二硫蘇糖醇還原—高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中的還原型維生素C和總維生素C含量

鄭小曼　顧明華　沈方科

摘要：研究建立高效液相色譜法（HPLC）快速檢測(cè)蔬菜中還原型維生素C含量的方法，并通過(guò)二流蘇糖醇（DDT）還原脫氫型維生素C，從而得到總維生素C、脫氫型維生素C含量。以3%偏磷酸為提取液，乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫銨溶液（體積比85 ∶ 15）為流動(dòng)相，流速為1.5 mL/min，采用Waters C-18（150 mm×3.9 mm，5 μm）反相色譜分離，用紫外檢測(cè)器于254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。結(jié)果表明：在1～500 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 6），所有蔬菜樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～1.83%，平均加標(biāo)回收率為99.89%。用該方法測(cè)定蔬菜中維生素C含量，結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好，適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的多種蔬菜。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）；二流蘇糖醇（DDT）；蔬菜；總維生素C；還原型維生素C

中圖分類號(hào)： S132；O652.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0304-03

維生素C是一種人類必需的營(yíng)養(yǎng)素[1]，其主要形式為L(zhǎng)-還原型、L-脫氫型，最主要的功能是參與膠原蛋白質(zhì)的合成，動(dòng)物缺乏維生素C會(huì)造成壞血病[2]。作為一種抗氧化劑和高活性物質(zhì)，維生素C參與許多新陳代謝過(guò)程，可以保護(hù)人體免于自由基的威脅，具有提高免疫力，預(yù)防癌癥、心臟病、中風(fēng)，保護(hù)牙齒和牙齦，抗衰老等許多生理作用[2-4]。有研究表明：一定劑量的維生素C可抗細(xì)胞DNA損傷[5]；在老鼠鉛中毒的同時(shí)及其后，補(bǔ)充維生素C可降低血鉛濃度[6]；此外，維生素C還具有預(yù)防乙醇對(duì)腦、肝損傷的作用[7]。人類自身不能夠制造維生素C，其廣泛的食物來(lái)源為各類新鮮果蔬，并且蔬菜中的總維生素C含量相比還原型維生素C更能夠表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，建立能夠快速檢測(cè)蔬菜中總維生素C含量的方法十分重要，能為人們的膳食營(yíng)養(yǎng)提供更為確切的參考，從而有效預(yù)防和抵制因體內(nèi)缺少維生素C而帶來(lái)的不利影響，提高人們的工作效率和生活質(zhì)量。

維生素C的測(cè)定方法有多種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。如《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的碘量法因其試驗(yàn)操作時(shí)不易把握酸度、碘易揮發(fā)等，使得測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度降低，不適于微量分析；而大多數(shù)水果、蔬菜的提取液具有一定色澤，又使得以顏色變化來(lái)辨別其滴定終點(diǎn)的國(guó)標(biāo)法2，6-二氯靛酚滴定法（GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測(cè)定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》）具有一定的局限性；此外，還包括容量法、苯肼比色法、熒光光度法、電位法、紫外分光光度法等，但是這些方法或存在所需試劑較多、試劑不穩(wěn)定、操作繁瑣等缺點(diǎn)[8-10]，或只能測(cè)定還原型維生素C含量，不能測(cè)定具有同樣生理功能的脫氫型維生素C含量，如熒光法、苯肼比色法[11]。

高效液相色譜（HPLC）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速高效且穩(wěn)定可靠、發(fā)展較快的分離技術(shù)，因其處理樣品簡(jiǎn)單快速，且能同時(shí)測(cè)定幾種維生素而被廣泛應(yīng)用于食品藥品中維生素含量的測(cè)定[8-17]。但是，該方法目前主要測(cè)定的是還原型維生素C[11]，而對(duì)蔬菜中同樣具有生理功能的脫氫型維生素C含量的檢測(cè)報(bào)道較少。本研究通過(guò)利用二硫蘇糖醇（DTT）能夠?qū)⒚摎湫途S生素C還原而不具有生理活性的二酮古洛糖酸則不會(huì)被還原[17-18]，并且與高效液相色譜法結(jié)合，可測(cè)定出還原型維生素C、總維生素C含量，從而得出脫氫型維生素C含量，以總維生素C含量表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈，色譜純；磷酸二氫銨，分析純；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，維生素C含量≥99.7%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；偏磷酸，分析純；二硫蘇糖醇（DTT）；超純水，筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制；0.45 μm濾膜，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。小白菜、番茄，市購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜，美國(guó)；Waters DELTA-PAK C18色譜柱，日本；Waters 2998 PAD紫外檢測(cè)器；DP-01隔膜真空泵，天津市東康科技有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MILLI-Q型超純水裝置。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 Waters DELTA-PAK C18色譜柱，柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑3.9 mm，顆粒大小5 μm；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。根據(jù)本試驗(yàn)高效液相色譜儀的性能特點(diǎn)，選擇乙腈 -0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動(dòng)相；流速為1.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃；以保留時(shí)間定性，待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，以峰面積定量。

1.3.2 樣品制備 稱取新鮮小白菜、番茄樣品各4.00 g，迅速剪碎后加入少量3%偏磷酸研磨制成勻漿，用3%偏磷酸定容至100 mL棕色容量瓶中，過(guò)濾，再吸取一部分濾液過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜，然后按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，所得數(shù)值為還原型維生素C含量。脫氫型維生素C含量=維生素C總量-還原型維生素C含量，前提是將樣品中脫氫型維生素C還原為還原型維生素C。因此，另吸取 0.5 mL 濾液，加入1.00 mL 1%二硫蘇糖醇溶液（DTT），反應(yīng)還原 0.5 h 后，過(guò)0.45 μm 濾膜進(jìn)樣，同樣按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)數(shù)值為樣品溶液中的總維生素C量。

1.3.3 線性關(guān)系分析 準(zhǔn)確稱取50 mg維生素C，用1.5%偏磷酸溶液定容至100 mL棕色容量瓶中，得到500 mg/L維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；將其逐級(jí)稀釋得到50、10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，調(diào)整進(jìn)樣量，稀釋得到1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以峰面積的積分值對(duì)進(jìn)樣濃度（mg/L）進(jìn)行直線回歸。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 取所制得樣品4個(gè)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定維生素C含量的精密度。

1.3.5 回收率試驗(yàn) 采用加標(biāo)回收法，取2.00 mL勻漿樣品，分別加入2.00 mL濃度為50、100、500 mg/L的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)進(jìn)樣3次，取3次測(cè)定的平均值作為測(cè)定結(jié)果。將測(cè)定結(jié)果扣除樣品溶液的測(cè)定值，從而得到加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率，其計(jì)算公式為：

回收率=（加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值）/加標(biāo)量×100%。

1.3.6 最低檢測(cè)限的計(jì)算 以產(chǎn)生3倍儀器噪聲水平的進(jìn)樣量為檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C提取劑的選擇

考察不同提取劑（3%草酸、3%偏磷酸）對(duì)維生素C峰型的影響，結(jié)果表明：當(dāng)選擇3%草酸作為本研究蔬菜樣品提取劑時(shí)，出現(xiàn)維生素C峰尖圓滑不尖銳、基線不平等現(xiàn)象；而以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形（圖1），因此選擇3%偏磷酸作為蔬菜樣品提取劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

考察乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4不同比例（體積比 50 ∶ 50、75 ∶ 25、85 ∶ 15）對(duì)檢測(cè)時(shí)維生素C的峰形、保留時(shí)間等出峰情況的影響。結(jié)果表明：當(dāng)選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動(dòng)相時(shí)，不僅出峰時(shí)間提前，峰形也更好，也不存在峰形重疊等問(wèn)題，因此選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動(dòng)相。

2.3 色譜條件的選擇

用Waters 2998 PAD紫外檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，維生素C在245～255 nm波長(zhǎng)下吸光度較高，在254 nm吸光度最大，因此選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在超過(guò)樣品的檢測(cè)時(shí)間（4 min）后的6 min內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯的信號(hào)強(qiáng)度，因此確定樣品檢測(cè)時(shí)間為4 min。由圖2可以看出，所有樣品均能實(shí)現(xiàn)基線分離，而且峰形能滿足測(cè)定要求，維生素C的保留時(shí)間為0.866～0.929 min，檢測(cè)限為0.86 μg/L。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對(duì)應(yīng)峰面積的積分值對(duì)進(jìn)樣濃度（mg/L）進(jìn)行直線回歸。以濃度（x，mg/L）為自變量、峰面積（y）為因變量，方程式：y=167 33x-262 03，r=0.999 6，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～500 mg/L范圍內(nèi)線性良好，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的色譜結(jié)果見(jiàn)圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

2.5 蔬菜中維生素C含量的測(cè)定

由圖4、圖5可以看出，經(jīng)過(guò)DTT的還原，總維生素C的峰高高于還原型維生素C。由表1小白菜、番茄中還原型維生素C、總維生素C、氧化型維生素C的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，各提取液中維生素C的保留時(shí)間在0.898～ 0.995 min。

2.6 精密度試驗(yàn)

對(duì)同一小白菜、番茄提取液分別連續(xù)進(jìn)樣5次，由表2可見(jiàn)，精密度試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差為0.49～3.29，變異系數(shù)為0.63%～1.83%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.7 回收率試驗(yàn)

各取3份2 mL維生素C含量為25.106 mg/kg的小白菜提取液、維生素C含量為18.248 mg/kg的番茄提取液，分別加入2 mL不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定混合液中維生素C含量，每種混合液測(cè)定3次，取其平均值。由表3可見(jiàn)，回收率范圍為96.58%～103.59%，平均回收率為99.89%。

3 討論與結(jié)論

維生素C在pH值>7.6以上的溶液中非常不穩(wěn)定，但是在pH值<4的酸性溶液中較穩(wěn)定，3%草酸、3%偏磷酸皆滿足pH值

磷酸與維生素C的這些特點(diǎn)，本研究采用3%偏磷酸提取番茄、小白菜中的維生素C后，其峰形更為尖銳、基線相對(duì)平穩(wěn)，可見(jiàn)以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形。但是，由于偏磷酸不穩(wěn)定，需要現(xiàn)配現(xiàn)用才能保證提取效果。

利用高效液相色譜與二硫蘇糖醇還原維生素C相結(jié)合，對(duì)小白菜、番茄的還原型維生素C、總維生素C含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，新鮮小白菜中含有還原型維生素C含量為 62.297 mg/100 g，總維生素C含量為273.390 mg/100 g；新鮮番茄中還原型維生素C含量為45.888 mg/100 g，總維生素C含量為197.406 mg/100 g。總維生素C、還原型維生素C二者之差為脫氫型維生素C，本研究中小白菜、番茄的脫氫型維生素C含量分別為211.092、151.518 mg/100 g?？梢钥闯?，在本研究的小白菜、番茄中，脫氫型維生素C含量在總維生素C含量中占很大的比重，而脫氫型維生素C與還原型維生素C同樣具有生理功能，對(duì)人體健康的貢獻(xiàn)不可忽視。本研究認(rèn)為，只利用高效液相色譜法測(cè)定的還原型維生素C不足以說(shuō)明蔬菜中維生素C的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，應(yīng)利用二硫蘇糖醇的還原作用，得到的總維生素C含量更能表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

本研究標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，曲線在1～500 mg/L范圍內(nèi)線性良好，說(shuō)明曲線的線性關(guān)系較好，且測(cè)定濃度范圍較廣，分析中受樣品中其他雜質(zhì)的影響較小。測(cè)定小白菜、番茄中維生素C的含量，回收率為96.58%～10359%，說(shuō)明該方法具有所需試劑少、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。從本研究還可以看出，精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，說(shuō)明該方法重復(fù)性、再現(xiàn)性都是比較高的；而且從樣品色譜圖中看出，該方法分析維生素C的含量大約需要3 min，具有靈敏、快速的特點(diǎn)。本研究所用的這個(gè)分析方法是可靠的，它適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的廣泛蔬菜中還原型維生素C、總維生素C含量的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]郝學(xué)寧，郝嬙嬙，劉雪蓮. HPLC法測(cè)定果蔬中維生素C[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：30-31.

[2]王立家，李寬閣，劉淑蘭，等. 維生素C的營(yíng)養(yǎng)功能及應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（2）：106-107.

[3]余 瓊，齊衛(wèi)華，于 研，等. 維生素C保健功能的研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2008，21（6）：24-26.

[4]王艷穎，姜國(guó)斌，胡文忠，等. 高效液相色譜法測(cè)定草莓中維生素C含量[J]. 大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（2）：21-22，26.

[5]梁建成，汪春紅. 維生素C抗DNA損傷作用的研究進(jìn)展[C]. 武漢：營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第十屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編，2004.

[6]龍宇紅. 維生素C、維生素E對(duì)生長(zhǎng)期大鼠鉛中毒保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2004.

[7]孫丕健. 維生素C對(duì)大鼠酒精性腦和肝損傷的保護(hù)作用研究[D]. 蘇州：蘇州大學(xué)，2011.

[8]徐 瑯，宋曉峰，錢(qián)志余. HPLC法測(cè)定野生蔬菜中維生素C的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19277-19278.

[9]趙昕梅，遠(yuǎn)凌威，陳世鋒，等. 高效液相色譜法測(cè)定果蔬中維生素C含量[J]. 信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，26（1）：49-53.

[10]寧德生，梁小燕，方 宏. 高效液相色譜法對(duì)羅漢果中VC含量的檢測(cè)[J]. 食品科學(xué)，2010，31（20）：311-313.

[11]裴云逸. 高效液相色譜法快速測(cè)定蔬菜中Vc含量的研究[J]. 食品與機(jī)械，2012，28（5）：91-93，162.

[12]陳振健，許開(kāi)國(guó)，涂杰峰，等. 幾種果蔬抗壞血酸的高效液相色譜分析[J]. 福建省農(nóng)科院學(xué)報(bào)，1987，2（1）：78-83.

[13]侯冬巖，回瑞華，劉曉媛，等. 蘋(píng)果汁中Vc的HPLC分析及抗氧化性的測(cè)定[J]. 食品科技，2006，31（7）：238-240.

[14]谷雪賢. 蔬果中維生素C含量的檢測(cè)方法[J]. 廣東化工，2010，37（7）：98.

[15]吳海燕. 微波提取高效液相色譜法測(cè)定花椰菜中的維生素 C[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：256-257.

[16]甘振威，武廣恒，劉國(guó)良，等. 自動(dòng)電位滴定法和高效液相色譜法測(cè)定深顏色果蔬中維生素C濃度的比較[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，40（2）：441-445.

[17]Bergquist S A，Gertsson U E，Noadmark L Y，et al. Ascorbic acid，carotenoids，and visual quality of baby spinach as affected by shade netting and postharvest storage[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2007，55（21）：8444-8451.

[18]Shohag M J I，Wei Y Y，Yang X. Changes of folate and other potential health-promoting phytochemicals in legume seeds as affected by germination[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2012，60（36）：9137-9143.

[19]趙文君. HPLC法檢測(cè)有機(jī)酸和水溶性維生素的方法研究[D]. 南京：南京工業(yè)大學(xué)，2011.

[20]潘建國(guó)，王開(kāi)發(fā)，鄭堯隆，等. 高效液相色譜法同步測(cè)定花粉中的水溶性維生素[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，29（5）：581-583.