛋白酶(酶活333.4 kat·g-1)、風(fēng)味蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、中性蛋白酶(酶活66.68 kat·g-1)、堿性蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、動(dòng)物蛋白酶(酶活0.25 kat·g-1)均由南寧龐博生物工程有限公司提供；石油醚(沸點(diǎn)60～90 ℃)、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇、硫酸、正己烷(分析純)均由上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供.

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備SXT-02型索氏提取器(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；ME204E型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；PK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；HJ-4A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；pH 700型臺(tái)式pH計(jì)(美國(guó)優(yōu)特公司)；TG16-WS型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙市湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；GCMC-QP 2010 Plus型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司).

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1馬鮫魚下腳料基本成分的測(cè)定水分測(cè)定采用常壓干燥法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》；粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；粗脂肪測(cè)定采用索氏提取法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》；灰分測(cè)定可采用灼燒法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》.

1.2.2酶法提取馬鮫魚油工藝稱取25 g 馬鮫魚下腳料，放入250 mL燒杯中，加一定量的水，調(diào)節(jié)pH值，加入一定量的蛋白酶，控制攪拌速度為400 r·min-1，在一定溫度條件下，酶解一定時(shí)間.酶解完成后，在8 000 r·min-1的條件下，離心10 min，分離出上層液，即為馬鮫魚油.最后稱量，計(jì)算提取率，提取率的計(jì)算式為

式中：w為馬鮫魚下腳料的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇蛋白酶種類、pH值、溫度、液固比、加酶量、酶解時(shí)間作為單因素，以魚油提取率為評(píng)價(jià)參數(shù)，確定酶法提取馬鮫魚油的工藝范圍.

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取加酶量(ψ)、酶解時(shí)間(t)、液固比、酶解溫度(θ)等4個(gè)影響因素為自變量，以魚油提取率作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì).+1，0，-1分別代表4因素的高、中、低水平，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平，如表1所示.

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)脂肪酸組成[10]取2滴樣品于10 mL試管，加0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液1.0 mL，搖勻，在60 ℃水浴中反應(yīng)30 min.取出冷卻至室溫，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的硫酸-甲醇溶液，搖勻，60 ℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫，加入3 mL正己烷提取上層溶液用于氣相色譜分析.

色譜柱為Rtx-5Ms，載氣為高純氦，進(jìn)樣溫度為260 ℃，柱流量為2.05 mL·min-1，分流比為30∶1.程序升溫條件為120 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升溫到200 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1升溫到240 ℃，保持5 min.電離方式為電子轟擊電離(EI)，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，質(zhì)荷比為45.00～400.00 m·z-1，檢測(cè)器電壓為1 kV.

2　結(jié)果與討論

2.1馬鮫魚下腳料基本成分

經(jīng)檢測(cè)，馬鮫魚下腳料中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.76%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.22%，可作為提取油脂的良好原料.

圖1　不同蛋白酶對(duì)馬鮫魚油提取率的影響Fig.1　Effect of different kinds of protease on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1不同蛋白酶對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的0.2%，酶解時(shí)間為3 h， 液固比為1∶1，以及酶最適pH值和溫度的條件下進(jìn)行酶解.不同蛋白酶對(duì)馬鮫魚油提取率(δ)的影響，如圖1所示.

由圖1可知：木瓜蛋白酶得到的魚油提取率最高，約73%；其次為堿性蛋白酶和中性蛋白酶.雖然木瓜蛋白酶的提取率最高，但木瓜蛋白酶的價(jià)格是中性蛋白酶價(jià)格的兩倍，因此，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言不是很經(jīng)濟(jì).而中性蛋白酶是在pH值為7的條件下，在水體系下的pH值約為7，無需加其他物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值，這適用于于工業(yè)生產(chǎn).因此，實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶提取馬鮫魚油.

2.2.2pH值對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在酶解溫度為50 ℃，液固比為1∶1，加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的0.2%，酶解時(shí)間為1 h，pH值分別為5,6,7,8,9的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察pH值對(duì)魚油提取率的影響，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知：隨著pH值的升高，魚油提取率上升；當(dāng)pH值超過8，魚油提取率下降.這是因?yàn)槊冈谔囟l件下都有最適pH值，pH值過高或過低都會(huì)導(dǎo)致酶的活性降低，甚至失活[11].由于pH值在6～8時(shí)魚油提取率變化不大，因此，在條件優(yōu)化時(shí)，忽略pH值這個(gè)單因素.

2.2.3酶解溫度對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7,液固比為1∶1,加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的0.2%,酶解時(shí)間為1 h，酶解溫度分別為20，30，40，50，60 ℃的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察酶解溫度對(duì)魚油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知：隨著酶解溫度的升高，魚油提取率逐漸升高；當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，提取率最高；當(dāng)酶解溫度超過50 ℃時(shí)，提取率反而下降.這是因?yàn)闇囟鹊纳哂兄谔岣叻肿訜徇\(yùn)動(dòng)，使酶能更好地與底物結(jié)合[12].溫度過高，魚油的顏色也會(huì)加深，影響魚油品質(zhì).因此，最適酶解溫度選擇50 ℃.

圖2　pH值對(duì)馬鮫魚油提取率的影響 圖3　酶解溫度對(duì)馬鮫魚油提取率的影響　　　　Fig.2　Effect of pH on extraction Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on 　　　　　rate of spanish mackerel oil extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.4液固比對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的0.2%，酶解時(shí)間為1 h，液固比分別為1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察液固比對(duì)魚油提取率的影響，結(jié)果如圖4所示.

由圖4可知：隨著液固比的增加，魚油提取率逐漸上升；當(dāng)液固比上升到2∶1時(shí)，提取率最高；當(dāng)液固比繼續(xù)升高，魚油提取率反而下降.在反應(yīng)體系中，當(dāng)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，酶在反應(yīng)體系中分布不均，不能很好地與底物接觸[13];當(dāng)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，酶的相對(duì)濃度降低，使酶和底物接觸減少，魚油提取率會(huì)下降.因此，最適的液固比選擇2∶1.

2.2.5加酶量對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，液固比為2∶1，酶解時(shí)間為1 h，加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的0%，0.2%，0.5%，1%，3%的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察加酶量對(duì)魚油提取率的影響，結(jié)果如圖5所示.

圖4　液固比對(duì)馬鮫魚油提取率的影響 圖5　加酶量對(duì)馬鮫魚油提取率的影響　　Fig.4　Effect of liquid to solid ratio on 　 Fig.5　Effect of enzyme dosage on extraction　vextraction rate of spanish mackerel oil 　rate of spanish mackerel oil

由圖5可知：隨著加酶量的增加，魚油提取率也升高；當(dāng)加酶量達(dá)到1%后，繼續(xù)增加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，魚油提取率沒有明顯變化，有少量下降.隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，更多的蛋白質(zhì)被降解，被釋放的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之增加[14].但當(dāng)反應(yīng)達(dá)到飽和后，過量的酶會(huì)對(duì)酶自身產(chǎn)生水解作用，導(dǎo)致提取率有少量降低.因此，最適的加酶量為下腳料質(zhì)量的1%.

圖6　酶解時(shí)間對(duì)馬鮫魚油提取率的影響Fig.6　Effect of hydrolysis time on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.6酶解時(shí)間對(duì)馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，液固比為2∶1，加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的1%的條件下，調(diào)節(jié)酶解時(shí)間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察酶解時(shí)間對(duì)魚油提取率的影響，結(jié)果如圖6所示.

由圖6可知：隨著酶解時(shí)間的增加，魚油的提取率逐漸升高；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)2 h時(shí)，魚油提取率達(dá)71.2%；繼續(xù)增加酶解時(shí)間，魚油提取率沒有明顯變化；隨著酶解時(shí)間的增加，酶和底物能更加充分地作用.因此，魚油提取率上升.但酶解時(shí)間越長(zhǎng)，提取魚油的工藝生產(chǎn)周期也越長(zhǎng)，不利于工藝生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益.因此，最適的酶解時(shí)間選擇為2 h.

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表2所示.表2中：δ為提取率.對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，經(jīng)優(yōu)化后得到以魚油得率(Y) 為因變量，以加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)、液固比(C)、酶解溫度(D)為自變量的回歸方程，即

Y=64.37+4.81A+1.28B+4.14C+2.16D+8.45AB+

5.28AC+2.99AD+1.92BC+0.92BD+2.80CD-

7.60A2-3.56B2-3.43C2-11.31D2.

因此，此模型建立成功，適合用于酶法提取馬鮫魚油的條件優(yōu)化.其中，A，C，D，AB，AC，A2，B2，C2，D2的P值均小于0.05，對(duì)魚油提取率影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)模型的線性數(shù)值大小，可以得出各因素對(duì)魚油提取率的影響大小為A>C>D>B，即加酶量>液固比>酶解溫度>反應(yīng)時(shí)間.加酶量和酶解時(shí)間、加酶量和液固比的交互作用對(duì)魚油提取率的影響較大.

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　回歸方程方差分析表

2.4最佳條件預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken方法分析，得到魚油提取率的最佳反應(yīng)條件：加酶量為1.5%,酶解時(shí)間為3 h,液固比為3∶1,酶解溫度為51.98 ℃.此時(shí),提取率的預(yù)測(cè)值為77.41%.將其最佳反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整：加酶量為1.5%，酶解時(shí)間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得平均值為75.38%，與理論值接近.這說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的DAG數(shù)據(jù)可靠，具有預(yù)測(cè)使用價(jià)值.

2.5馬鮫魚油脂肪酸組成分析

對(duì)提取的馬鮫魚油進(jìn)行GC/MS分析，結(jié)果如表4所示.表4中：η為質(zhì)量分?jǐn)?shù).由表4可知：從馬鮫魚油分離出12種脂肪酸，多不飽和脂肪酸以二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)為主.由此可知：馬鮫魚油中EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比一般魚類的高[11,13-14]，具有一定的開發(fā)利用價(jià)值.

表4　馬鮫魚油脂肪酸組成

3　結(jié)論

1) 通過馬鮫魚下腳料提取單因素設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化,得到馬鮫魚油提取的預(yù)測(cè)模型.最佳提取條件：pH值為7，中性蛋白酶加酶量為馬鮫魚下腳料質(zhì)量的1.5%，酶解時(shí)間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，馬鮫魚油提取率為75.38%.

2) 采用GC/MS對(duì)馬鮫魚油進(jìn)行分析，檢測(cè)出12種脂肪酸.其中，棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到22.98%；不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.13%，油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高.多不飽和脂肪酸以EPA，DHA為主，EPA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.40%，DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.06%，馬鮫魚油的EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比一般粗魚油更高.

[1]王攀峰.馬鮫魚加工副產(chǎn)物酶促水解制備鐵結(jié)合肽的研究[D].杭州:中國(guó)計(jì)量學(xué)院,2014:10.

[2]婁永江,楊文鴿,王揚(yáng),等.馬鮫魚方便食品的開發(fā)[J].食品科技,2000,17(6):31.

[3]胡衛(wèi)強(qiáng).草魚內(nèi)臟油脂的提取及其生物柴油的制備研究[D].湘潭:湘潭大學(xué),2012:6-7.

[4]MENEGAZZO M L,PETENUCI M E,FONSECA G G.Production and characterization of crude and refined oils obtained from the co-products ofNiletilapiaand hybrid sorubim processing[J].Food Chemistry,2014,157(10):100-104.

[6]SAHENA F,ZAIDUL I S M,JINAP S,et al.Fatty acid compositions of fish oil extracted from different parts ofIndianmackerel(Rastrelligerkanagurta) using various techniques of supercritical CO2extraction[J].Food Chemistry,2010,120(3):879-885.

[7]毛麗芳,朱新亮,桑衛(wèi)國(guó).亞臨界流體萃取馬鮫魚加工下腳料中魚油的研究[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),2012,25(4):10-15.

[8]QIAN Junqing,ZHANG Hongyong,LIAO Qiyuan.The properties and kinetics of enzymatic reaction in the process of the enzymatic extraction of fish oil[J].Journal of Food Science and Technology,2011,48(3):280-284.

[9]KHODDAMI A,ARIFFIN A A,BAKAR J,et al.Fatty acid profile of the oil extracted from fish waste (head, intestine and liver) (Sardinellalemuru)[J].World Applied Sciences Journal,2009,11(7):127-131.

[10]郝苗,金黎明,姜波.氣相色譜法測(cè)定鲅魚脂肪酸的含量[J].食品與藥品,2007,9(10):22-23.

[11] 王苗苗,羅慶華,王海磊,等.酶解法提取大鯢尾部油的工藝研究[J].中國(guó)油脂,2015,40(4):6-10.

[12] 李文佳,孟宗,李進(jìn)偉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化淡水魚內(nèi)臟酶法水解工藝研究[J].中國(guó)油脂,2014,39(3):65-69.

[13] 李夢(mèng)凡,陶寧萍,劉承初,等.酶解法制備羅非魚油工藝研究[J].中國(guó)油脂,2015,40(7):6-11.

[14] 姚東瑞,周鳴謙,劉云鶴,等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取泥鰍魚油的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2012,27(6):66-70.

(責(zé)任編輯： 錢筠英文審校： 劉源崗)

Optimization of Enzymatic Extraction Conditions of Spanish Mackerel Oil by Response Surface Methodology

HUANG Huili1, TONG Jiqiang1, WANG Yong2, MA He1

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Huian Ruifang Food Corporation Limited, Quanzhou 362131, China)

In order to improve the comprehensive utilization value of spanish mackerel (Scomberomorusniphonius), the single factor and response surface optimization experiments were used to study the extraction process of oil from spanish mackerel waste and the fatty acid composition was also analyzed. Experiment results showed that: pH 7.5, dosage of neutral protease enzyme 1.5%, hydrolysis time 3 h, rate of liquid to material 3∶1, and hydrolysis temperature 52 ℃ were the optimal processing conditions. Under these conditions, the extraction rate of spanish mackerel oil was 75.38%. Furthermore, by fatty acid analysis of spanish mackerel oil, 12 kinds of fatty acids were determined. The unsaturated fatty acids were 54.13% of the total fatty acids, and EPA was 8.40%, DHA was 7.06%, which showed higher content of EPA and DHA.

spanish mackerel oil； enzymatic hydrolysis; fatty acid; response surface methodology

10.11830/ISSN.1000-5013.201605014

2015-09-28

黃惠莉(1962-)，女，教授，主要從事海洋水產(chǎn)資源開發(fā)利用的研究.E-mail:hlhuang@hqu.edu.cn.

福建省重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(2013N0022)

TS 224； TQ 644

A

1000-5013(2016)05-0595-05