四種柱花草種子萌發(fā)過程中參與糖代謝的酶活性變化研究

張瑜 嚴(yán)琳玲 虞道耿 楊虎彪 羅小燕 白昌軍

摘要：本研究通過測定柱花草4個品種在種子萌發(fā)過程中參與糖代謝的α-淀粉酶、β-淀粉酶和總淀粉酶活性的動態(tài)變化，得出α-淀粉酶活性在種子萌發(fā)和幼芽生長初期活性增加，在萌發(fā)中期和幼芽生長中后期酶活性降低，其中馬弓形柱花草變化幅度最大。β-淀粉酶活性在萌發(fā)期呈上升趨勢，到種子開始露白即胚根突破種皮時達(dá)到最大值，到幼芽生長期β-淀粉酶活性降低。其中維諾拉有鉤柱花草在不同時期的β-淀粉酶活性最低。以熱研2號柱花草參與糖代謝的淀粉酶活性進(jìn)行相關(guān)分析的結(jié)果表明，α-淀粉酶和總淀粉酶之間的相關(guān)性比β-淀粉酶的顯著，所以α-淀粉酶活性變化能夠更好地反映總淀粉酶活性的變化?？蔀檠芯恐ú莘N子萌發(fā)中的生理變化提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柱花草；種子萌發(fā)；糖代謝；酶活性

中圖分類號：S543.093 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1227-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.035

Study on the Changes of Enzyme Activity Involved in the Glucose Metabolism of Four Kinds of Stylo Seed Germination

ZHANG Yu， YAN Lin-ling， YU Dao-geng， YANG Hu-biao， LUO Xiao-yan， BAI Chang-jun

（Tropical Crops Genetic Resources Institute，CATAS/Ministry of Agriculture Key Laboratory for Utilization of Tropical Crops Germplasm Resources，Danzhou 571737，Hainan，China）

Abstract： In this paper， the activity of α-amylase， β-amylase and the total amylase enzyme which involved in glucose metabolism during seed germination of four Stylo species were tested and analyzed. The results showed that the activity of α- amylase enzyme increased in the early stage of seed germination and bud growth， and decreased in the middle period of seed germination and bud growth in the late， in which the variation in the Fine stem Stylo was the largest. The activity of β-amylase enzyme presented increasing trend in germination stage， and reached the maximum value when the seeds began to emerge white which means the radicle break through seed coat， and decreasedin the period of bud growth. The activity of β-amylase enzyme was the lowest in different periods of Verano Stylo. Taking Reyan NO.2 Stylo as example， the correlation analysis showed that the correlation between α-amylase and the total amylase was more significant than β-amylase， so the changes of α-amylase enzyme activity could better reflect the changes of total amylase enzyme activity. It provided a reference for the study on physiological changes of Stylo during seeds germination.

Key words：stylo；seed germination；glucose metabolism；enzyme activity

豆科植物的種子不僅含有豐富的碳水化合物，淀粉含量也較高，包括直鏈淀粉和支鏈淀粉[1，2]。淀粉在淀粉酶等水解酶作用下分解為簡單的可溶性糖，為種子萌發(fā)提供充分的能量和物質(zhì)準(zhǔn)備[3]。淀粉酶分為α-淀粉酶和β-淀粉酶[4]。α-淀粉酶在種子中是以結(jié)合態(tài)存在，底物為直鏈淀粉。β-淀粉酶作用底物為支鏈淀粉[5，6]。

柱花草[Stylo guianensis （Aubl） SW.]為豆科（Leguminosae）柱花草屬（Stylosanthes Sw.）植物，是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所在20世紀(jì)80年代從國外引進(jìn)，已從中選育出了一批優(yōu)良的豆科牧草新品種[7-9]。柱花草性喜濕熱，適生于中國熱帶、南亞熱帶地區(qū)，目前在海南、廣東、廣西等省區(qū)的推廣面積約54萬hm2。它是一種多功能、多效益的作物，可與農(nóng)、林、畜牧業(yè)緊密結(jié)合，互相促進(jìn)，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益[10-12]。目前關(guān)于柱花草的研究主要集中于品種選育、高產(chǎn)栽培技術(shù)、種子生產(chǎn)技術(shù)、營養(yǎng)品質(zhì)、抗性、飼料開發(fā)以及遺傳多樣性研究等方面[13-20]，對種子的研究主要在破除硬實，包括一些機(jī)械處理、熱水處理、高溫干燥處理、酸堿處理等對柱花草硬實種子發(fā)芽的影響，以及提高發(fā)芽方法上，包括赤霉素、超聲波對提高種子發(fā)芽率的影響，少量的保存技術(shù)研究方面[21-25]。對柱花草種子萌發(fā)的營養(yǎng)代謝研究是一個全新的領(lǐng)域，它對了解種子內(nèi)部生理功能，揭示柱花草種子萌發(fā)的代謝機(jī)理有很高的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗所用柱花草種子采集自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州院區(qū)牧草基地，為以下4種柱花草品種：熱研2號柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、維拉諾有鉤柱花草[S. hamata （L.）Taub.cv. Verano]、西卡柱花草（S. scabra Vog cv.Seca）和馬弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。

1.2 方法

選取飽滿健康、大小一致的種子進(jìn)行發(fā)芽試驗。種子用80 ℃熱水浸泡3～5 min后取出冷卻，將處理后的種子放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃、每天光照12 h、1 600 lx）中發(fā)芽，每隔2 d噴1次水保持濾紙的濕潤。

1.3 樣品制備

選取4種柱花草種子6種萌發(fā)狀態(tài)下的胚乳為樣品，并記錄每種萌發(fā)狀態(tài)下的種子長度、幼芽長（表1），裝入相對應(yīng)的密封塑料袋中，貼好標(biāo)簽，放入-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器設(shè)備

高速帶溫控離心機(jī)（TGL20M上海趙迪）、恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9272上海一恒）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S6江蘇諾基）、離心機(jī)（L-550湖南湘儀）、可見光分光光度計（N4上海儀電）、-80 ℃立式超低溫冰箱（DW-HL669中科美菱）。

1.5 測定項目

利用3，5-二硝基水楊酸方法（DNS）測定總淀粉酶活性、α-淀粉酶活性及β-淀粉酶活性[26]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行制圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶活性變化

由圖1可知，未經(jīng)過發(fā)芽處理的柱花草種子α-淀粉酶活性最低，4個品種中馬弓形柱花草酶活性較其他3個草種低。當(dāng)種子開始萌發(fā)后酶活性呈上升趨勢，4個草種的α-淀粉酶活性均有增加，是未處理種子酶活性的1.2～1.4倍。隨后當(dāng)種子露白時4個草種的α-淀粉酶活性降低，馬弓形柱花草降低幅度最大為13.9%；當(dāng)胚根露出種皮后，幼芽開始生長，淀粉酶活性上升達(dá)到最大值，是未處理種子酶活性的1.3～1.6倍。到萌發(fā)后期α-淀粉酶活性緩慢降低。分析可知，在4種柱花草種子萌發(fā)期間，α-淀粉酶的活性呈由低到高到低到高再到低的曲線變化，其中馬弓形柱花草變化幅度最大。這可能是由于種子萌發(fā)初期淀粉大量分解，α-淀粉酶活性升高，而幼芽生長后α-淀粉酶的作用底物減少酶活性降低。

2.2 β-淀粉酶活性變化

4種柱花草種子在未經(jīng)發(fā)芽處理和催芽處理后β-淀粉酶活性幾乎沒有太大變化，可能這個階段是大分子化合物在α-淀粉酶催化分解為小分子碳水化合物，β-淀粉酶活性變化不明顯（圖2）。種子開始萌發(fā)后，β-淀粉酶活性開始增加，到種子開始露白即胚根突破種皮時達(dá)到最大值，比未經(jīng)發(fā)芽處理種子的酶活性增加了24%～35%，其中馬弓形柱花草增加幅度最低，熱研2號柱花草略高于其他。到萌發(fā)后期，β-淀粉酶活性降低后又稍有增加。結(jié)果說明幼芽生長中期對支鏈淀粉的降解有所緩解，酶活性下降。酶活性后又增加，這可能是因為到幼芽生長后期，胚乳中的直鏈淀粉減少，提供小分子碳水化合物的主要是支鏈淀粉的降解，故β-淀粉酶活性在后期又增加。在4個品種種子的萌發(fā)過程中，維諾拉有鉤柱花草在不同萌發(fā)時期的β-淀粉酶活性最低。

2.3 總淀粉酶活性的變化

由圖3可知，在種子萌發(fā)初期總淀粉酶活性呈上升趨勢，緩慢增加。到萌發(fā)中期，總淀粉酶活性略微降低。到了萌發(fā)后期，幼芽開始生長，淀粉酶活性上升達(dá)到最大值，是未處理種子酶活性的1.2倍。其中西卡柱花草的總淀粉酶活性變化幅度最大。在柱花草種子萌發(fā)期間，淀粉降解程度在不同時期不相同。萌發(fā)初期淀粉降解較快，在萌發(fā)中期淀粉降解速度減緩，隨著幼芽的生長發(fā)育代謝加大，淀粉酶大量合成，淀粉進(jìn)入快速降解階段。

2.4 各酶之間酶活性比較分析

以熱研2號柱花草參與糖代謝的淀粉酶活性進(jìn)行相關(guān)分析，如圖4所示，總淀粉酶活性和α-淀粉酶活性關(guān)系的回歸方程：y=-2.073 0x2+5.772 3x+2.434 2，x是α-淀粉酶活性，y是總淀粉酶活性，二者之間有顯著的相關(guān)關(guān)系（R2=0.549 4）。總淀粉酶活性和β-淀粉酶活性關(guān)系的回歸方程：y=-1.579 9x2+4.106 3x+1.077 3，二者有顯著的相關(guān)關(guān)系（R2=0.334 6）。在熱研2號柱花草種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性總體比β-淀粉酶活性高，而且它和總淀粉酶之間的相關(guān)性比β-淀粉酶的顯著，所以α-淀粉酶活性變化能夠更好地反映總淀粉酶活性的變化。

3 小結(jié)與討論

1）α-淀粉酶在種子萌發(fā)初期和幼芽生長初期活性增加，在萌發(fā)中期和幼芽生長中后期酶活性降低，其中馬弓形柱花草變化幅度最大。這可能是由于種子萌發(fā)初期淀粉大量分解，α-淀粉酶活性升高，而幼芽生長后α-淀粉酶的作用底物減少酶活性降低。在種子萌發(fā)早期，大分子化合物是在a-淀粉酶催化分解為小分子碳水化合物，β-淀粉酶活性在該時期變化不明顯。到種子開始露白即胚根突破種皮時，主要是支鏈淀粉進(jìn)行水解生成單糖，供給幼芽的生長發(fā)育，因此β-淀粉酶活性達(dá)到最大值。到幼芽生長期β-淀粉酶活性降低，可能是因為在幼芽生長期對支鏈淀粉的降解有所緩解，酶活性下降。其中維諾拉有鉤柱花草在不同時期的β-淀粉酶活性最低。柱花草種子中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的變化規(guī)律正好相反，交替著對淀粉進(jìn)行催化降解。

2）柱花草種子萌發(fā)過程中降解淀粉的酶主要是α-淀粉酶，它的活性總體都比β-淀粉酶活性高，說明柱花草種子胚乳中的淀粉主要是直鏈淀粉，或者支鏈淀粉的降解不及直鏈淀粉，提供糖類營養(yǎng)物質(zhì)的主要是直鏈淀粉。以熱研2號柱花草參與糖代謝的淀粉酶活性進(jìn)行相關(guān)分析的結(jié)果說明，α-淀粉酶活性和總淀粉酶之間的相關(guān)性比β-淀粉酶的顯著，所以α-淀粉酶活性變化能夠更好地反映總淀粉酶活性的變化。

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