小麥小分子熱激蛋白TasHSP16.9基因在逆境應(yīng)答中的表達分析

李靜婷　劉子記　趙旭耀

摘要：小分子熱激蛋白（sHSP）是一類結(jié)構(gòu)非常保守并具有分子伴侶功能的應(yīng)激蛋白，可在高溫和其他脅迫條件下誘導(dǎo)合成。為進一步研究sHSP在小麥耐脅迫性方面的作用，分析了小麥HSP16.9基因在逆境脅迫下的表達趨勢，定量RT-PCR表達譜分析結(jié)果顯示，高溫、低溫、干旱、高鹽脅迫都誘導(dǎo)小麥TasHSP16.9表達，表達量均有增加，表明TasHSP16.9基因可能在小麥抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：小麥；抗逆反應(yīng)；基因表達；應(yīng)激蛋白

中圖分類號： Q786；S512.103.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0039-03

熱脅迫下，生物體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)合成被抑制，分子量從8 ku至110 ku的熱激蛋白（heat shock protein，HSP）被迅速誘導(dǎo)合成。在高等植物中，幾乎所有的HSP都與細胞耐熱性提高有關(guān)，其中表達最豐富的HSP為小分子熱激蛋白（small HSP，sHSP）。根據(jù)序列相似性和細胞內(nèi)定位特征，植物sHSP分為6類，2類定位于細胞質(zhì)，1類定位于細胞核內(nèi)，其他3類位于質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器內(nèi)[1-3]。小麥小分子熱激蛋白HSP16.9（TaHSP16.9）屬于第一類小分子熱激蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，sHSP具有分子伴侶功能，以不依賴ATP的方式選擇性地結(jié)合熱變性蛋白防止其被蛋白酶降解或幫助其正確折疊[3]。此外，高等植物中的sHSP可在低溫、光氧化條件、氧化劑、干旱等脅迫條件下，在特定的發(fā)育時期（如種子成熟、種子萌發(fā)）被大量誘導(dǎo)合成，在正常環(huán)境條件下sHSP表達量很低，幾乎不表達，這表明sHSP可能在植物耐脅迫性方面發(fā)揮重要作用[2-9]。小麥是我國重要的糧食作物之一，其播種面積占全國耕地面積的20%～30%，隨著全球氣候的變化，小麥種植必然受到影響，尤其在我國北方小麥主產(chǎn)區(qū)。影響小麥生長發(fā)育和產(chǎn)量的生態(tài)因素較多，主要有溫度、水分、光照、土壤性質(zhì)等。由于溫室氣體排放量增加導(dǎo)致全球氣候變暖，因此，近些年局部地區(qū)極端高溫天氣頻發(fā)，導(dǎo)致小麥早熟、減產(chǎn)。同時，溫室氣體排放還導(dǎo)致我國水量分布不均，西南、華北、長江中下游地區(qū)降水量增加，西北和東部地區(qū)降水量減少，致使西南冬麥區(qū)和西北冬麥區(qū)減產(chǎn)[10]。近年來，由于氣候干旱、過度放牧等因素，我國土壤鹽漬化趨勢逐漸加重，土壤肥力下降，導(dǎo)致小麥減產(chǎn)。培育抗性品種是提高小麥產(chǎn)量的有效手段之一，對小麥抗性相關(guān)基因功能的研究為培育小麥抗病品種提供了理論依據(jù)。筆者前期根據(jù)已公布的小麥16.9 ku sHSP基因的cDNA序列，利用Genome Walking技術(shù)克隆了TasHSP16.9基因全長，發(fā)現(xiàn)該基因只有1個外顯子，沒有內(nèi)含子[11]。筆者利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析該基因啟動子區(qū)域順式作用調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)一些參與防衛(wèi)反應(yīng)和逆境應(yīng)答的調(diào)控元件，推測TasHSP16.9基因可能參與小麥抗逆反應(yīng)。本試驗就TasHSP16.9基因?qū)δ婢硲?yīng)答模式進行研究，旨在為進一步研究TasHSP16.9基因在小麥抗逆反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種TAM107為耐熱品種，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種系小麥組惠贈。試驗所需引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成，所用Trizol試劑、DNase I、TIANScript Ⅱ RT Kit、Taq PCR Mastermix均購自北京天根生化科技有限公司，SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 非生物逆境脅迫條件的設(shè)定 選取籽粒飽滿的種子，采用1%次氯酸鈉溶液表面消毒30 min，蒸餾水沖洗3遍，利用1%雙氧水處理過夜，蒸餾水清洗3遍，選擇露白的種子進行水培，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光—暗周期為16 h—8 h（晝—夜），晝夜溫度22 ℃/18 ℃，濕度60%[11]。培養(yǎng)10 d后進行如下脅迫處理：（1）將小麥幼苗置于42 ℃ 進行高溫脅迫處理，分別于處理后0.5、1.0、2.0、3.0 h取樣；（2）將小麥幼苗置于0 ℃進行冷處理，處理后分別于3.0、12.0 h取樣；（3）將小麥幼苗的根部沖洗干凈并用吸水紙沾去多余水分，置于干燥濾紙上進行干旱處理，分別于處理后0.5、1.0、2.0、3.0、50 h取樣[12]；（4）將小麥幼苗進行高鹽（200 mmol/L NaCl溶液）脅迫處理，分別于處理后0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h取樣；（5）將小麥幼苗進行200 μmol/L ABA溶液處理，分別于處理后 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h取樣[13]。以未經(jīng)處理的正常培養(yǎng)小麥幼苗作為對照，每個處理組重復(fù)3次。脅迫處理后迅速剪取葉片放入液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取純化和cDNA第1鏈的合成 利用 Trizol 試劑提取小麥葉片的總RNA，經(jīng)DNase Ⅰ純化后，電泳檢測RNA的完整性，利用Thermo Scientific NaNoDrop 2000c檢測RNA的濃度、純度，利用TIANScript Ⅱ RT Kit試劑盒進行第一條單鏈cDNA的合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TasHSP16.9基因mRNA表達譜分析 以小麥不同脅迫處理下不同時間點合成的第1鏈cDNA為模板，采用半定量RT-PCR法檢測TasHSP16.9基因轉(zhuǎn)錄表達水平。以小麥Actin為內(nèi)參，引物序列為Actin-L：5′-AATTACCCGATGGGCA-3′，Actin-R：5′-TCATACTCGGCCTTGGA-3′。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。TasHSP16.9特異性引物序列為TasHSP16.9-L：5′-AGTTCGTCAGGCGCTTCCG-3′，TasHSP16.9-R：5′-CGCAATACAGAGATGGCTCGTC-3′；擴增程序同上，33個循環(huán)。

以小麥冷脅迫處理后不同時間點合成的第1鏈cDNA為模板，用TasHSP16.9特異性引物（上游引物：5′-CGAGGTCAAGAAGCCTGAGG-3′，下游引物：5′-CGTCAGACTCGGCAAGAACA-3′）進行擴增，以小麥Actin為內(nèi)參（上游引物：5′-ACTCATCATACTCGCCCTTCG-3′，下游引物：5′-CAAGCAGCATGAAGATCAAGGT-3′），利用實時定量PCR儀檢測TasHSP16.9在冷脅迫下的表達模式，每個樣品至少獨立重復(fù)3 次。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，38個循環(huán)。每次循環(huán)的第3步設(shè)定熒光采集，繪制融解曲線。采用熒光定量PCR儀自動讀取的數(shù)據(jù)進行分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TasHSP16.9啟動子的生物學(xué)分析

為了進一步探究TasHSP16.9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，本研究前期克隆到TasHSP16.9啟動子序列（ATG起始密碼子上游 1 115 bp 的基因組序列），利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該基因啟動子區(qū)域的順式作用調(diào)控元件（表1），發(fā)現(xiàn)TasHSP16.9啟動子含有一系列對低溫、厭氧、防衛(wèi)、逆境應(yīng)答的調(diào)控元件（LTR、ARE、TC-rich repeats），還含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、機械損傷誘導(dǎo)響應(yīng)元件（W-box）、光響應(yīng)元件（Box I、G-Box、GT1-motif等）、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件（Box-W1）、參與分生組織和胚乳發(fā)育調(diào)控元件（CAT-box、Skn-1-motif）、典型的啟動子核心元件（TATA-box）和增強子元件（CAAT-box）。

2.2 非生物脅迫下TasHSP16.9基因表達模式分析

為了明確小麥小分子熱激蛋白基因TasHSP16.9在抗逆反應(yīng)過程中的具體作用，采用半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR方法分析TasHSP16.9在高溫、低溫、干旱、高鹽、ABA處理后小麥幼苗中的表達情況。結(jié)果表明，TasHSP16.9對高溫誘導(dǎo)反應(yīng)較靈敏，處理后0.5 h即可檢測到較強的表達量，此后隨誘導(dǎo)時間的延長表達量逐漸升高，3.0 h達到最高（圖1-A）。干旱脅迫下，處理后0.5 h能檢測到該基因的微量表達，2.0 h表達量最高，此后隨脅迫時間的延長表達量逐漸下降，5.0 h處已檢測不到（圖1-B）；TasHSP16.9對高鹽脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)較遲緩，1.0 h后才檢測到基因表達，3.0 h處表達量達到高峰，此后表達量明顯下降（圖1-C）；在ABA處理下，檢測不到TasHSP16.9基因表達，即TasHSP16.9表達不受外源ABA影響（圖1-D）。TasHSP16.9基因?qū)Φ蜏孛{迫應(yīng)答反應(yīng)緩慢，3 h處檢測到該基因表達，處理3 h后表達量降低，恢復(fù)到常溫水平（圖2），說明非生物逆境脅迫能快速誘導(dǎo)TasHSP16.9基因表達，但只誘導(dǎo)該基因mRNA在短期內(nèi)的積累，誘導(dǎo)一定時間后，該基因的誘導(dǎo)表達將會受到抑制，該基因mRNA會迅速降解。TasHSP16.9基因表達譜分析結(jié)果表明，高溫、干旱、高鹽脅迫誘導(dǎo)TasHSP16.9表達，低溫脅迫對其誘導(dǎo)表達不顯著，外源ABA對該基因表達沒有影響。

3 結(jié)論與討論

小麥是我國乃至全球重要的糧食作物之一，在氣候惡化、環(huán)境污染、病蟲害侵染等因素的影響下，小麥的種植、生長、產(chǎn)量受到嚴重威脅，提高小麥的抗病蟲害和抗逆性已成為當前小麥遺傳育種工作的主要目標。當高等植物受到高溫或持續(xù)升溫脅迫時，細胞內(nèi)會迅速誘導(dǎo)合成大量熱激蛋白，其中以sHSP最為豐富。研究表明，諸多非生物脅迫（如高溫、低溫、干旱、氧化劑等）都可誘導(dǎo)sHSP的產(chǎn)生。如過表達sHSP17.7可以顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性[4]。熱激和冷處理可誘導(dǎo)紫莖澤蘭HSP17.7基因的表達[5]。高溫和低溫可誘導(dǎo)番茄線粒體小分子熱激蛋白LEHSP23.8基因的表達[6]。高溫和氧化劑H2O2可誘導(dǎo)水稻葉綠體小分子熱激蛋白OsHSP26基因的表達[8]。高溫可快速誘導(dǎo)玉米ZmHSP17.7基因的表達[15]。

TasHSP16.9啟動子區(qū)具有LTR、ARE、TC-rich repeats 3種參與低溫、厭氧、防衛(wèi)和逆境應(yīng)答的順式作用元件，這些順式作用元件可以增強植物對非生物脅迫的抗性，推測TasHSP16.9基因可能參與小麥抗逆反應(yīng)。本研究表達譜分析結(jié)果顯示，高溫、低溫、干旱、高鹽脅迫均可誘導(dǎo)TasHSP16.9表達，其中低溫脅迫對該基因誘導(dǎo)表達不顯著。42 ℃ 高溫脅迫下，0.5 h處即可在小麥苗期葉片中檢測到TasHSP16.9基因顯著表達，3.0 h處基因表達量達到高峰，這種高溫誘導(dǎo)的特性與其他植物中小分子熱激蛋白基因的表達特性一致，而且脅迫溫度越高，基因表達響應(yīng)越快，基因表達量達到高峰所需時間越短，如40 ℃高溫脅迫下，處理1.0 h后才可在小麥苗期葉片中檢測到TasHSP16.9-1基因的表達，在脅迫4.0 h后基因表達量才達到高峰[16]。但TasHSP16.9基因誘導(dǎo)產(chǎn)物不隨脅迫時間的延長無限積累，當表達量達到高峰后很快下降，直至完全消失。本研究中，在低溫、干旱、高鹽脅迫下，TasHSP16.9基因誘導(dǎo)表達量達到高峰后，隨著脅迫時間的延長，表達量顯降低直至完全消失。40 ℃高溫脅迫下，TasHSP16.9-1 基因在脅迫4.0 h時表達量達到高峰，隨后逐漸降低[16]。推測本研究中TasHSP16.9基因表達量在熱脅迫3.0 h后，隨著熱脅迫時間的延長，表達量將逐漸降低。ABA在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中具有重要功能，根據(jù)基因是否受ABA調(diào)控，往往將基因分為2類，即依賴于和不依賴于ABA的脅迫響應(yīng)基因。TasHSP16.9表達不受外源ABA誘導(dǎo)，表明該基因?qū)儆诓灰蕾囉贏BA的脅迫響應(yīng)基因。但需要進一步就內(nèi)源ABA是否影響該基因表達進行驗證。通過分析非生物脅迫下TasHSP16.9基因的表達譜，結(jié)果表明，小麥TasHSP16.9參與對逆境脅迫抗逆反應(yīng)過程，今后本研究將利用轉(zhuǎn)基因擬南芥對TasHSP16.9V的生物學(xué)功能作進一步驗證，以明確該基因在小麥抗逆反應(yīng)過程中的調(diào)控功能，為小麥抗性育種提供理論參考。

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