藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖及Gankyrin表達的影響

邱旭彬 曹杰 楊平

[摘要] 目的 觀察藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖和Gankyrin表達的影響，探討其抑制人結(jié)腸癌生長增殖的作用機制。 方法 以1.0、2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸作用體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HCT116細胞，并設(shè)未予藤黃酸處理的對照組。處理12、24、36 h后，分別采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡率，Western blot檢測Gankyrin蛋白水平的變化。 結(jié)果 藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞生長增殖具有抑制作用，且呈濃度和時間依賴性，相同濃度不同時間點的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），不同濃度相同時間點的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。流式細胞儀結(jié)果提示，藤黃酸阻滯HCT116細胞于G2/M期，1.0、2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸處理24 h后，處于G2/M期的細胞數(shù)量均較對照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；HCT116細胞的凋亡率隨藤黃酸濃度增加而逐步上升，2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸處理后HCT116細胞的凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。用不同濃度的藤黃酸處理HCT116細胞24 h，Gankyrin蛋白水平隨藥物濃度的增加而下降（P < 0.05）。 結(jié)論 藤黃酸能夠抑制人結(jié)腸癌HCT116細胞的生長增殖，誘導(dǎo)HCT116細胞阻滯于G2/M期，使Gankyrin的表達水平下降，其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用可能與抑制Gankyrin的表達相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 人結(jié)腸癌；HCT116細胞；藤黃酸；Gankyrin

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0004-04

Effect of gambogic acid on human colon cancer HCT116 cell proliferation and expression of Gankyrin

QIU Xubin CAO Jie▲ YANG Ping ZENG Shanqi WANG Chengxing WU Qianlong CHEN Huacui

Area Two of Department of Gastrointestinal Surgery， Affiliated Guangzhou First Municipal People's Hospital， Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To observe the effect of gambogic acid on human colon cancer HCT116 cell proliferation and expression of Gankyrin， and to discuss the suppression mechanism. Methods 1.0， 2.0， 4.0 μg/mL of gambogic acid was used in human colon cancer HCT116 cells which were cultured in vitro， and the control group that without gambogic acid was set. 12， 24， 36 hours after gambogic acid treatment， the cell proliferation activity was tested by methyl thiazolyl tetrazolium （CCK-8） assay， the cell-cycle kinetics and cell apoptosis were tested by flow cytometry （FCM）， and the change of expression of Gankyrin protein were tested by Western blot respectively. Results The proliferation of HCT116 cells was suppressed by gambogic acid in concentration and time dependent manner， inhibition rate of the same concentration in different time points had statistically significant difference （P < 0.05）， and the inhibition rate of the HCT116 cells with different concentration at the same time points had statistically significant difference （P < 0.05）. Results of FCM showed that， the HCT116 cell was stopped at G2/M period， 24 h after 1.0， 2.0， 4.0 μg/mL gambogic acid treatment， the number of cells in G2/M period increased significantly， compared with the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The apoptosis of HCT116 cell rose with the increase of gambogic acid concentration， after 2.0， 4.0 μg/mL gambogic acid treatment， apoptosis rate of HCT116 cells was higher than that of the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. 24 hours after different concentration of gambogic acid treatment， the level of Gankyrin protein decreased as the concentration increased （P < 0.05）. Conclusion Gambogic acid can significantly inhibit the proliferation of human colon cancer HCT116 cell， and induces the HCT116 cell stopped at G2/M period， decreases the level of Gankyrin expression， its effect of inducing apoptosis on tumor cells may related to the suppression of Gankyrin expression.

[Key words] Colon cancer； HCT116 cells； Gambogic acid； Gankyrin

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤。近年來隨著經(jīng)濟條件改善，人民生活水平逐漸提高，生活方式、飲食習(xí)慣及外部環(huán)境因素也隨之發(fā)生了改變，我國結(jié)腸癌發(fā)病率呈4.2%的增長趨勢逐年增長，當前已高居我國消化道腫瘤發(fā)病率的第2位，發(fā)病及病死人數(shù)已超過美國[1]。藤黃酸（gambogic acid，GA）是從中藥藤黃中提取的主要活性成分，為一種低毒性廣譜抗癌藥。本課題組前期的研究表明，其對消化道腫瘤療效顯著，尤其對結(jié)直腸癌細胞具有良好的抑制作用[2]。本研究觀察不同濃度的藤黃酸對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HCT116細胞作用情況，探討藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞的作用并檢測其對Gankyrin蛋白表達的影響，分析中藥成份藤黃酸誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細胞發(fā)生凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌HCT116細胞由美國ATCC公司引進，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供；藤黃酸粉劑，純度為99%，購自美國Sigma公司，-20℃保存；細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海生物工程有限公司；SDS-PAGE試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人Gankyrin多克隆抗體由美國Abcam公司引進。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸癌細胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌HCT116細胞置于含10%胎牛血清及雙抗（100 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素）的Gibco 1640培養(yǎng)基中，37℃，含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 采用CCK-8法檢測藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞生長增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT116細胞接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，細胞定量每孔2×104個細胞，培養(yǎng)24 h后撤出所有培養(yǎng)液，每孔分別加入體積200 μL的藤黃酸，再次添加新鮮培養(yǎng)基，并使其最終的濃度分別為0、1.0、2.0、4.0 μg/mL（0 μg/mL為對照組，其他各濃度為實驗組）。將各組細胞分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h后，于每孔中加入體積20 μL的CCK-8檢測液體繼續(xù)在原培養(yǎng)環(huán)境中孵育1 h后再小心吸棄各個孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)各OD值計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100，實驗重復(fù)3次，取其均值。

1.2.3 采用流式細胞檢測技術(shù)檢測細胞增殖情況 將人結(jié)腸癌HCT116細胞分別接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后將含藤黃酸的濃度分別為1.0、2.0、4.0 μg/mL的新鮮Gibco 1640培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板，把0 μg/mL設(shè)為對照組，培養(yǎng)24 h后按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法處理細胞，作流式細胞相關(guān)分析，將激發(fā)波長設(shè)為488 nm，并分析細胞周期的分布以及凋亡的情況。

1.2.4 采用Western blot檢測Gankyrin蛋白表達水平 藤黃酸0、1.0、2.0、4.0 μg/mL處理24 h的HCT116細胞，細胞定量2×106，分別按每1×106添加200 μL蛋白裂解液提取蛋白質(zhì)后，Bradford法分別測定蛋白含量。配用12%分離膠，5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，于每孔中加入蛋白質(zhì)50 pg，以100 V的恒壓電泳至膠底部分離，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入經(jīng)1∶500體積稀釋的兔抗人Gankyrin多克隆抗體，在搖床上勻速振搖2 h后，用PBST反復(fù)洗滌3次，每次持續(xù)15 min。然后再加人經(jīng)1∶400體積稀釋的兔抗羊IgG-HRP，在搖床上勻速振搖2 h，用PBST反復(fù)洗滌3次，最后用ECL試劑對硝酸纖維素膜進行顯色，暗室曝光，拍照，灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗或ANOVA方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞生長增殖的抑制作用

不同濃度的藤黃酸對HCT116細胞呈現(xiàn)出不同的抑制作用，當藤黃酸濃度為0 μg/mL時，其對HCT116細胞基本沒有抑制作用，處理12、24、36 h后，抑制率分別為（0.71±1.21）、（0.89±1.01）、（1.07±0.97）%；當藤黃酸濃度分別為1.0、2.0、4.0 μg/mL時，處理12、24、36 h后抑制率逐漸升高，且相同濃度不同時間點的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），不同濃度相同時間點的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。提示藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞的生長和增殖具有一定的抑制作用，且抑制率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而逐漸升高，抑制作用呈濃度及時間依賴性。見表1。

表1 不用濃度藤黃酸作用不同時間時對人結(jié)腸癌HCT116細胞

生長增殖的抑制率比較（%，x±s，n=3）

2.2 藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞周期的影響

藤黃酸作用人結(jié)腸癌HCT116細胞后，可顯著改變其細胞周期中各期細胞的構(gòu)成。經(jīng)1.0 μg/mL的藤黃酸處理24 h后，處于G2/M期的細胞數(shù)量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示人結(jié)腸癌HCT116細胞已被阻斷于G2/M期。此時細胞凋亡水平為（0.81±0.09）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；濃度為2.0 μg/mL時，G2/M期細胞數(shù)量較對照組明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；當藤黃酸劑量濃度增至4.0 μg/mL時，有50%以上的HCT116細胞被阻斷于G2/M期，而處于G0/G1期的細胞數(shù)量則相應(yīng)減少，與對照組比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。HCT116細胞的凋亡峰在藥物濃度4.0 μg/mL時為（14.07±1.21）%，且2.0及4.0 μg/mL的藤黃酸與對照組比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），提示藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞的生長增殖具有一定的抑制作用，結(jié)果呈濃度依賴性。見表2。

表2 經(jīng)梯度濃度藤黃酸作用24 h后HCT116細胞的周期變化

和凋亡水平（%，x±s，n=3）

注：與0 μg/mL同期比較，*P < 0.05，#P < 0.01

2.3 藤黃酸作用人結(jié)腸癌HCT116細胞后Gankyrin表達量的變化

分別用0、1.0、2.0、4.0 μg/mL藤黃酸處理HCT116細胞24 h，各組培養(yǎng)結(jié)束后Western blot檢測各組細胞Gankyrin蛋白表達水平，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用IPP測量各組平均灰度值。在相對分子量26kD處可見清晰Gankyrin蛋白條帶，當藤黃酸濃度為0、1.0、2.0、4.0 μg/mL時其灰度值分別為（723.00±3.61）、（597.00±2.14）、（392.00±1.54）、（101.00±0.74），差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0.05）。提示經(jīng)藤黃酸作用后Gankyrin蛋白的表達受到抑制，且隨著藤黃酸濃度的升高，Gankyrin蛋白表達逐漸減少。見圖1。

1：0 μg/mL；2：1.0 μg/mL；3：2.0 μg/mL；4：4.0 μg/mL；GAPDH：內(nèi)參

圖1 不同濃度藤黃酸處理后HCT116細胞中Gankyrin蛋白表達水平

3 討論

結(jié)直腸癌是目前國內(nèi)外最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前位居全球惡性腫瘤第3位[3-4]。其在經(jīng)濟發(fā)達國家發(fā)生率較高，是西方國家第2位高發(fā)的惡性腫瘤，美國結(jié)直腸癌的病死率位居所有癌癥死因的第3位[5]。根據(jù)我國納入腫瘤發(fā)生率監(jiān)控的5個大城市近10年結(jié)直腸癌的發(fā)生率變化，各地區(qū)結(jié)直腸癌的發(fā)生率均有不同程度的上升，其中上海和北京上升最快，廣州地區(qū)發(fā)病率已躍升至全國第3位[6]。而結(jié)直腸癌在廣州地區(qū)的發(fā)病率已經(jīng)高居所有腫瘤的第2位，僅次于肺癌，發(fā)病情況不容樂觀[7]。目前對于結(jié)腸癌的主要治療手段包括手術(shù)、化療、放療及三者的聯(lián)合治療等，現(xiàn)階段藥物治療雖然可以降低患者的復(fù)發(fā)率，延長患者的生命，但是化療藥物的毒副作用使其應(yīng)用受到了限制，且個別化療效果欠佳。開發(fā)研究新的高效低毒藥物，增強化療藥物特異性和敏感性是當前化療領(lǐng)域的研究熱點。

藤黃是藤黃科植物藤黃樹干經(jīng)切傷后所分泌的干燥樹脂[8]。而藤黃酸是植物中藥藤黃所分泌的干燥樹脂的主要成分。中醫(yī)藥學(xué)記載，藤黃，酸、澀、涼、有大毒[9]。但藤黃具有抗炎、止血、抑菌、抗病毒等多種功效，常用于治療跌打損傷、膿腫、癤癰及各種體蘚[10]。藤黃酸分子式為C38H44O8，相對分子量為628.76，為橙黃色無定型粉末，具有光學(xué)活性[11]?，F(xiàn)代研究表明藤黃酸具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)，能夠抑制多種腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移及促進腫瘤細胞的凋亡等功能。藤黃酸在有效劑量范圍內(nèi)的毒副作用相對來說比較小，有非常高的腫瘤細胞抑制選擇性，能夠選擇性地殺死癌細胞，而對正常動物機體的免疫功能和骨髓造血系統(tǒng)影響卻非常小，相對現(xiàn)階段臨床常規(guī)化療藥物優(yōu)勢明顯[12]。

Gankyrin作為近年發(fā)現(xiàn)的一個癌相關(guān)蛋白，與腫瘤細胞的細胞周期乃至凋亡存在明顯相關(guān)性。它作為一個重要組成部分，參與26S蛋白酶體的構(gòu)成。Gankyrin不僅參加調(diào)控P53及Rb通路，而且其與相關(guān)26S蛋白酶體參與DNA雙鏈的修復(fù)過程，具有抗凋亡作用。Gankyrin可與MDM2結(jié)合，促使p53泛素化降解，也可作用于CDK4蛋白，促使Rb磷酸化降解。Gankyrin曾被報道可誘導(dǎo)NIH3T3細胞具有非依賴支持生長的功能，且使細胞瘤化[13-15]。近年來研究報道以及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，Gankyrin與肝癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤相關(guān)[16-21]。

本研究結(jié)果提示藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞有明顯的增殖抑制作用，當藤黃酸濃度≥1.0 μg/mL時，其對HCT116細胞具有明顯抑制作用，且隨著時間的延長，其抑制率逐漸升高，結(jié)果呈現(xiàn)濃度及時間依賴性。

流式細胞儀檢測藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞的G2/M期具有明顯的阻滯作用，提示藤黃酸可以抑制HCT116細胞的DNA合成，從而阻止細胞周期中有絲分裂的關(guān)鍵進程，且主要使細胞停滯于細胞周期的G2/M期。而細胞周期的監(jiān)測點和這種細胞周期的停滯存在一定關(guān)系，當細胞受損后于對應(yīng)的檢測點進行相關(guān)DNA修復(fù)時無法對受損DNA進行功能修復(fù)，細胞就會程序性死亡[22]。流式細胞檢測結(jié)果提示除細胞周期阻滯外，藤黃酸還促進人結(jié)腸癌HCT116細胞的凋亡，本研究結(jié)果提示，在1.0 μg/m濃度狀態(tài)下，HCT116細胞的凋亡情況與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，當濃度為2.0、4.0 μg/mL時，HCT116細胞凋亡率顯著上升，但總體凋亡率較周期阻滯率仍較低，提示藤黃酸這種藥物作用于人結(jié)腸癌HCT116細胞時主要是由于對細胞周期阻滯的誘導(dǎo)作用，從而在一定程度上抑制了HCT116細胞的生長及增殖。

綜上所述，藤黃酸對人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖具有明顯的抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能是通過抑制Gankyrin的表達實現(xiàn)的。因此藤黃酸能夠有效地誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡，在結(jié)腸癌的預(yù)防和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，但其作用機制仍需進一步闡明。

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（收稿日期：2015-11-12 本文編輯：任 念）