IL-10基因多態(tài)性及血清水平與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的關(guān)系

邵得明，邱虹，于向東，馬向輝，李云超，王玉玨

IL-10基因多態(tài)性及血清水平與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的關(guān)系

邵得明1，邱虹2，于向東2，馬向輝1，李云超2，王玉玨2

目的分析白細(xì)胞介素（IL）-10基因啟動(dòng)子區(qū)-1082G/A、-819C/T單核苷酸多態(tài)性（SNP）及血清IL-10水平與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（IAs）發(fā)病的關(guān)系。方法運(yùn)用PCR及DNA直接測序的方法，檢測206例IAs患者（IAs組）和187例非IAs患者（對照組）的IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)，-1082G/A、-819C/T的基因型頻率和等位基因頻率，χ2檢驗(yàn)分析IAs組和對照組之間的差異；采用ELISA法檢測血清中IL-10水平，t檢驗(yàn)分析2組之間的差異。結(jié)果IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-1082G/A位點(diǎn)的GG基因型和GA+AA基因型，以及G等位基因和A等位基因頻率比較，IAs組較對照組GA+AA基因型以及A等位基因頻率更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），GA+AA基因型（OR值為4.137，95%CI 2.476～6.914）和A等位基因（OR值為3.368，95%CI 2.476～4.583）攜帶者有更高的IAs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-819C/T位點(diǎn)的CC基因型和CT+TT基因型以及C等位基因和T等位基因頻率比較，IAs組較對照組CT+TT基因型以及T等位基因頻率更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CT+TT基因型（OR值為3.393，95% CI 1.952～5.900）和T等位基因（OR值為3.764，95%CI 2.730～5.192）攜帶者有更高的IAs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。IAs組血清IL-10水平低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)SNP影響IL-10表達(dá)，IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-1082G/A、-819C/T多態(tài)性與IAs的發(fā)病有關(guān)。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；白細(xì)胞介素10；單核苷酸多態(tài)性

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranial aneurysms，IAs）是指顱內(nèi)動(dòng)脈管壁局部的異常擴(kuò)張，其首次破裂發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后致殘率和致死率均可高達(dá)33%［1］。目前認(rèn)為IAs是由多種環(huán)境因素和多個(gè)基因共同作用而引發(fā)的多基因疾?。?］。炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與IAs發(fā)病的關(guān)系研究已有文獻(xiàn)報(bào)道［3］。白細(xì)胞介素（IL）-10是體內(nèi)重要的抑炎性細(xì)胞因子，本研究旨在探尋IL-10基因多態(tài)性及其血清水平

與IAs發(fā)病的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年5月—2015年8月在唐山市開灤總醫(yī)院和河北省遷安市人民醫(yī)院神經(jīng)外科住院治療的IAs患者206例（IAs組），以同期住院的187例非IAs患者作為對照組。IAs組動(dòng)脈瘤破裂致SAH者143例，多發(fā)動(dòng)脈瘤76例。所有IAs組患者均通過全腦血管造影（DSA）確診為顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤；均為散發(fā)性病例，無IAs家族史，排除動(dòng)靜脈畸形、馬凡綜合征、常染色體顯性遺傳性多囊腎病（ADPKD）等。對照組均經(jīng)磁共振血管成像（MRA）、CT血管造影（CTA）或DSA檢查排除IAs；所有研究對象均無動(dòng)脈瘤及SAH家族史，無卒中病史，無遺傳性結(jié)締組織病史，彼此無親緣關(guān)系，均為唐山地區(qū)漢族人，且均知情同意。2組臨床資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1Comparison of clinical information between two groups表1　2組臨床資料比較

1.2方法

1.2.1PCR檢測IL-10基因SNP位點(diǎn)-1082G/A、-819C/T的基因型分布采集393例研究對象的空腹肘正中靜脈血5 mL，提取基因組DNA。應(yīng)用美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)的GeneAmp?PCR 9700型基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，由國家人類基因組北方研究中心ABI 3730XL型DNA測序儀進(jìn)行DNA直接測序，并由相應(yīng)軟件平臺(tái)發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)，-1082G/A和-819C/T的基因型和等位基因頻率。-1082G/A引物上游5′-GATGAATACCCAAGAC TTCTCC-3′，下游5′-GATGAGTGATTTGCCCTGA-3′；-819C/T引物上游5′-GGCACTGGTGTACCCTTGTA-3′，下游5′-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。所有PCR相關(guān)試劑均由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血清IL-10水平靜脈血離心取血清，置-20℃保存。用IL-10 ELISA試劑盒（上海瑞齊生物科技有限公司）檢測人血清IL-10水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析以檢驗(yàn)樣本是否具有群體代表性，P＞0.05則認(rèn)為群體基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行雙遍錄入，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料比較采用2組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DNA測序結(jié)果檢測標(biāo)本均成功擴(kuò)增出目的片段，-1082G/A PCR產(chǎn)物經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3種基因型：野生純合子GG基因型，雜合子GA基因型，突變純合子AA基因型，見圖1。-819C/T PCR產(chǎn)物經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3種基因型：野生純合子CC基因型，雜合子CT基因型，突變純合子TT基因型，見圖2。

Fig.1Sequencing results of genotypes in IL-10-1082G/A圖1　IL-10-1082G/A基因型測序結(jié)果

Fig.2Sequencing results of genotypes in IL-10-819C/T圖2　IL-10-819C/T基因型測序結(jié)果

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果-1082G/A IAs組（χ2=0.28，P=0.61），對照組（χ2=1.35，P= 0.26）；-819C/T IAs組（χ2=2.78，P=0.11），對照組（χ2= 0.25，P=0.55），本研究樣本符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與IAs發(fā)病的關(guān)系與對照組比較，IAs組-1082G/A位點(diǎn)GA+AA基因型比例、A等位基因頻率更高，-819C/ T位點(diǎn)CT+TT基因型比例、T等位基因頻率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且-1082G/A位點(diǎn)GA+ AA基因型、A等位基因以及-819C/T位點(diǎn)CT+TT基因型、T等位基因罹患IAs的危險(xiǎn)性明顯增高，見表2、3。

2.42組血清IL-10水平比較IAs組及對照組血清IL-10水平分別為（10.0±2.2）ng/L和（18.2±1.8）ng/L，IAs組較對照組明顯降低（t=40.540，P＜0.01）。

Tab.2Polymorphism distribution of IL-10-1082G/A in IAs group and control group表2　IAs組與對照組IL-10-1082G/A位點(diǎn)的多態(tài)性分布例（%）

Tab.3Polymorphism distribution of IL-10-819C/T in IAs group and control group表3　IAs組與對照組IL-10-819C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布例（%）

3　討論

IAs破裂引起的SAH是嚴(yán)重的腦血管事件，其后果為1/3死亡，1/3遺留嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，另1/3好轉(zhuǎn)［4］。而社區(qū)人群影像學(xué)篩查的IAs檢出率僅為0.2%～1.8%［5］。越來越多的證據(jù)表明，免疫炎性反應(yīng)與IAs的形成密切相關(guān)［6-7］。最近的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，IAs瘤壁組織平滑肌細(xì)胞減少或消失，纖維組織增生明顯，動(dòng)脈壁中膜及外膜可見有大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤［8］。聚集的炎癥細(xì)胞會(huì)分泌多種促炎性細(xì)胞因子，如IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α等，繼而發(fā)揮致炎作用［9］。炎性細(xì)胞因子及其基因多態(tài)性與IAs的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。

IL-10是一種多效性的細(xì)胞因子，其能抑制Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞等合成分泌IL-1β、TNF-α、干擾素γ等炎性細(xì)胞因子，下調(diào)細(xì)胞免疫反應(yīng)，還能通過下調(diào)MHCⅡ類抗原與CD54、CD80等協(xié)同刺激分子的表達(dá)，削弱其抗原呈遞能力，從而抑制炎癥反應(yīng)。有研究表明，IL-10基因轉(zhuǎn)錄起始部位上游啟動(dòng)子區(qū)域-1082G/A、-819C/T、-592C/A處有3個(gè)SNP位點(diǎn)［10］，其與IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性及血清IL-10水平有關(guān)［11］，即-1082G/A、-819C/T不同的等位基因改變了基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程，-1082G、-819C、-592C與IL-10的高表達(dá)有關(guān)，而-1082A、-819T、-592A則與IL-10的低表達(dá)有關(guān)。研究表明，IL-10-819位點(diǎn)與-592位點(diǎn)等位基因緊密連鎖［12］，故本研究選取-1082G/A、-819C/T為靶點(diǎn)。IL-10基因多態(tài)性與某些疾病的易感性有關(guān)，Vinod等［13］報(bào)道，在南印度人群中，IL-10-1082G/A位點(diǎn)AA基因型是乳腺癌的危險(xiǎn)因素，相對于GA基因型，AA基因型與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)（OR=2.854，95%CI 1.68～4.849）。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，IAs組-1082位點(diǎn)A等位基因、-819位點(diǎn)T等位基因頻率更高，且IAs組血清IL-10水平顯著降低。因此，IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-1082G/A、-819C/T位點(diǎn)SNP可能與唐山地區(qū)漢族人IAs的發(fā)病有關(guān)；-1082G/A位點(diǎn)A等位基因攜帶者、-819C/T位點(diǎn)T等位基因攜帶者可能增加IAs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其可能機(jī)制為：IL-10 -1082A等位基因及-819T等位基因直接影響轉(zhuǎn)錄因子EtsY與該序列DNA的結(jié)合，使之不能結(jié)合EtsY從而抑制轉(zhuǎn)錄，IL-10基因的表達(dá)下降，因而IL-10的血清水平降低。IL-10的減少則不能抑制TNF-α等促炎性細(xì)胞因子生成，隨著TNF-α水平的不斷增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，引起包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的炎性細(xì)胞滲入動(dòng)脈壁參與炎性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在IAs瘤壁破壞性重建中的具有至關(guān)重要的作用［14］，其可以釋放一氧化氮，增強(qiáng)炎性反應(yīng)，并引起平滑肌細(xì)胞凋亡，最重要的一個(gè)作用是分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9，直接導(dǎo)致膠原蛋白和彈性蛋白降解，分解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)，在血流動(dòng)力學(xué)改變等共同作用下，誘導(dǎo)動(dòng)脈瘤的形成。反之，IL-10-1082G等位基因及-819C等位基因攜帶者的基因表達(dá)增加，血漿IL-10水平相對較高，炎癥抑制效應(yīng)明顯，對血管壁有保護(hù)作用，降低了IAs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究為IAs的病因及發(fā)病機(jī)制研究提供了一個(gè)新的方向，有助于進(jìn)一步地深入研究以及對高危人群進(jìn)行早期基因干預(yù)，但尚需在多種族、大樣本研究中得到驗(yàn)證。

［1］Lin N，Ho A，Charoenvimolphan N，et al.Analysis of morphological parameters to differentiate rupture status in anterior communicating artery aneurysms［J］.PLoS One，2013，8（11）：e79635.doi：10.1371/journal.pone.0079635.

［2］Ruigrok YM，Rinkel GJ，Algra A，et al.Characteristics of intracranial aneurysms in patients with familial subarachnoid hemorrhage［J］.Neurology，2004，62（6）：891-894.

［3］Sun H，Zhang D，Zhao J.The interleukin-6 gene-572G＞C promoter polymorphism is related to intracranial aneurysms in Chinese Han nationality［J］.Neurosci Lett，2008，440（1）：1-3.doi：10.1016/j.neulet.2008.04.077.

［4］Caranci F，Briganti F，Cirillo L，et al.Epidemiology and genetics of intracranial aneurysms［J］.Eur J Radiol，2013，82（10）：1598-1605.doi：10.1016/j.ejrad.2012.12.026.

［5］Connolly ES Jr.International study of unruptured intracranial aneurysms［J］.J Neurosurg，2014，121（5）：1022-1023.doi：10.3171/2013.10.JNS131485.

［6］Chalouhi N，Ali MS，Jabbour PM，et al.Biology of intracranial aneurysms：role of inflammation［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，32（9）：1659-1676.doi：10.1038/jcbfm.2012.84.

［7］Zhang HF，Zhao MG，Liang GB，et al.Expression of proinflammatory cytokines and the risk of intracranial aneurysm［J］. Inflammation，2013，36（6）：1195-1200.doi：10.1007/s10753-013-9655-6.

［8］Liu Z，Zhao Y，Wei F，et al.Treatment with telmisartan/rosuvastatin combination has a beneficial synergistic effect on ameliorating Th17/Treg functional imbalance in hypertensive patients with carotid atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2014，233（1）：291-299.doi：10.1016/j.atherosclerosis.2013.12.004.

［9］Starke RM，Raper DM，Ding D，et al.Tumor necrosis factor-α modulates cerebral aneurysm formation and rupture［J］.Transl Stroke Res，2014，5（2）：269-277.doi：10.1007/s12975-013-0287-9.

［10］Saber SE，Nagy MM，Sch?fer E.Comparative evaluation of the shaping ability of ProTaper Next，iRaCe and Hyflex CM rotary NiTi files in severely curved root canals［J］.Int Endod J，2015，48（2）：131-136.doi：10.1111/iej.12291.

［11］Falconer K，Gonzalez VD，Reichard O，et al.Spontaneous HCV clearance in HCV/HIV-1 coinfection associated with normalized CD4 counts，low level of chronic immune activation and high level of T cell function［J］.J Clin Virol，2008，41（2）：160-163.

［12］Scarpelli D，Cardellini M，Andreozzi F，et al.Variants of the interleukin-10 promoter gene are associated with obesity and insulin resistance but not type 2 diabetes in caucasian italian subjects［J］.Diabetes，2006，55（5）：1529-1533.

［13］Vinod C，Jyothy A，Vijay Kumar M，et al.A common SNP of IL-10（-1082A/G）is associated with increased risk of premenopausal breast cancer in South Indian women［J］.Iran J Cancer Prev，2015，8（4）：e3434.doi：10.17795/ijcp-3434.

［14］Kanematsu Y，Kanematsu M，Kurihara C，et al.Critical roles of macrophages in the formation of intracranial aneurysm［J］.Stroke，2011，42（1）：173-178.doi：10.1161/STROKEAHA.110.590976.

（2015-12-30收稿2016-04-11修回）

（本文編輯李國琪）

The relationship between gene polymorphism and serum expression of interleukin-10 with intracranial aneurysm

SHAO Deming1，QIU Hong2，YU Xiangdong2，MA Xianghui1，LI Yunchao2，WANG Yujue2
1 Department of Neurosurgery，Qian'an People's Hospital，Qian'an 064400，China；2 Department of Neurosurgery，Kailuan General Hospital

ObjectiveTo analyze the associations of the interleukin-10（IL-10）promoter-1082G/A and-819C/T single nucleotide polymorphism（SNP）and serum level of IL-10 with intracranial aneurysm（IAs）.MethodsThe polymerase chain reaction（PCR）and DNA direct sequencing methods were used to detect IL-10 gene promoter district two SNP site，-1082G/A and-819C/T genotype frequency and allele frequency in 206 patients with IAs and 187 controls.Chisquare test was used to analyze differences between two groups.The serum level of IL-10 was analyzed by ELISA，and ttest was used to analyze significant differences between two groups.ResultsThere were significant differences in genotypes of GG and GA+AA，as well as the alleles G and A，in-1082G/A locus between IAs group and control group（P＜0.01）.There were higher frequencies of genotype GA+AA and the allele A in IAs group than those in control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype GA+AA（OR=4.137，95%CI:2.476-6.914）and the allele A（OR=3.368，95%CI:2.476-4.583）.There were higher frequencies of the genotype CT+TT and the allele T in-819C/ T locus in IAs group than those of control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype CT+TT（OR=3.393，95%CI:1.952-5.900）and the allele T（OR=3.764，95%CI:2.730-5.192）.The serum level of IL-10 was significantly lower in IAs group than that of control group（P＜0.01）.ConclusionThe IL-10 promoter SNP influences the expression of IL-10.IL-10 promoter-1082G/A and-819C/T polymorphisms are correlated with the formation of IAs.

intracranial aneurysms；interleukin-10；single nucleotide polymorphism

R651.1+2

A

10.11958/20160003

1河北省遷安市人民醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編064400）；2開灤總醫(yī)院神經(jīng)外科

邵得明（1979），男，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事腦血管病的基礎(chǔ)研究