10種藤黃科植物遺傳多樣性的ISSR分析

劉子金　楊小波　林澤欽

摘要：運用內(nèi)部簡單重復序列（inter-simple sequence pepeat，ISSR）分子標記對采自海南省的10種藤黃科植物進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示：（1）從100條ISSR引物中篩選出8條能擴增出清晰條帶且多態(tài)性明顯的引物；8條引物擴增出331條條帶，其中多態(tài)性位點有106個，多態(tài)性比例為100%，平均每條引物擴增位點數(shù)為13.25個。（2）材料間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.407 8～0.699 0，平均為0.562 2。以0.620 0作為最低遺傳相似系數(shù)，將10種藤黃科植物劃分為5大類：①鐵力木；②菲島福木、單花山竹子、山竹子；③多花山竹子、越南黃牛木、黃牛木；④嶺南山竹子；⑤紅厚殼、薄葉紅厚殼。研究結(jié)果首次從分子水平揭示了藤黃科植物的遺傳多樣性，為合理地引種、馴化、保護、利用藤黃科植物野生資源提供了重要的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：藤黃科；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析；相似系數(shù)

中圖分類號： S567.1+90.32 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0055-04

藤黃科（Guttiferae）屬雙子葉植物綱五椏果亞綱，是一個熱帶科。我國有8屬87種藤黃科植物，分別隸屬于3亞科，幾乎遍布全國各地[1]，海南省主要有黃牛木屬、紅厚殼屬、鐵力木屬、藤黃屬等。近年來，隨著人們對藤黃科植物研究的不斷深入，從中出離出大量黃酮類化合物[2]、呫噸酮類化合物[3-4]、萜類化合物[5]等。藥理研究表明：藤黃科植物藥用活性成分具有抗腫瘤[6]、抗艾滋病[7]、抗菌[8]等多種生物活性，極具研究和開發(fā)價值。因此，對藤黃科植物進行深入研究具有重要意義。

內(nèi)部簡單重復序列（inter-simple sequence pepeat，ISSR）是由Zietkiewicz等在1994年提出的一種新型分子標記技術(shù)[9]，用于檢測簡單重復序列（SSR）間的DNA序列差異，具有比隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）更高的可重復性、穩(wěn)定性[10]。同時，該試驗操作簡單、快速、高效，不需要繁鎖的構(gòu)建文庫、設(shè)計引物、雜交、同位素顯示等步驟，而且ISSR標記可以揭示整個基因組的一些特征，并呈孟德爾式遺傳。目前，ISSR技術(shù)己在品種鑒定[11]、遺傳作圖[12-13]、遺傳多樣性[14-15]等研究中得到了廣泛應(yīng)用[16]。本研究利用ISSR技術(shù)對采自海南省的10種藤黃科植物進行親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析，以期為藤黃科植物種質(zhì)資源的收集、鑒定、保護和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料分別為紅厚殼、薄葉紅厚殼、山竹子、嶺南山竹子、單花山竹子、多花山竹子、菲島福木、黃牛木、越南黃牛木和鐵力木，所有物種均由海南大學熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室主任楊小波教授鑒定。采集地信息見表1。

ISSR-PCR擴增反應(yīng)引物根據(jù)British Columbia大學公布的ISSR引物序列，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成；Taq DNA聚合酶、2×Taq PCR Master Mix、2 kb DNA marker均購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

主要儀器有：HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋；Eppendorf Centrifuge 5 415R冷凍離心機；Biometra TGradient PCR儀；DYY-11型電泳儀，北京市六一儀器廠；BG-SubMINI水平電泳槽；Alphalmager-2200凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總DNA的提取 采用購自成都福際生物技術(shù)有限公司的植物DNA提取試劑盒提取基因組總DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性、濃度，將其稀釋為 20 ng/L，用于ISSR分子標記技術(shù)分析，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 擴增與成像 ISSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL 模板，用滅菌蒸餾水補足至20 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s；94 ℃ 50 s，43 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。于4 ℃貯存。PCR擴增在Biometra T-Gradient PCR儀上完成。ISSR擴增產(chǎn)物用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以2 kb Ladder Plus Marker為相對分子質(zhì)量標記，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 對ISSR-PCR擴增產(chǎn)物進行條帶數(shù)目統(tǒng)計，采取0/1賦值記帶，擴增產(chǎn)物相同遷移位置上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，得到0/1數(shù)據(jù)矩陣，然后將數(shù)據(jù)導入NTsys 2.10e 軟件進行聚類分析。首先用SimQual程序計算Nei-Li相似系數(shù)，再用SHAN程序中的非加權(quán)成組算術(shù)平均數(shù)法（unweighted pair-group method，arithmetic average，UPGMA）進行聚類分析，最后用TREEPLOT過程構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖1可知，所得條帶均勻清晰，無蛋白質(zhì)、RNA污染，無拖尾現(xiàn)象，純度高，完全滿足ISSR分析的要求。

2.2 ISSR擴增結(jié)果

用紅厚殼、山竹子DNA為模版，對100條ISSR引物進行篩選，最終確定8條帶型清晰、多態(tài)性較好的引物用于藤黃科植物的多態(tài)性分析。表2結(jié)果表明：8條引物擴增出331條清晰可辨的條帶，DNA片斷多集中在750～2 000 bp之間，平均每個引物擴增出41.38條條帶，其中位點有106個，平均每條引物擴增位點數(shù)為13.25個，均呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性比例達到了100%，說明10種藤黃科植物在DNA分子水平上存在著豐富的遺傳多樣性。引物ISSR擴增圖譜見圖2。

2.3 材料間親緣關(guān)系的聚類分析

由表3可知，10種藤黃科植物的遺傳相似系數(shù)在 0.407 8～0.699 0之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.562 2。其中薄葉紅厚殼和單花山竹子的遺傳相似系數(shù)最小，為0.407 8，親緣關(guān)系最遠；薄葉紅厚殼和紅厚殼相似系數(shù)最大，為 0.699 0，親緣關(guān)系最近。通過聚類分析，以閾值0.620 0為基準，可以將10種藤黃科植物明顯地劃分為5個類群，如圖3所示：第1類為鐵力木；第2類為菲島福木、單花山竹子、山竹子；第3類為多花山竹子、越南黃牛木、黃牛木；第4類為嶺南山竹子；第5類為紅厚殼、薄葉紅厚殼。

3 討論

藤黃科植物由于其重要的經(jīng)濟價值、食用價值、藥用價值，已經(jīng)成為世界各國植物資源研究的熱點之一，尤其是在化學成分、藥理藥效方面，近年來人們開展了較為全面的研究，并取得了豐富的成果。因此，對藤黃科植物資源進行較為統(tǒng)一、完善、準確的分類，對資源的收集、鑒定及合理利用具有非常重要的意義。本研究采用分子標記的方法， 從分子的角度

去研究植物，更能夠發(fā)掘物種內(nèi)部的變異因素，從而更加準確地獲知物種之間的親緣關(guān)系、遺傳多樣性。因此，本研究通過所選取的8條引物獲得了331條條帶、106個多態(tài)位點，充分說明所選引物具有信號強、特異性高、覆蓋度廣等特點，也能夠充分地揭示藤黃科不同植物間的親緣關(guān)系和存在的遺傳差異（充分揭示藤黃科植物具有遺傳多樣性）。研究表明：10種植物聚為5類，其中鐵力木聚為1類，紅厚殼、薄葉紅厚殼聚為1類，這與它們的傳統(tǒng)分類地位是一致的[1]。藤黃屬中的5種植物山竹子、嶺南山竹子、單花山竹子、多花山竹子、菲島福木分別聚為3類。其中，嶺南山竹子單獨聚為1類，菲島福木、山竹子、單花山竹子聚為1類，而多花山竹子卻與黃牛木屬中的黃牛木、越南黃牛木聚在一起。這可能與它們的生境有關(guān)，多花山竹子、黃牛木屬植物生境相同，均分布在次生林或者灌叢中，地理分布存在一定的重疊。

ISSR分子標記具有信息量豐富、操作簡單、重復性好、穩(wěn)定性強等諸多優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究中[17-18]。本研究表明，藤黃科植物之間具有豐富的遺傳多樣性，這意味著它們具有較高的適應(yīng)能力、較大的育種和改良能力。如今，藤黃科植物在人們生活中起到的影響也越來越大，廣泛用作食用水果、木材和各種其他天然產(chǎn)品的來源，也是化工、醫(yī)藥的重要原料。因此，準確了解植物間的親緣關(guān)系，能夠為繁育出更優(yōu)質(zhì)的果樹、實用木材以及獲得含有更高含量藥物活性成分的品種提供理論依據(jù)，從而研發(fā)新的技術(shù)，從根本上解決用于現(xiàn)代制藥行業(yè)所需的植物原料缺乏問題，有效地避免對藤黃科野生植物資源的過度采挖造成某些物種的瀕危或滅絕，最終達到對植物資源合理有效開發(fā)利用目的。

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