6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型行為學(xué)及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化

孫玉芝，趙貝貝，雒曉東

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518113

6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型行為學(xué)及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化

孫玉芝1，趙貝貝2，雒曉東1

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518113

目的：觀察6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型（PD）不同時間點行為學(xué)及左側(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺（DA）和乙酰膽堿（Ach）含量的變化。方法：采用6-OHDA左側(cè)紋狀體兩點注射法建立PD大鼠模型，觀察術(shù)后不同時間點大鼠經(jīng)阿撲嗎啡（APO）誘導(dǎo)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為改變，ELISA法測定各時間點大鼠左側(cè)紋狀體區(qū)DA和Ach含量，HE染色觀察左側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：行為學(xué)方面：假手術(shù)組各時間點大鼠經(jīng)APO誘導(dǎo)無旋轉(zhuǎn)行為；6-OHDA組大鼠經(jīng)APO誘導(dǎo)出現(xiàn)異常旋轉(zhuǎn)行為，48 h后右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度逐漸增快，4周右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到高峰，4周到8周恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度穩(wěn)定。DA和Ach含量變化：假手術(shù)組各時間點DA和Ach無明顯變化。6-OHDA組造模術(shù)后6h，DA含量降低，術(shù)后1周、2周、4周DA含量明顯減少，術(shù)后4周與8周DA含量比較無明顯差異。HE染色：假手術(shù)組各時間點左側(cè)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常。6-OHDA組6 h少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹，24 h、48 h、1周可見大量神經(jīng)細(xì)胞腫脹，部分核裂變，膠質(zhì)細(xì)胞增多，2 w時神經(jīng)細(xì)胞腫脹減輕，核仁明顯偏移或破裂，神經(jīng)元數(shù)量減少，4周、8周神經(jīng)細(xì)胞凝固性壞死，伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性或局限性增生。結(jié)論：6-OHDA組造模后，隨著造模時間延長，大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)DA含量逐漸下降，Ach含量逐漸上升，于術(shù)后4周達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，與大鼠右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為表現(xiàn)一致；HE染色見左側(cè)紋狀體神經(jīng)元隨時間延長表現(xiàn)為變性、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生。

帕金森??；6-羥基多巴胺（6-OHDA）；多巴胺（DA）；乙酰膽堿（Ach）；動物實驗；雄性大鼠

多巴胺（DA）和乙酰膽堿（Ach）是黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)通路內(nèi)兩種重要神經(jīng)遞質(zhì)，有實驗研究表明，當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元減少60%～80%，DA含量下降到正常的30%，突觸處DA含量減少消失，對突觸后結(jié)構(gòu)抑制作用消除，導(dǎo)致Ach功能過度活化，兩者失衡就會出現(xiàn)帕金森（PD）癥狀［1～2］，6-羥基多巴胺（6-OHDA）立體定向損毀黑質(zhì)紋狀體建立偏側(cè)PD大鼠模型是目前應(yīng)用最為廣泛的動物模型之一。本實驗采用左側(cè)紋狀體兩點注射6-OHDA法建立PD大鼠模型，術(shù)后不同時間點觀察PD大鼠紋狀體DA與Ach含量的變化、行為學(xué)變化以及中腦黑質(zhì)區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化，以評估PD大鼠模型的穩(wěn)定性及提示最佳干預(yù)時間，為臨床實驗提供可參考的依據(jù)。

1　實驗材料

1.1實驗動物健康雄性SPF級SD大鼠133只，體重220±20 g，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2008-0094。大鼠飼養(yǎng)在廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院SPF級實驗動物中心，自由飲水、進(jìn)食。

1.2儀器和試劑主要儀器：TL-251603型大鼠腦立體定位儀、YD-129智能生物組織脫水機、YD-6L石蠟包埋冷凍機、YD-AB石蠟切片機、XS-105DU精密分析天平等。主要實驗試劑：6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）、抗壞血酸、蘇木素染液、大鼠乙酰膽堿（ACH）酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠多巴胺（DA）酶聯(lián)免疫試劑盒。配制試劑：①10%水合氯醛溶液：水合氯醛10 g，生理鹽水稀釋并定容至100 mL，于4℃冰箱保存；②6-OHDA溶液：5 mg 6-OHDA溶解于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水至1 mL，迅速分裝，錫箔紙包裹避光，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2　實驗方法

2.1動物分組雄性SD大鼠133只常規(guī)飼養(yǎng)1周，大鼠稱重后按照體重從輕到重進(jìn)行標(biāo)號，隨機分為假手術(shù)組和6-OHDA組，然后按照術(shù)后6 h、24 h、48 h、1周、2周、4周、8周分為7個亞組，6-OHDA組各時間點11只和假手術(shù)組各時間點8只。

2.26-OHDA誘導(dǎo)PD動物模型制備所有大鼠造模前經(jīng)APO（0.5 mg/kg）頸背部皮下注射誘發(fā)，確定無異常旋轉(zhuǎn)行為。采用左側(cè)紋狀體兩點注射6-OHDA法制備PD模型。大鼠以10%水合氯醛（0.35 mL/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭頂毛發(fā)備皮，切開皮膚，充分暴露前囟、正中縫、人字縫，調(diào)整前囟與人字點處于同一水平。記錄前囟坐標(biāo)，參照Paxions大鼠腦立體定位圖譜［3］，確定左側(cè)紋狀體兩點坐標(biāo)，坐標(biāo)1：前囟前1.2 mm，矢狀縫左側(cè)2.2 mm，硬膜下4.0～6.0 mm；坐標(biāo)2：前囟后1.0 mm，矢狀縫左側(cè)4.4 mm，硬膜下4.5～6.5 mm（見圖1，圖2）。微量進(jìn)樣器吸取6-OHDA溶液（5 ug/uL）3 μL，分別緩慢進(jìn)針達(dá)6.0 mm和6.5 mm處，在4.0～6.0 mm和4.5～6.5 mm之間以1 μL/min速度注射，注射完畢后留針15 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。傷口處涂抹適量紅霉素軟膏，腹腔注射青霉素防止感染，術(shù)中、術(shù)后注意動物保暖，待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。

圖1　左側(cè)紋狀體坐標(biāo)

圖2　左側(cè)紋狀體坐標(biāo)

2.3假手術(shù)組動物制備假手術(shù)組左側(cè)紋狀體兩點坐標(biāo)定位同6-OHDA組模型制備。假手術(shù)組大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)兩點分別注射含0.02%抗環(huán)血酸生理鹽水溶液3 μL，操作步驟同PD模型制備。

2.4大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測相應(yīng)時間點取材前進(jìn)行APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測。受試大鼠頸背部皮下注射APO（0.5 mg/kg），記錄開始旋轉(zhuǎn)后30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計算旋轉(zhuǎn)速度，并觀察其行為表現(xiàn)。

2.5標(biāo)本采集術(shù)后相應(yīng)時間點取材，6-OHDA各時間點造模成功和假手術(shù)組分別抓取6只大鼠腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后，立即斷頭取腦，在冰上迅速分離出大鼠左側(cè)紋狀體，稱重，-80℃冰箱保存待測。各組中剩余大鼠腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉后，先后灌注生理鹽水、4℃4%多聚甲醛溶液（200～250 mL），當(dāng)大鼠全身僵硬表示灌注完成，然后迅速斷頭取鼠腦切取中腦部位，置于4%多聚甲醛固定液于4℃冰箱過夜，梯度脫水，石蠟包埋，依據(jù)圖譜于黑質(zhì)部位連續(xù)切片進(jìn)行HE染色。

2.6ELISA法測定大鼠左側(cè)紋狀體組織裂解液中DA、Ach含量用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，向包被抗DA、Ach抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗DA、Ach抗體、HRP標(biāo)記的親和素，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色，并在酸作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色。顏色深淺和樣本中DA、Ach呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算出樣本濃度。

2.7大鼠中腦黑質(zhì)致密部HE染色中腦組織塊經(jīng)4%多聚甲醛內(nèi)外固定后，全自動組織脫水機脫水，石蠟包埋，石蠟切片機切片、染色。

2.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料數(shù)據(jù)采用（±s）表示；各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性，采用單向方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。

3　實驗結(jié)果

3.1大鼠行為學(xué)測試結(jié)果見表1，表2。假手術(shù)組造模后6 h、24 h、48 h出現(xiàn)少動、拒食、豎毛表現(xiàn)，1周、2周、4周、8周的大鼠無異常行為表現(xiàn)。假手術(shù)組各時間點大鼠給予APO頸背部皮下注射未出現(xiàn)異常旋轉(zhuǎn)行為。

表1　術(shù)后不同時間點APO誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為表現(xiàn)

6-OHDA組大鼠出現(xiàn)不同程度倦臥、少動、運動遲緩、自發(fā)性右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為（向健側(cè)旋轉(zhuǎn)）、尾僵，給予APO頸背部皮下注射后首先出現(xiàn)木僵、弓背或顫抖，1～5 min后出現(xiàn)典型右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，少數(shù)出現(xiàn)向右側(cè)小環(huán)形運動，常伴豎毛、搔耳、咬足、身體翻轉(zhuǎn)、易激惹、嗅探、覓食、閉眼、洗臉樣等動作，少數(shù)大鼠出現(xiàn)恒定左旋行為。6-OHDA組24 h與6 h大鼠右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；48 h、1周、2周、4周旋轉(zhuǎn)速度逐漸增快，分別與相應(yīng)前一時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；4周旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到高峰，4周與8周恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2大鼠左側(cè)紋狀體DA與Ach含量動態(tài)變化見表3。假手術(shù)各時間點DA、Ach含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。6-OHDA組術(shù)后6 h DA含量降低，與假手術(shù)組6 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；6-OHDA組術(shù)后24 h、48 h DA含量無明顯變化；6-OHDA組術(shù)后1周、2周、4周DA含量明顯降低，分別與相應(yīng)前一時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；6-OHDA組術(shù)后4周與8周DA含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。6-OHDA組術(shù)后6 h、24 h Ach含量無明顯變化，與假手術(shù)組相應(yīng)時間點比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；6-OHDA組術(shù)后48 h、1周、2周、4周Ach含量明顯升高，分別與相應(yīng)前一時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；6-OHDA組術(shù)后4周與8周Ach含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　術(shù)后不同時間點APO誘發(fā)大鼠恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度（r/min）（±s）

表2　術(shù)后不同時間點APO誘發(fā)大鼠恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度（r/min）（±s）

注：6-OHDA組6 h、24 h、48 h各時間點的大鼠只數(shù)包括恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)4-7 r/min及恒定右側(cè)小環(huán)形運動的大鼠。與假手術(shù)組各相應(yīng)時間點比較，①P＜0.05；與同組各前一個時間點比較，②P＜0.05

組別假手術(shù)組恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)大鼠只數(shù)30min平均旋轉(zhuǎn)速度（r/min）0 0 0 0 0 0 0 6-OHDA組術(shù)后時間6 h 24 h 48 h 1 w 2 w 4 w 8 w 6 h 24 h 48 h 1 w 2 w 4 w 8 w 0 0 0 0 0 0 0 8 8 8 8 8 8 9 6.25±1.98①6.88±1.55①9.13±1.46①②11.38±2.50①②13.50±1.77①②15.63±2.66①②16.78±2.11①

表3　不同時間點大鼠左側(cè)紋狀體區(qū)DA、Ach含量比較（±s）ng/mL

表3　不同時間點大鼠左側(cè)紋狀體區(qū)DA、Ach含量比較（±s）ng/mL

與假手術(shù)組6 h比較，①P＜0.05；與同組各前一個時間點比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組別假手術(shù)組樣本數(shù)（只）6-O HD A組術(shù)后時間6 h 24 h 48 h 1 w 2 w 4 w 8 w 6 h 24 h 48 h 1 w 2 w 4 w 8 w 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 D A 12.38±1.45 12.20±1.04 12.83±1.12 12.57±1.30 12.18±1.39 12.07±1.24 12.37±1.36 10.73±1.34①9.23±1.02②8.65±0.98 7.13±0.61②5.43±0.95③3.23±0.45③3.20±0.50 A ch 19.53±3.60 19.04±3.51 19.98±3.17 19.72±2.88 18.27±2.17 18.67±1.01 19.05±2.57 19.57±3.64 20.48±2.90 23.12±1.73②26.32±1.64②29.47±2.36②32.85±1.82②32.87±2.70

圖3　HE染色觀察大鼠左側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化（400×）

3.3大鼠左側(cè)中腦黑質(zhì)致密區(qū)HE染色光鏡下觀察見圖3。光鏡下觀察，假手術(shù)組各時間點左側(cè)黑質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元形態(tài)完整，排列整齊，數(shù)量多，細(xì)胞核清晰，核仁明顯，神經(jīng)纖維排列整齊且結(jié)構(gòu)緊密。6-OHDA組6 h可見部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹，胞核稍大；24 h、48 h可見大量神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹，細(xì)胞核變大，核呈空泡狀，部分出現(xiàn)核裂解，部分胞體溶解，膠質(zhì)細(xì)胞增多；1周可見神經(jīng)細(xì)胞水腫稍減輕，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，部分神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)4～6個膠質(zhì)細(xì)胞圍繞，形成衛(wèi)星現(xiàn)象；2周見神經(jīng)細(xì)胞腫脹減輕，核仁明顯偏移或破裂；隨著造模時間延長，神經(jīng)元數(shù)量減少，4周、8周見神經(jīng)細(xì)胞凝固性壞死，核仁不明顯，并伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性或局限性增生，可見膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入壞死神經(jīng)細(xì)胞的胞體或突起中，形成噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象。

4　討論

6-OHDA立體定向損毀黑質(zhì)紋狀體建立偏側(cè)PD大鼠模型是目前應(yīng)用最為廣泛的動物模型之一。6-OHDA立體定向注射單側(cè)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞被選擇性毀損，使得兩側(cè)大腦半球機能不對稱，損毀側(cè)DA含量減少，引起偏側(cè)損傷。給予多巴胺受體激動劑APO皮下注射后，出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。已有研究表明，黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損毀程度與APO誘導(dǎo)后大鼠健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)呈正相關(guān)［4］。且出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為可以量化，持續(xù)時間長，易于觀察，是評價和篩選治療PD藥物療效的可靠指標(biāo)。

實驗發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組6 h、24 h、48 h時間點，大鼠出現(xiàn)少動、拒食、豎毛等癥狀，這些表現(xiàn)是手術(shù)對機體創(chuàng)傷所引起。假手術(shù)組1周、2周、4周、8周時間點，大鼠無異常表現(xiàn)，活動自如，各時間點給予APO后未見異常旋轉(zhuǎn)行為。而6-OHDA組注射6h后出現(xiàn)少動、拒食、豎毛的表現(xiàn)，經(jīng)APO頸背部皮下注射后，5只大鼠出現(xiàn)典型右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，且旋轉(zhuǎn)速度≥7 r/min，2只大鼠有典型右旋行為，旋轉(zhuǎn)速度為4-7 r/min，1只大鼠表現(xiàn)為右側(cè)小環(huán)形運動，速度≥7 r/min，1只出現(xiàn)恒定左側(cè)旋轉(zhuǎn)，2只無旋轉(zhuǎn)行為，說明6-OHDA注入紋狀體后，通過黑質(zhì)紋狀體通路的轉(zhuǎn)運，迅速對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元造成損傷。由于大鼠個體差異及對藥物的敏感程度不同，部分藥物尚未轉(zhuǎn)運至中腦黑質(zhì)，以及手術(shù)過程中藥物損耗均可造成損傷程度不同。24 h大鼠平均旋轉(zhuǎn)速度與6 h組無顯著差異，考慮在損傷初期，損傷側(cè)代償性分泌DA以維持兩側(cè)DA含量平衡。隨著術(shù)后時間延長，大鼠恒定右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度逐漸加快，4周達(dá)到高峰，8周與4周比較無顯著差異。通過中腦黑質(zhì)組織HE染色，可以看到，6-OHDA組術(shù)后6 h即見到部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)急性水腫，24 h、48 h、1周神經(jīng)細(xì)胞水腫均較明顯，隨后神經(jīng)細(xì)胞水腫逐漸減輕，4周、8周神經(jīng)細(xì)胞凝固壞死，大量膠質(zhì)細(xì)胞增生。因此，我們可以認(rèn)為6-OHDA紋狀體注射6 h即對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元造成急性損傷，4周后大鼠旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

假手術(shù)組大鼠各時間點DA和Ach含量未見明顯變化。而6-OHDA組注射造模術(shù)后6 h即可見DA含量下調(diào)，48 h與24 h比較有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，考慮6-OHDA注射早期，機體應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致代償性的DA分泌增多，隨著造模時間延長，紋狀體區(qū)DA含量逐漸下降，術(shù)后4周、8周DA含量沒有顯著性差異。Ach含量在術(shù)后6 h、24 h與相應(yīng)假手術(shù)組時間點比較無顯著性差異，48 h Ach明顯上調(diào)，隨著造模時間延長，1周，2周，4周呈現(xiàn)梯度上升，4周達(dá)到頂峰，8周與4周比較無顯著差異。由此可見，紋狀體內(nèi)DA含量隨著PD病情進(jìn)展逐漸下降，Ach在初期沒有明顯變化，隨后逐漸升高。DA含量下降，引起Ach含量相對升高，隨著多巴胺神經(jīng)元損傷加重，DA含量減少，對Ach拮抗作用大大降低，Ach含量絕對升高，造成兩種遞質(zhì)比例嚴(yán)重失調(diào)。曹非［5］等將6-OHDA注射入黑質(zhì)致密部、中腦腹側(cè)被蓋部，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后7天、14天、21天紋狀體Ach含量逐漸增加，且大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)也不斷增加，與本次實驗研究結(jié)果較為一致。因此根據(jù)大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)和紋狀體區(qū)DA、Ach含量動態(tài)變化，6-OHDA造模術(shù)后4 w，模型可達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài)，且隨時間延長，未見損傷有好轉(zhuǎn)趨勢，因此認(rèn)為造模4周-8周是藥物干預(yù)及療效評價的最佳時間窗。

目前采用6-OHDA建立PD大鼠模型被研究者廣泛使用，但由于動物個體因素、注射部位、注射劑量、定位的準(zhǔn)確性以及個體操作技術(shù)等因素影響，模型成功率不盡相同，差別較大，本實驗造模成功率可達(dá)90%（6 h、24 h、48 h時間點大鼠經(jīng)APO誘發(fā)右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度≥4 r/min；1周、2周、4周、8周大鼠右側(cè)旋轉(zhuǎn)速度≥7 r/min判定造模成功）。總結(jié)實驗體會有以下幾點：①選擇動物性別問題。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可以調(diào)節(jié)DA釋放和攝取，Becker［6］等研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以減輕6-OHDA造成的大鼠紋狀體DA損耗。此外，雌激素具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，抗神經(jīng)萎縮等作用［7～10］。故實驗選用雄性大鼠。②定位準(zhǔn)確。準(zhǔn)確定位前囟和人字點，并調(diào)整門齒桿，確保顱骨水平位。由于微量注射器針頭較細(xì)，易彎曲，不易準(zhǔn)確定位，因此我們采用1 mL注射器針頭更有利于定位準(zhǔn)確。③6-OHDA溶液配制。由于6-OHDA易于氧化，配制時注意避光，選用含0.02%抗壞血酸生理鹽水，將5 mg 6-OHDA一次性溶解，濃度為5 ug/uL，然后快速分裝，避光保存于-20℃冰箱。此溶液配制嚴(yán)格操作能夠最大程度保證6-OHDA藥物有效濃度。④關(guān)于微量注射器。使用前注意檢查針頭是否通暢和垂直，抽取溶液時注意避免空氣進(jìn)入，抽取溶液后微量進(jìn)樣器針身迅速給予錫箔紙包裹固定于立體定位儀。⑤進(jìn)針深度。以針孔斜面中心點計算，注射時使針孔斜面朝向鼠尾方向，注射速度控制在1 ul/min，防止藥液倒流，如果條件允許，建議使用微量泵，注射完畢留針10 min后緩慢退針，以保證6-OHDA足量達(dá)到預(yù)定位置。⑥術(shù)中、術(shù)后注意動物保暖，術(shù)后3天單籠飼養(yǎng)。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

The Behavioristics of Parkinson's Disease Rat Model Induced by 6-OHDA and Dynamic Change of Neurotransmitter

SUN Yuzhi，ZHAO Beibei，LUO xiaodong

Objective：To observe behavioristics of Parkinson's disease（PD）rat model induced by 6-OHDA on different time point and levels of dopamine（DA）and acetyl choline（Ach）inside left corpus striatum.Methods：Established PD rat model by 6-OHDA two points injection on left corpus striatum.Rotational behavior changes of rats were observed after induction on different time point after injection.DA and Ach content of left corpus striatum on different time point were detected by ELISA method，pathomorphism change of dopaminergic nerve cell of left midbrain nigra area by HE coloration.Results：The rats in sham-operation group have no rotational behaviors after apomorphine（APO）induction on every time point.The rats in 6-OHDA group have abnormal rotational behaviors after APO induction，rotational speed on the right side increased gradually after 48h，rotational speed on the right side peaked after 4-week，constant rotational speed remains stable from 4-week to 8-week.Contents of DA and Ach in sham-operation group have no obvious changes on every time point.Six hours after modeling，DA contents in 6-OHDA group were decreased，1-week，2-week and 4-week after operation，DA contents were decreased obviously.There have no obvious difference of DA contents between 4-week and 8-weekw after operation. Neuron cells morphology was normal on left substantia nigra in sham-operation group.A few of neuron cells was swelling in 6-OHDA group after 6h，a large number of neuron cells swelling could be found after 24h，48h and 1-week，in which there were nuclear fission，and number of gliacyte were increase.The neuron cells swelling were relieved after 2-week，nucleolus were skewed or broke obviously，number of neuron cells were decreased，neuron cells were appeared coagulative necrosis after 4-week and 8-week，a large number of gliacyte were appears diffuse or focal hyperplasia.Conclusion：After modeling，with modeling time increase，DA content in left corpus striatum of 6-OHDA group were decreased gradually，Ach contentwere increased gradually，and comes to steady state after 4h of operation，which correspond with rotational behaviors of right side.The left corpus striatum neuron cells were shown degeneration during coloration，necrosis and gliocyte proliferation over time.

Parkinson'sdisease（PD）；Hydroxydopamine（6-OHDA）；Dopamine（DA）；Acetyl choline（Ach）；Animal experiment；Male rat

R742.5

A

0256-7415（2016）09-0225-06

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.099

2016-04-06

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)強省科研課題（20132150）

孫玉芝（1978-），女，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療帕金森病的臨床與實驗研究。

雒曉東，E-mail：64699609@qq.com。