纈草不定根組織培養(yǎng)的研究

李美陽 金江山

摘要：為了研究不同培養(yǎng)條件對纈草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）不定根生長及其有效成分含量的影響，利用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合高效液相色譜，通過改變培養(yǎng)基蔗糖、氮源和磷源濃度，研究其對纈草不定根的生長和纈草三酯類、纈草烯酸類合成的影響。結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時最適合纈草不定根的生長以及總纈草三酯類和總纈草烯酸類的生產(chǎn)。NO3-/NH4+為1∶1時，不定根生長量和纈草三酯類以及纈草烯酸類達(dá)到最高。改變培養(yǎng)基NaH2PO4濃度時，纈草不定根生長均比不添加NaH2PO4時旺盛，但高濃度的NaH2PO4抑制了纈草三酯類和纈草烯酸類的合成，NaH2PO4為基本培養(yǎng)基的0.3倍時，不定根生長量最高，達(dá)14.89 g/L，增長率也最高，達(dá)到16.18倍，纈草烯酸類也達(dá)到最高產(chǎn)量為13.88 mg/L。

關(guān)鍵詞：纈草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）；生物反應(yīng)器；纈草烯酸：纈草三酯；蔗糖濃度；氮源；磷源

中圖分類號：Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1304-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.055

Study on the Adventitious Roots Tissue Culture of Valeriana fauriei var. dasycarpa Hara

LI Mei-yang， JIN Jiang-shan

（College of Agriculture， Yanbian University， Yanji 133002， Jilin，China）

Abstract：To explore the effects of different culture conditions on Valeriana fauriei var. dasycarpa Hara adventitious roots growth and its effective components synthesis，the adventitious roots were obtained through tissue culture by manipulation of sucrose concentration， nitrogen and phosphate sources and the growth of plant， the content of valepotriates and valerenic acids were determined by HPLC. The results showed that when the sucrose concentration of 60 g/L were favorable for growth of adventitious roots and total valepotriates and valerenic acids production. The maximum root growth rates and content of valepotriates and valerenic acids were achieved while NO3-/NH4+ was 1∶1. To compare the media with adding NaH2PO4 and the medium without adding NaH2PO4，changing of NaH2PO4 concentration could favor for the adventitious root growth. But high NaH2PO4 concentration inhibited valepotriates and valerian acid biosynthesis. When NaH2PO4 in the basic culture medium of 0.3 times， growth of adventitious roots reached a maximum production of 14.89 g/L，growth rate was the highest， reached 16.18 times， total valerenic acids content was up to the highest yield 13.88 mg/L.

Key words：Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara；bioreactor；valerenic acid；valepotriate；sucrose concentration；nitrogen sources；phosphate sources

纈草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）屬于敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana）多年生草本植物，該屬植物全世界約有250余種，主要分布于氣候溫和潮濕的地區(qū)， 遍布整個歐洲、亞洲北部、南美洲以及美國[1]。中國約有30種（含變種），主要分布于西南、西北及東北地區(qū)[2]。纈草在歐洲及美國常被用于治療輕、重度失眠，具有鎮(zhèn)靜安神、解攣止痛、抗抑郁和抗腫瘤等作用，一直作為溫和的鎮(zhèn)靜安神催眠藥使用，纈草提取物及其制劑在國際上十分暢銷，銷售額列植物藥前10位[3]。纈草的根和地下根莖作為鎮(zhèn)靜藥已有很久的用藥歷史，中國早在明代李時珍的《本草綱目》中就有記載[4]，國外在Discorides時代也曾用過該藥，古希臘人和古羅馬人很早就認(rèn)識到纈草具有鎮(zhèn)靜安神作用[5]。

纈草屬植物自然生長十分緩慢，野生纈草資源急劇下降，同時不易人工栽培，因此采用細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)就顯得十分迫切。該技術(shù)可以不受季節(jié)、環(huán)境、氣候等影響，可以提供均一產(chǎn)物。國內(nèi)外學(xué)者先后開展了纈草的組織培養(yǎng)研究，但對纈草不定根的培養(yǎng)和合成次生代謝產(chǎn)物的研究報道比較少[6]。本試驗主要研究了蔗糖濃度、氮源和磷源對纈草不定根生長及其次生代謝產(chǎn)物纈草三酯類和纈草烯酸類合成的影響，旨在完善纈草離體培養(yǎng)條件，為纈草的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試種子購自韓國高麗大學(xué)種子庫，經(jīng)韓國全南大學(xué)黃柏教授鑒定為Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara。種子經(jīng)無菌處理獲得無菌苗并在MS+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根，在B5液體培養(yǎng)基中繼代多次。纈草三酯（Valtrate）、乙酰纈草素（Acevaltrate）、異纈草三酯（Isovaltrate）、纈草烯酸（Valerenic acid）、乙?；i草烯酸（Acetoxy valerenic acid）、羥基纈草烯酸（Hydroxy valerenic acid）等對照品由荷蘭格羅寧根大學(xué)的Rein Bos博士提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔗糖濃度對纈草不定根培養(yǎng)的影響 將繼代多次的纈草不定根約20 g（FW）接種到3 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器（含2 L培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。培養(yǎng)基添加不同質(zhì)量濃度的蔗糖（30、40、50、60、70、80、90 g/L）。培養(yǎng)基pH滅菌前調(diào)到5.7，所有處理均接種3～4個反應(yīng)器作為重復(fù)。

1.2.2 氮源對纈草不定根培養(yǎng)的影響 將繼代多次的纈草不定根約20 g（FW）接種到3 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器（含2 L培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。在含有6%蔗糖的B5培養(yǎng)基中采用KNO3和（NH4）2SO4改變NO3-/NH4+，分別為1∶1、2∶1、4∶1、5∶1。pH同上，所有處理均接種3～4個反應(yīng)器作為重復(fù)。

1.2.3 磷源對纈草不定根培養(yǎng)的影響 將繼代多次的纈草不定根約20 g（FW）接種到3 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器（含2 L培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。在含有6%蔗糖的B5培養(yǎng)基中加入NaH2PO4，濃度分別為原B5基本培養(yǎng)基的0、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0倍。pH同上，所有處理均接種3～4個反應(yīng)器作為重復(fù)。

1.2.4 生物量調(diào)查及數(shù)據(jù)分析 培養(yǎng)4周后，從反應(yīng)器取出不定根，用自來水沖洗2次后再用去離子水沖洗一次，然后加入液氮后進(jìn)行真空冷凍干燥1 d， 待不定根完全干燥稱重并計算其增長率。

增長率=（收獲時干重-接種時干重）/接種時干重×100%

1.2.5 次生代謝產(chǎn)物的分析 精確稱取纈草干燥粉1.0 g，加甲醇30 mL，超聲提取30 min，離心5 min取上清液后，殘留物中再加入15 mL甲醇用同樣的方法重復(fù)提取，把提取3次后的上清液加到一起，蒸發(fā)后加3 mL甲醇定容并經(jīng)0.2 μm膜過濾，即得到樣品溶液。纈草次生代謝產(chǎn)物的分析采用李美陽[7]的方法，用高效液相色譜儀測定纈草烯酸類和纈草三酯類成分。取每份供試品溶液和對照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按外標(biāo)法計算含量，取3次測試的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對纈草不定根生長及纈草三酯類和烯酸類合成的影響

不同濃度蔗糖對纈草不定根生長和對纈草烯酸類和三酯類合成的影響如表1所示。由表1可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，纈草不定根干質(zhì)量先持續(xù)增加，當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時不定根的生長量達(dá)到最大值5.58 g/L，不定根干質(zhì)量增長率也最高，達(dá)到 6.04 倍，其次為添加70 g/L蔗糖時不定根的生長量，達(dá)到5.25 g/L，干質(zhì)量增長率達(dá)到5.71倍，然后隨著蔗糖濃度的增加纈草不定根生長量逐漸下降。纈草三酯類和纈草烯酸類含量也隨著蔗糖濃度的增加而增加，當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時分別達(dá)到最高值10.32、12.86 mg/L。繼續(xù)增加蔗糖濃度時，不定根生長和纈草烯酸類、纈草三酯類合成受到抑制，蔗糖濃度為90 g/L時均降到最低值。

2.2 氮源對纈草不定根生長及纈草三酯類和烯酸類合成的影響

不同比值的氮源對纈草不定根生長、纈草烯酸類和三酯類合成的影響如表2所示。當(dāng)NO3-/NH4+比值為1∶1時，纈草不定根生長量為最高，達(dá)到5.50 g/L，干質(zhì)量增長率也最高，達(dá)到5.98倍，纈草三酯類和纈草烯酸類含量也達(dá)到最高，分別為10.29、11.89 mg/L。隨著NO3-/NH4+比值的增加，纈草不定根生長和纈草烯酸類、纈草三酯類合成逐漸下降，當(dāng)NO3-/NH4+的比值為5∶1時為最低值。

2.3 磷源對纈草不定根生長及對纈草三酯類和烯酸類合成的影響

表3為磷源對纈草不定根生長的影響。隨著NaH2PO4濃度的提高，纈草不定根生長先持續(xù)增加，當(dāng)NaH2PO4濃度為基本培養(yǎng)基的0.3倍時，不定根生長量最高，達(dá)14.89 g/L，干質(zhì)量增長率也最高，達(dá)到16.18倍，纈草烯酸類含量也達(dá)到最高，為13.88 mg/L，而纈草三酯類在NaH2PO4濃度為基本培養(yǎng)基的1.0倍時達(dá)最高值10.02 mg/L。當(dāng)缺乏NaH2PO4時纈草不定根生長緩慢，纈草三酯類和纈草烯酸類含量也最低，當(dāng)NaH2PO4濃度為基本培養(yǎng)基的1.0倍以上，纈草不定根的生長量又有所增加，但纈草三酯類和纈草烯酸類含量呈逐漸降低趨勢。以總纈草三酯類和纈草烯酸類含量來考慮，NaH2PO4濃度為基本培養(yǎng)基的0.3倍為最佳磷源。

3 小結(jié)與討論

3.1 蔗糖

蔗糖是植物體內(nèi)重要的組成成分，蔗糖在培養(yǎng)基中除了提供碳源和能源之外，還具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高蔗糖濃度有利于提高纈草不定根生長量，也有利于提高總纈草烯酸類和纈草三酯類合成。蔗糖濃度較高（高于70 g/L時），纈草烯酸類和纈草三酯類合成受到了抑制，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到90 g/L時，不定根生長緩慢，這可能與高濃度蔗糖引起的較高滲透壓抑制不定根生長有關(guān)。這與劉亞軍等[8]研究蔗糖對茶樹兒茶素生物合成的影響結(jié)果一致。

3.2 氮源

培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和氨態(tài)氮對纈草不定根生長和次生代謝產(chǎn)物的合成都有一定的作用。NO3-/NH4+的比值較低時，有利于提高纈草不定根生長量，也有利于提高總纈草烯酸類和纈草三酯類合成。隨著NO3-/NH4+比值的增加，纈草不定根生長、纈草烯酸類和纈草三酯類合成反而逐漸下降，當(dāng)NO3-/NH4+的比值為5∶1時降到最低值。

3.3 磷源

磷源對次生代謝的生物合成起著重要的作用，不同植物的次生代謝產(chǎn)物合成所需要的磷濃度不同。本試驗研究表明，在一定范圍內(nèi)加大磷源濃度能促進(jìn)不定根的生長。過低或過高濃度的磷源抑制了纈草烯酸類和纈草三酯類合成。這與郭肖紅等[9]對丹參不定根培養(yǎng)的結(jié)果一致。NaH2PO4以基本培養(yǎng)基的0.3倍時，不定根生長量最高，達(dá)14.89 g/L，增長率也最高，達(dá)到16.18倍，纈草烯酸類含量也達(dá)到最高，為13.88 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEATHWOOD P D，CHAUFFARD F，HECK E，et al. Aqueous extract of valerian root（Valeriana Officinalis L.） improves sleep quality in man[J]. Pharmacology Biochemistiy and Behavior，1982，17（1）：65-71.

[2] 黃寶康，鄭漢臣，秦路平，等.國產(chǎn)纈草屬藥用植物資源調(diào)查[J].中藥材，2004，27（9）：632-634.

[3] 黃仁泉，張 立，楊建麗，等.不同種纈草中纈草三酯和纈草烯酸類成分的HPLC分析和比較[J].中草藥，2002，33（11）：1000-1001.

[4] 李時珍.本草綱目（草部）.第14卷[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.

[5] HOUGHTON P J. The biological activity of valerian and related plants[J]. J Ethnopharmacol，1988，22（2）：121-142.

[6] 李美陽.培養(yǎng)條件對纈草不定根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（27）：10956-10957，10959.

[7] 李美陽.HPLC法測定不同采集時期的北纈草中生理活性成分含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：604-605.

[8] 劉亞軍，王正榮，孫美蓮，等.蔗糖對茶樹兒茶素生物合成的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，41（5）：743-750.

[9] 郭肖紅，高文遠(yuǎn)，李克峰.丹參不定根組織培養(yǎng)的研究（Ⅱ）碳源、氮源和磷源對丹參不定根培養(yǎng)的影響[J].中草藥，2007，38（6）：907-911.