子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展

金濟(jì)云 夏親華

[摘要] 本文對(duì)子宮內(nèi)膜異癥（EMs）動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及優(yōu)缺點(diǎn)綜合闡述，希望建立合適的動(dòng)物模型，加深EMs病因?qū)W、治療學(xué)的研究，以深入了解EMs發(fā)病機(jī)制，開發(fā)治療新藥，探索中藥作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)多方面、多角度的中西醫(yī)結(jié)合治療，全面提高中西醫(yī)結(jié)合治療EMs的水平。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；動(dòng)物模型；免疫機(jī)制；研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（b）-0028-04

Research progress of endometriosis animal models

JIN Jiyun1 XIA Qinhua2

1.The First School of Clinical Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Gynaecology， Jiangsu Provincial Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China

[Abstract] This paper makes a summarization for the construction method and advantages and disadvantages of endometriosis （EMs） animal models， try to establish more appropriate animal models for the study of etiology and treatment on Ems， so as to deeply know about the pathogenesis of Ems， exploit new drugs， explore mechanism of traditional Chinese medicine， realize combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine from many aspects and angles， improve the level of combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine for EMs comprehensively.

[Key words] Endometriosis； Animal models； Immune mechanism； Research progress

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是指有活性的子宮內(nèi)膜在被覆內(nèi)膜的宮腔和子宮以外的部位生長、浸潤，從而引發(fā)疼痛、結(jié)節(jié)、月經(jīng)紊亂以及不孕等癥的疾病。EMs的病變范圍較廣，形態(tài)多樣，有較強(qiáng)的侵襲性和復(fù)發(fā)性，且有1%的惡變率[1]。但自1860年首次報(bào)道EMs以來，我們對(duì)其發(fā)病機(jī)制了解有限，且目前的治療策略不能徹底治愈EMs，臨床上復(fù)發(fā)及患者難以忍受的不良反應(yīng)頻見。因此，建立動(dòng)物模型對(duì)EMs的研究至關(guān)重要。本文希望通過對(duì)造模方法優(yōu)缺點(diǎn)的探討，總結(jié)近年來EMs模型建立的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，建立更為仿真的EMs動(dòng)物模型。

1 動(dòng)物模型的選擇

EMs動(dòng)物模型的制作主要基于Sampson的“經(jīng)血逆流種植學(xué)說”[2]，現(xiàn)造模方法有自發(fā)、種植、誘發(fā)三種主要模式。

1.1 自發(fā)性

見于人或靈長動(dòng)物，其病理學(xué)特征及病機(jī)和人類最為相似，但發(fā)生率低，周期長，短期內(nèi)無法獲得足夠的信息，且價(jià)格昂貴，限制了其在科研中的應(yīng)用。

1.2 種植性（異體移植）

多見于重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠或裸小鼠，有同種異體和異種異體之分，均有創(chuàng)傷小、易操作、成活率高等優(yōu)點(diǎn)。但是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為免疫缺陷動(dòng)物，無法用于EMs免疫學(xué)機(jī)制及免疫治療方面的研究。

1.3 誘發(fā)性（自體移植）

造模對(duì)象較廣，如猴、兔、大鼠等。將其自體內(nèi)膜通過手術(shù)種植到宮腔外，或閉鎖其宮頸，使經(jīng)血逆流而誘發(fā)。此法避免了排斥反應(yīng)，但自體手術(shù)移植損傷大且死亡率高。

總之，目前造模方法各有利弊，選擇條件以實(shí)驗(yàn)的目的和可行性而異，權(quán)衡各種模型的利弊，充分發(fā)揮不同動(dòng)物模型的長處。相較而言，異體移植有較明顯的優(yōu)勢(shì)。人內(nèi)膜組織異體移植，使其生理病理改變更接近人體，但是有倫理學(xué)問題存在。同種異體研究成果是否可以完全適用于人體有待商榷。此外，免疫功能的缺乏限制了EMs免疫機(jī)制的研究，如何重建裸鼠免疫功能值得探索。

2 造模取材對(duì)模型的影響

2.1 關(guān)于取膜的生理期

有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)膜處于增生狀態(tài)更易種植，也有學(xué)者認(rèn)為分泌期、分泌晚期甚至月經(jīng)期能更好地模擬經(jīng)血逆流種植學(xué)說，且成模率更高。而Nisolle等[3]發(fā)現(xiàn)所有移植物均有類似增殖期變化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，認(rèn)為不同的取膜時(shí)期對(duì)裸鼠模型的構(gòu)建并沒有影響。許艷麗等[4]分別觀察了增殖期及分泌期內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞成活率與月經(jīng)周期沒有必然聯(lián)系。

2.2 關(guān)于取膜部位

根據(jù)“在位內(nèi)膜決定論”以及許多學(xué)者在構(gòu)建Ems裸鼠模型過程中的發(fā)現(xiàn)[5]，認(rèn)為在位內(nèi)膜比正常內(nèi)膜更具有侵襲性，其生長率高于正常內(nèi)膜。朱啟江[6]的試驗(yàn)中各組織生長率：正常子宮內(nèi)膜60%；腺肌癥在位內(nèi)膜85.71%；卵巢巧囊內(nèi)壁100%。Banu等[7]成功將混合的人異位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞接種于裸鼠腹腔形成異位病灶，發(fā)現(xiàn)其與EMs患者異位病灶在分子與細(xì)胞學(xué)方面相似，可以用來研究在位內(nèi)膜本身固有的、潛在的侵襲能力。Van Langendonckt等[8]以近100%的成功率將人異位組織注入裸鼠腹腔，并可在體內(nèi)存活10周之久。移植后組織保持了原有的特征和對(duì)激素的反應(yīng)。據(jù)此可以推斷：異位內(nèi)膜的生長率更高，而且能更準(zhǔn)確地再現(xiàn)EMs的特點(diǎn)，反映其發(fā)展變化。

3 觀察方法

既往所使用的有創(chuàng)性觀察方法，除了耗損動(dòng)物外，無法明確區(qū)分病灶及周圍組織，且無法對(duì)同一病灶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)及臨床研究要求我們研發(fā)出EMs模型的活體無創(chuàng)觀察方法。目前主要分為兩類：一、利用影像學(xué)方法對(duì)病灶進(jìn)行檢測(cè)；二、利用分子生物學(xué)技術(shù)標(biāo)記病灶并進(jìn)行觀察。

3.1 影像學(xué)方法

MRI利用建立的圖像獲得病灶信息，有效地減小了動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，并可直接進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此法可相對(duì)較早地觀測(cè)到異位病灶，但無法區(qū)分不典型EMs病灶，如粘連。超聲檢查也常在EMs動(dòng)物模型研究中應(yīng)用。此外，微型正電子體層掃描、微型單光子發(fā)射計(jì)算體層掃描、活體影像系統(tǒng)等分子顯像設(shè)備亦在動(dòng)物模型中嘗試應(yīng)用[9]。此種均有敏感、實(shí)時(shí)、無創(chuàng)的特點(diǎn)，便于臨床推廣，但其費(fèi)用高昂，臨床應(yīng)用并不廣泛。

3.2 熒光染色法

光學(xué)成像技術(shù)一般采用熒光染料法和熒光素酶生物發(fā)光，Defrère等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了經(jīng)體外熒光量化觀測(cè)方案的可行性，該法實(shí)現(xiàn)了對(duì)異位病灶的連續(xù)性觀察，使EMs動(dòng)態(tài)活體研究成為可能。熒光模型的優(yōu)勢(shì)明顯：①主觀影響小，對(duì)病灶敏感，定位精確，在對(duì)表面不典型病灶的觀察上得到更好的體現(xiàn)；②病灶重量和熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)；③不影響移植的內(nèi)膜生物特性，且某些熒光表達(dá)不因時(shí)間延長而衰減。

近年標(biāo)記方法不斷得到改進(jìn)，根據(jù)其熒光產(chǎn)生機(jī)制和來源的不同分為[11]：①熒光染料直接標(biāo)識(shí)內(nèi)膜。②基因轉(zhuǎn)染：利用病毒載體（如慢病毒）將熒光蛋白基因或熒光素酶基因轉(zhuǎn)入內(nèi)膜細(xì)胞，從而發(fā)出熒光。③熒光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在體內(nèi)膜移植。相較而言，前兩類可避免物種差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差。然而，隨著熒光模型的不斷深入研究，如何提高標(biāo)記蛋白的表達(dá)，提升轉(zhuǎn)染穿透力，觀測(cè)表達(dá)時(shí)間及組織特異性須深入探索。此外，檢測(cè)系統(tǒng)（三維成像系統(tǒng)和定量測(cè)定）也有待進(jìn)一步完善。

4 機(jī)制與應(yīng)用

根據(jù)2015年EMs最新診治指南，其治療方法可分為手術(shù)治療、藥物治療、介人治療、中藥治療及輔助治療（如輔助生殖技術(shù)治療）等。EMs首選手術(shù)治療，但復(fù)發(fā)率高，即便是根治性手術(shù)，也存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。藥物治療便是攻克EMs的研究重點(diǎn)。目前EMs的發(fā)病機(jī)制尚不明確，各種藥物都有不同程度的不良反應(yīng)，且仍有較高的復(fù)發(fā)率。因此，了解EMs發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新藥勢(shì)在必行。

EMs發(fā)病機(jī)制相關(guān)的學(xué)說有子宮內(nèi)膜種植學(xué)說、在位內(nèi)膜學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、干細(xì)胞學(xué)說、遺傳學(xué)說、免疫學(xué)說等[12]。最先提出的是“經(jīng)血逆流種植學(xué)說”，但近來流調(diào)顯示：育齡婦女多有經(jīng)血逆流的現(xiàn)象，但只有小部分發(fā)展為EMs。因此，EMs的發(fā)生沒有得到完美的解釋。1980年Weed等[13]提出EMs和機(jī)體免疫相關(guān)，至今已有更多證據(jù)表明免疫及炎癥因素發(fā)揮重要作用[14-15]，因此，免疫調(diào)節(jié)治療EMs日益得到關(guān)注。但目前免疫調(diào)節(jié)治療的臨床研究還十分缺乏。臨床研究證實(shí)了己酮可可堿緩解盆腔疼痛、提高妊娠率的重要作用；抗TNF-α治療、增強(qiáng)NK細(xì)胞活性藥物以及中藥的免疫調(diào)節(jié)治療的效果及安全性有待更多臨床研究證實(shí)，此類藥物的不良反應(yīng)有待探討，妊娠安全性也有待評(píng)估。近年來，干細(xì)胞起源學(xué)說備受關(guān)注，學(xué)者們通過實(shí)驗(yàn)證明了內(nèi)膜中干細(xì)胞的存在，認(rèn)為干細(xì)胞脫落、增殖、分化是內(nèi)異癥發(fā)生的重要原因[16]，這也為EMs機(jī)制研究及藥物治療提供了新的思路。

郎景和“在位內(nèi)膜決定論”中提出：EMs發(fā)病的兩大基石——遺傳和免疫[17]。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的“類腫瘤”的生物學(xué)行為使其逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊并繼續(xù)生長，啟發(fā)思考：內(nèi)異癥作為一種“良性癌”是否存在與腫瘤細(xì)胞一樣的免疫逃逸機(jī)制？

許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)信號(hào)通路也參與了對(duì)EMs惡性生物學(xué)行為的調(diào)控[18]，F(xiàn)oxp3、Fas及FasL蛋白等與免疫逃逸相關(guān)的因子在婦科疾病中存在異常表達(dá)。研究表明，抑制Foxp3表達(dá)可有效提高機(jī)體腫瘤免疫能力。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，異位癥的內(nèi)膜組織不論在位還是異位，均有對(duì)抗Fas途徑介導(dǎo)凋亡的潛能[19]，這為研究EMs的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了更廣闊的思路：異位組織局部浸潤Foxp3是否能改善患者癥狀及預(yù)后？是否可以通過切斷相關(guān)負(fù)性信號(hào)調(diào)節(jié)通路，阻斷異位內(nèi)膜的免疫逃逸而達(dá)到治療作用？

5 新型特殊模型的建立

5.1 人免疫功能重建EMs動(dòng)物模型

EMs發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。自體移植在組織學(xué)特性和生物反應(yīng)上與人類存在一定的差異，而傳統(tǒng)異體移植使用免疫缺陷小鼠，限制了EMs免疫學(xué)機(jī)制的研究。20世紀(jì)末Somigliana等[20]成功建立了有免疫力小鼠的內(nèi)異癥模型，雖發(fā)病機(jī)制與人類相近，但3次手術(shù)創(chuàng)傷，小鼠易死，難以觀察，且病灶小，測(cè)量誤差大。王群華等[21]率先建立了具有人免疫功能的鼠EMs模型。采用早孕人蛻膜和其臍血單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合移植，移植后仍保持原有組織形態(tài)，性狀穩(wěn)定。建立EMs人源化裸鼠模型的同時(shí)，給予人源化EMs裸鼠同源的自體外周血來源的人免疫細(xì)胞，建立含有人免疫系統(tǒng)的人源化裸鼠EMs模型，有重要的臨床參考意義。

5.2 復(fù)發(fā)型EMs模型

研究顯示：EMs保守性手術(shù)后1、2、5年的累計(jì)復(fù)發(fā)率分別在10%、20%、50%左右[22]。至今復(fù)發(fā)仍是臨床亟需解決但又非常棘手的問題，所以建立EMs復(fù)發(fā)動(dòng)物模型，探討EMs復(fù)發(fā)的機(jī)制是必要的。黃潔明等[23]通過手術(shù)切除原有異位病灶，建立復(fù)發(fā)型EMs大鼠模型。發(fā)現(xiàn)手術(shù)只是破壞或縮小了病灶，對(duì)局部雌激素的合成沒有干擾，其微環(huán)境依舊存在，殘留的內(nèi)膜細(xì)胞仍具再生長的潛能，這也許是EMs術(shù)后高復(fù)發(fā)率的根本原因之一。同時(shí)，楊艷環(huán)等[24]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)發(fā)模型建立的可行性。

5.3 中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型

中醫(yī)藥在治療EMs上有獨(dú)到之處，臨床應(yīng)用取得了一定的經(jīng)驗(yàn)，中醫(yī)治療能明顯改善癥狀，增加受孕機(jī)會(huì)，減少復(fù)發(fā)，并且調(diào)節(jié)全身免疫功能[25-26]，且通過部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其具有確切的療效[27]。但作用機(jī)制處于探索階段，研究僅停留在對(duì)某些因子的影響上，缺乏更深層次的研究，未揭示其確切的治療機(jī)制，且臨床上中醫(yī)證型會(huì)隨時(shí)間推移呈現(xiàn)復(fù)雜的證型演變，在證候的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化方面以及方藥與病證的相關(guān)性方面，仍然缺乏深入的基礎(chǔ)研究作為理論支撐。我們必須引入病證結(jié)合的動(dòng)物模型，研究其宏觀表征、微觀指標(biāo)以及與方藥的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使證候的研究向標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化方向發(fā)展。

5.4 體外三維模型

體外三維模型最初運(yùn)用于腫瘤學(xué)的研究，相較于傳統(tǒng)的二維模型，三維模型引入了細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建了多方位細(xì)胞生長的微環(huán)境，能更好地觀察細(xì)胞的侵襲性。Matthews等[28]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)異位內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，維持了基本形態(tài)，且其生化活性與在位內(nèi)膜相似。Tsuno等[29]建立的體外EMs基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型，為研究內(nèi)膜細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用機(jī)制提供了更好的平臺(tái)。Mehasseb等[30]通過體外三維模型的建立，發(fā)現(xiàn)子宮肌層細(xì)胞影響著基質(zhì)細(xì)胞浸潤的深度，提示EMs的發(fā)病與子宮肌層也許相關(guān)。建立EMs體外細(xì)胞模型有利于維持內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)特性，更好地模擬致病的微環(huán)境，觀察細(xì)胞生長，探討比較腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞不同特性及相互作用。此外，EMs體外細(xì)胞模型為觀察藥物療效、研究藥理提供了有效手段。但體外模型對(duì)于EMs遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性的觀察存在局限性，如何提高模型穩(wěn)定性、延長細(xì)胞生存時(shí)間也值得進(jìn)一步探索。

6 小結(jié)

本文希望通過對(duì)建模方法的探討，逐步完善動(dòng)物模型，使之更加貼合實(shí)驗(yàn)及臨床研究的需要。希望以動(dòng)物模型為平臺(tái)，深入了解EMs發(fā)病的免疫機(jī)制，了解腫瘤免疫逃逸相關(guān)因子如Foxp3、Fas-FasL通路等的作用，開發(fā)免疫治療新藥，探尋中藥免疫作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)多方面、多角度的中西醫(yī)結(jié)合治療，以期為EMs患者提供規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的診治方案，全面提高中西醫(yī)結(jié)合治療EMs的水平。

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（收稿日期：2015-11-12 本文編輯：張瑜杰）