ADAM17、EGFR和Ki—67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

呼鐵民 孫影 盧慶韜

[摘要] 目的 探討解聚素-金屬蛋白酶（ADAM17）、表皮生長因子受體（EGFR）和Ki-67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 選取2010年1月～2013年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的69例患者的手術(shù)切除標(biāo)本，其中腦外傷手術(shù)減壓的腦組織9例為對照組， I～I(xiàn)I級惡性膠質(zhì)瘤23例為低度惡性組， III～I(xiàn)V級惡性膠質(zhì)瘤37例為高度惡性組；采用免疫組化法檢測ADAM17、EGFR和Ki-67在3組標(biāo)本中的表達(dá)情況，并分析ADAM17、EGFR和Ki-67與腦膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性及三者之間表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 ADAM17、EGFR和Ki-67在正常對照組中不表達(dá)或弱陽性表達(dá)，ADAM17、EGFR和Ki-67在低度惡性組中陽性表達(dá)率分別為56.5%（13/23）、39.1%（9/23）和26.1%（6/23），ADAM17、EGFR和Ki-67在高度惡性組中陽性表達(dá)率分別為94.6% （35/37）、73.0%（27/37）和86.5%（32/37）。隨著惡性程度的提高，ADAM17、EGFR和Ki-67的陽性表達(dá)率均顯著增高（P < 0.01）。相關(guān)性分析表明ADAM17和EGFR、Ki-67和ADAM17及Ki-67和EGFR之間比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 ADAM17、EGFR和Ki-67與腦膠質(zhì)瘤的惡性度密切相關(guān)，三者聯(lián)合檢測有助于膠質(zhì)瘤惡性程度分級的判斷。

[關(guān)鍵詞] 腦膠質(zhì)瘤；解聚素-金屬蛋白酶17；表皮生長因子受體；Ki-67

[中圖分類號] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0021-04

Expression and clinical cignificance of ADAM17， EGFR and Ki-67 in Glioma

HU Tiemin1，2 SUN Ying1▲ LU Qingtao3

1.Department of Pathology， Basic Medical Science College， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063000， China； 2.Department of Neurosurgery， the Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Hebei Province， Chengde 067000， China； 3.Department of Surgery， Tangshan Railway Hospital， Hebei Province， Tangshan 063000， China

[Abstract] Objective To explore expression and clinical significance of ADAM17， EGFR and Ki-67 in human glioma. Methods 69 surgical samples were selected in the Affiliated Hospital of Chengde Medical College from January 2010 to December 2013， including 9 cases of brain tissue from brain trauma after surgery decompression （control group）， 23 cases of low grade glioma （low grade group） and 37 cases of high grade glioma （high grade group）. Expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 were detected in all samples by immunohistochemical staining. The correlation between expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 and the malignant degree of glioma were analyzed. Furthermore， the correlation between ADAM17 and EGFR， ADAM17 and Ki-67， as well as EGFR and Ki-67 in glioma were analyzed. Results There was negative expression or weak expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 in the control group. The positive expression rate of ADAM17， EGFR and Ki-67 was 56.5% （13/23）， 39.1% （9/23） and 26.1% （6/23） in low grade group respectively. The positive expression rate of ADAM17， EGFR and Ki-67 was 94.6% （35/37）， 73.0% （27/37） and 86.5% （32/37） in high grade group respectively. The positive expression rate of Ki-67， EGFR and ADAM17 increased significantly with the increase of malignancy degree （P < 0.01）. Correlation analysis showed positive correlation between EGFR and EGFR， Ki-67 and ADAM17， Ki-67 and ADAM17 （P < 0.01）. Conclusion ADAM17， EGFR and Ki-67 are closely related to the malignant degree of glioma. The combined detection of thse markers is helpful to classify the malignant degree of glioma.

[Key words] Gliom； Adisintegrin and metalloprotease 17； Epidermal growth factor receptor； Ki-67

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，呈浸潤性生長，具有惡性度高、易復(fù)發(fā)、治療效果差的特點(diǎn)[1]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受體，與配體結(jié)合后酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[2]。解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種基因，屬于ADAM家族。ADAM17具有蛋白剪切酶樣作用，在多種惡性腫瘤中都呈異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等行為[3]。最新研究表明ADAM17可通過剪切EGFR使其活化[4]。本研究前期顯示ADAM17在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)增高，但ADAM17與EGFR在膠質(zhì)瘤中的關(guān)系及意義目前并不清楚。Ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)核蛋白，可反映腫瘤細(xì)胞增殖活性。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測60例原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織中ADAM17、EGFR和Ki-67的表達(dá)情況，并分析三者之間的相關(guān)性，以探討ADAM17、EGFR和Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2010年1月～2013年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的60例腦膠質(zhì)瘤手術(shù)的切除標(biāo)本，所有患者術(shù)前未經(jīng)過放化療。其中男32例，女18例；年齡27～76歲，中位年齡45歲。60例腦膠質(zhì)瘤中，星形細(xì)胞瘤12例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤11例，間變型星形細(xì)胞瘤9例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤28例。按2007年WHO有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級，將上述患者分為低度惡性組（I～I(xiàn)I級膠質(zhì)瘤23例）和高度惡性組（III～I(xiàn)V級膠質(zhì)瘤37例）。另外，取腦外傷手術(shù)減壓的腦組織9例作為對照組。

1.2 主要試劑

兔抗人ADAM17多克隆抗體購自美國Adcam公司；鼠抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人單克隆抗體Ki-67、DAB顯色劑、SABC-POD試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

石蠟切片經(jīng)脫蠟、高壓抗原修復(fù)后，3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。血清封閉后，滴加抗ADAM17、EGFR和Ki-67的I抗（1︰100稀釋），4℃過夜，次日用PBS沖洗，滴加相應(yīng)II抗，孵育30 min，PBS沖洗，滴加SABC（鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶），繼續(xù)孵育30 min后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，顯微鏡下觀察。陰性對照組以PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定方法

400 倍光鏡下觀察，每例選擇3張切片，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野。光鏡下ADAM17和EGFR蛋白以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性表達(dá)，Ki-67陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。參照文獻(xiàn)[5]，根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率分為4個(gè)等級，0分：無陽性細(xì)胞；1分：<30%；2分：30～70%；3分：>70%。按染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級，0分：無陽性細(xì)胞；1分：染色呈淺黃色；2分：呈黃色；3分：棕黃色。陽性細(xì)胞數(shù)評分與染色強(qiáng)度評分相加作為最后綜合評分：陰性（0分）；弱陽性（1～2分）；陽性（3～4分）；強(qiáng)陽性（5～6分）。陽性表達(dá)率為所有陽性結(jié)果的百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，選用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ADAM17、EGFR和Ki-67之間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17的表達(dá)情況

ADAM17在對照組中陽性表達(dá)率為22.2%（2/9），2例陽性表達(dá)全部是弱陽性。60例腦膠質(zhì)瘤組織中，ADAM17的陽性表達(dá)率為80.0%（48/60），其中低度惡性組的陽性表達(dá)率是56.5%，以陽性表達(dá)為主；高度惡性組的陽性表達(dá)率是94.6% ，以強(qiáng)陽性表達(dá)為主。低度惡性組和高度惡性組的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.58，P < 0.01）。見圖1、表1。

A：對照組；B：低度惡性組；C：高度惡性組

圖1 解聚素-金屬蛋白酶17在不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（400×）

表1 ADAM17在不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

注：ADAM17：解聚素-金屬蛋白酶17

2.2 EGFR的表達(dá)情況

EGFR在對照組中無表達(dá)。60例腦膠質(zhì)瘤組織中，EGFR的陽性表達(dá)率為60.0%（36/60），其中低度惡性組的陽性表達(dá)率是39.1%，以陽性表達(dá)為主；高度惡性組的陽性表達(dá)率是73.0%，以強(qiáng)陽性表達(dá)為主。低度惡性組和高度惡性組的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.77，P < 0.01）。見圖2、表2。

A：對照組；B：低度惡性組；C：高度惡性組

圖2 表皮生長因子受體在不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（400×）

表2 EGFR在不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

注：EGFR：表皮生長因子受體

2.3 Ki-67的表達(dá)情況

Ki-67在對照組中無表達(dá)。60例腦膠質(zhì)瘤組織中，Ki-67的陽性表達(dá)率為63.3%（38/60），其中低度惡性組的陽性表達(dá)率是26.1%；高度惡性組的陽性表達(dá)率是86.5%，以強(qiáng)陽性表達(dá)為主。低度惡性組和高度惡性組的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.28，P < 0.01）。見圖3、表3。

2.4 ADAM17、EGFR和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

60例腦膠質(zhì)瘤組織中，ADAM17和EGFR兩者雙陰性的表達(dá)率為15.0%（9/60），雙陽性的表達(dá)率為56.7%（34/60），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩者呈明顯的正相關(guān)性（r = 0.612，P < 0.01）；ADAM17和Ki-67兩者雙陰性的表達(dá)率為15.0%（8/60），雙陽性的表達(dá)率為56.7%（35/60），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩者呈明顯的正相關(guān)性（r = 0.574，P < 0.01）；EGFR和Ki-67兩者雙陰性的表達(dá)率為18.3%（11/60），雙陽性的表達(dá)率為41.7% （25/60），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩者呈明顯的正相關(guān)性（r = 0.447，P < 0.01）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療效果差，深入研究其發(fā)病機(jī)制有助于找到更好的預(yù)防、診斷、治療膠質(zhì)瘤的方法。EGFR是原癌基因CerB1 （HER1） 的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體家族成員之一，該家族包括HER1、HER2、HER3 和HER4[2]。EGFR 信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮著重要的作用[6]。研究表明，在許多實(shí)體腫瘤中EGFR基因出現(xiàn)擴(kuò)增、重排或突變， 使其表達(dá)增多或持續(xù)活化，借助于下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，EGFR促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及抑制細(xì)胞凋亡等[7]。本研究結(jié)果顯示EGFR在對照組中無表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤組織中隨著惡性程度的增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在60例膠質(zhì)瘤組織中EGFR總的陽性表達(dá)率為60.0%，低度惡性組的陽性表達(dá)率（39.1%）和高度惡性的陽性表達(dá)率（73.0%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。這與文獻(xiàn)中的報(bào)道基本一致，說明EGFR參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。EGFR在分化差的膠質(zhì)瘤中表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，其高表達(dá)可認(rèn)為是膠質(zhì)瘤分化不良的標(biāo)志，與膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)[8]。

ADAM17在人類多種惡性腫瘤中都有異常表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)ADAM17在乳腺癌、胃癌、肝癌和肺癌等多種癌細(xì)胞中表達(dá)均增高，其可以通過EGFR-PI3K-AKT信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[9-12]。張艷等[13]曾利用免疫印記法檢測發(fā)現(xiàn)ADAM17在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高。本研究采用免疫組織化學(xué)法，發(fā)現(xiàn)ADAM17在膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)率（80.0%）顯著高于對照組（22.2%），且高度惡性組的陽性表達(dá)率（94.6%）明顯高于低度惡性組的陽性表達(dá)率（56.5%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），說明ADAM17在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)增多，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高表達(dá)更為強(qiáng)烈。Wu B等[14]也報(bào)道ADAM17在高度惡性膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)高于低度惡性的膠質(zhì)瘤。提示ADAM17與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)。ADAM17具有蛋白剪切酶樣作用，通過剪切使蛋白細(xì)胞膜外功能區(qū)脫落，激活或釋放許多結(jié)構(gòu)和功能不同的分子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[15-17]。研究顯示，ADAM17可剪切活化脫落雙調(diào)蛋白、TGF-β等EGFR的配體，活化EGFR及其通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)活性[18]。本研究中相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ADAM17與EGFR呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.612，P < 0.05），說明ADAM17與EGFR密切相關(guān)，ADAM17對EGFR可能具有調(diào)節(jié)作用。

Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，在靜止期細(xì)胞中不表達(dá)，但在各期增殖細(xì)胞中均有表達(dá)，因此可反映細(xì)胞增殖水平，被認(rèn)為是評估腫瘤增殖活性常用的最可靠的指標(biāo)[19-20]。本研究結(jié)果顯示Ki-67在對照組中無表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率高達(dá)63.3%，且高度惡性組的陽性表達(dá)率（86.5%）顯著高于低度惡性組的陽性表達(dá)率（26.1%）。說明隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，腫瘤細(xì)胞的增殖能力亦增加。另外，本研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ki-67的表達(dá)與ADAM17、EGFR的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r = 0.574、0.447，P < 0.05），表明ADAM17和EGFR與膠質(zhì)瘤細(xì)胞異常增殖有關(guān)，提示ADAM17和EGFR可能具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，ADAM17、EGFR均在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，Ki-67可作為判斷腫瘤惡性程度及預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的輔助指標(biāo)，ADAM17、EGFR和Ki-67與腦膠質(zhì)瘤的分化程度和增殖能力密切相關(guān)。聯(lián)合檢測ADAM17、EGFR和Ki-67并結(jié)合臨床參數(shù)對指導(dǎo)臨床治療和評價(jià)預(yù)后有一定應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2015-11-15 本文編輯：趙魯楓）