木薯種質(zhì)資源離體保存技術(shù)研究

劉連軍　黎萍　李恒銳　彭靖茹　李慧敏

摘要：為探討木薯（Manihot esculenta Crantz）種質(zhì)資源的離體保存方法，以GR891木薯品種試管苗為試材，研究了植物生長抑制劑（PP333、B9、S3307、ABA）對試管苗在常溫（25 ℃）條件下的保存效果。結(jié)果表明，在培養(yǎng)室溫度（25±2） ℃、光照度1500～2 000 lx、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)基中加入PP333、B9和S3307均可提高木薯試管苗的存活率。在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基上，木薯常溫保存的適宜PP333質(zhì)量濃度為1.0～1.5 mg/L或B9和S3307質(zhì)量濃度均為0.5～1.0 mg/L，保存240 d時存活率超過90%，試管苗根系發(fā)達(dá)、葉色濃綠、生長健壯，0.2～2.0 mg/L ABA培養(yǎng)基上試管苗長勢和存活率都明顯低于CK（對照）。

關(guān)鍵詞：PP333；B9；S3307；ABA；木薯（Manihot esculenta Crantz）；離體保存；試管菌

中圖分類號：S533 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2120-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.053

Abstract：The study aims to investigate the preservation methods of cassava germplasm in vitro.With material as cassava varieties GR891 cassava tissue culture plantlets，Study on the plant growth retardants （PP333，B9，S3307，ABA） on in vitro preservation at room temperature （25 ℃） temperature conditions. The results showed that in the culture room of temperature（25±2） ℃，light intensity 1 500～2 000 lx and illumination time of 12 h/d，the survival rate of cassava test-tube plantlet conserved on medium with PP333，B9 and S3307 could be improved.On the medium of MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L，the optimum concentration of PP333 was between 1.0～1.5 mg/L，while B9 and S3307 both were 0.5～1.0 mg/L which would be suitable for inhibiting the growth of cassava plantlets，and improving the survival rate.After 240 d preservation，the average survival rate amounted to about 90%. Conservation plantlets in vitro have flourishing root system， much green leaf， robust growth. And 0.2～2.0 mg/L ABA medium， the growth and survival rate of plantlets were obviously lower than CK （contrast）.

Key words： PP333；B9；S3307；ABA；cassava（Manihot esculenta Crantz）； preservation in vitro；test-turb plantet

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）的灌木狀植物，是世界三大薯類作物之一，素有“地下糧倉”、“淀粉之王”等美稱[1]，廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國廣為栽培，木薯的栽培及加工利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。目前世界各木薯生產(chǎn)國收集保存的木薯種質(zhì)已有8 500多份[2]，在海南儋州建立了中國最大的木薯種質(zhì)資源圃。國內(nèi)主要采用種質(zhì)資源圃的形式對木薯種質(zhì)資源進(jìn)行保存，這種保存方式需要大量的土地和人力資源，成本高，保存數(shù)量有限，且易遭受各種自然災(zāi)害的侵襲[3]。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，活體植物的組織培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)已成為種質(zhì)資源離體保存、利用和管理的重要手段[4，5]，同時為長期有效地保存木薯種質(zhì)資源提供了新的有價值的手段，由于其具有省時、省地、省空間和無病蟲害侵害等優(yōu)點，目前正廣泛用于生產(chǎn)實踐的各個領(lǐng)域。如何在常溫條件下讓保存的種質(zhì)以緩慢生長，達(dá)到延長繼代時間，減低培養(yǎng)成本的目的，是當(dāng)前種質(zhì)資源離體保存技術(shù)的重要研究課題。緩慢生長保存是指通過添加生長抑制劑或延緩劑、提高培養(yǎng)基的滲透壓、改變植物生長培養(yǎng)條件來限制培養(yǎng)物生長，從而延長繼代時間，目前已有部分學(xué)者通過組織培養(yǎng)的技術(shù)，利用生長抑制劑進(jìn)行香果樹、黃獨和巴戟天試管苗離體保存研究[6-8]。前人對木薯離體保存研究鮮有報道，朱文麗[9]通過調(diào)整培養(yǎng)基成分、蔗糖和甘露醇，獲得木薯離體保存較好的培養(yǎng)基配方。歐文軍等[10]對木薯離體保存進(jìn)行了研究，篩選出的卡那培養(yǎng)基可使木薯試管苗保存延長24個月。筆者在木薯胚性愈傷組織離體保存研究方面也取得了一定進(jìn)展[11，12]，但有關(guān)生長抑制劑對木薯試管苗離體保存的研究尚未報道，因此，本研究以由廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所提供GR891木薯品種為試材，旨在研究植物生長抑制劑對木薯試管苗離體保存的影響，以達(dá)到延長保存時間和提高存活率的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯優(yōu)良品種GR891為廣西亞熱帶作物研究所選育。

1.2 木薯無菌苗的誘導(dǎo)

從室溫大棚取帶有腋芽的木薯嫩枝為外植體，剪去葉片，將莖段兩端剪掉，剪成帶1個腋芽、長1.5～2.5 cm的小段，用自來水洗凈，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡8～10 s，再用0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗4遍。在培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照度1 500～2 000 1x，光照時間12 h/d的條件下，將已消毒的芽接種至MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基[13]上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，約30 d后將不定芽分切出來，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，約25～30 d為1個周期進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)2次。

1.3 木薯組培苗的離體保存

將木薯帶芽莖段無菌苗（0.5～1.5 cm）接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行多效唑（PP333）、比久（B9）、烯效唑（S3307）和脫落酸（ABA）的單因子試驗。以MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 6.5 g/L的培養(yǎng)基為對照（CK），分別添加不同濃度的PP333 （0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L）、B9（0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）、S3307 （0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）和ABA（0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L），以上各試驗每處理接種10瓶，每瓶接種4個材料，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間12 h/d，試驗時間為240 d。

保存至180 d觀測指標(biāo)包括：植株的高矮、側(cè)芽、葉片的狀態(tài)及植株長勢等。存活率試驗數(shù)據(jù)于保存后60、120、180和240 d用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對3次重復(fù)的試驗數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件處理。存活率=存活株數(shù)/接種株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長抑制劑對木薯試管苗保存180 d形態(tài)指標(biāo)的影響

為研究不同生長抑制劑在木薯試管苗保存中的作用，使用了PP333、B9、S3307和ABA 4種植物生長抑制劑，觀測了保存中試管苗的株高、側(cè)芽、根、葉片以及植株長勢情況（表1）。由表1可知，保存180 d時，當(dāng)PP333濃度為1.0～1.5 mg/L時，試管苗均能長出1～2個側(cè)芽，植株高大，上端觸及培養(yǎng)瓶蓋，葉片濃綠、寬大、肥厚；當(dāng)PP333濃度達(dá)到3.0 mg/L時，株高和葉片開始變小，無側(cè)芽，色澤不綠，植株纖細(xì)。高濃度的PP333對試管苗的生理損傷較大，降低PP333的使用濃度，能減少對材料的傷害，并使材料保持健壯。因此，PP333使用濃度宜在1.0～1.5 mg/L。

當(dāng)B9和S3307濃度為0.5～1.0 mg/L時，試管苗均能長出1～3個側(cè)芽，并且葉片濃綠、寬大、肥厚，植株健壯、側(cè)芽較多，生根率較高，試管苗存活時間長，成活率高，形態(tài)正常，利于繼代培養(yǎng)；當(dāng)B9和S3307濃度為2.0 mg/L時，株高和葉片開始變小，隨著濃度的升高而形態(tài)更小，色澤淡綠，植株長勢均表現(xiàn)較差。

ABA對保存中試管苗的生長影響較大，保存180 d時， ABA濃度1.0～2.0 mg/L培養(yǎng)基上植株葉片開始發(fā)黃，色澤淡綠，提前老化，早衰現(xiàn)象明顯；ABA濃度為0.2～0.5 mg/L時，盡管色澤綠，但植株矮小、莖芽畸形，存活率普遍較低。因此，綜合生長和存活情況，ABA濃度0.2～2.0 mg/L均不利于GR891木薯試管苗的離體保存。

2.2 PP333對木薯試管苗保存的影響

由圖1可知，保存期間PP333處理的木薯試管苗存活率明顯高于對照，低濃度PP333有利于提高試管保存的存活率。除3.0 mg/L外，3個不同濃度PP333處理的木薯試管苗均與對照CK的保存存活率差異顯著（除60 d外），在保存后期（180～240 d）PP333濃度為1.0～1.5 mg/L時，試管苗存活率最高，保存240 d時存活率分別達(dá)90.6%、92.8%，處理之間差異不顯著，與濃度為0.5、3.0 mg/L差異顯著，當(dāng)濃度提高到3.0 mg/L，對試管苗表現(xiàn)出毒害作用，死芽現(xiàn)象嚴(yán)重，保存存活率隨著時間的延長而快速下降。綜合分析認(rèn)為， 生長抑制劑PP333在木薯試管苗保存中適宜濃度為1.0～1.5 mg/L。

2.3 B9對木薯試管苗保存的影響

在培養(yǎng)基中加入一定濃度的B9可減緩植株生長，延長保存時間。由圖2可以看出，整個保存期間木薯試管苗存活率隨著B9濃度（0.2～1.0 mg/L）的升高而升高，0.5、1.0 mg/L處理一直維持在一個較高的水平上，在保存前期（60～120 d），各處理存活率與對照組相差不顯明；在保存后期（240 d），除0.5 mg/L濃度外，各處理與對照差異顯著，其中1.0 mg/L濃度的B9保存240 d時，存活率高達(dá)93.4%，與濃度為0.5 mg/L處理之間差異顯著，與濃度為0.2、2.0 mg/L處理之間差異顯著。隨著B9濃度的不斷升高（2.0 mg/L），木薯試管苗存活率開始下降，保存后期（240 d），存活率為75.6%，這可能是由于高濃度處理超出了細(xì)胞的生理耐受和反應(yīng)極限，破壞了正常細(xì)胞生理活動引起的。因此，適當(dāng)濃度的B9（0.5～1.0 mg/L）可以有效提高木薯試管苗的存活率。

2.4 S3307對木薯試管苗保存的影響

從圖3可以看出，保存60 d時在外加生長抑制劑S3307時，4種濃度水平對木薯試管苗的保存影響差別不明顯，各處理存活率均與對照差異不顯著。保存120 d低濃度S3307（0.2～1.0 mg/L）各處理仍有較高的存活率，隨著保存時間延長存活率開始緩慢下降，保存240 d時，處理濃度為0.5～1.0 mg/L時其存活率仍達(dá)到90.1%、93.6%，處理之間差異不顯著，與0.2、1.0 mg/L處理差異顯著。這可能是因為木薯自養(yǎng)能力較強，試驗所用的營養(yǎng)水平均在試管苗適應(yīng)保存生長范圍之內(nèi)，綜合分析認(rèn)為，生長抑制劑S3307在木薯試管苗保存中適宜濃度為0.5～1.0 mg/L較合適。

2.5 ABA對木薯試管苗保存的影響

由圖4可知，ABA處理與對照相比，處理組試管苗保存成活率低，當(dāng)ABA濃度≥0.5 mg/L時，頂芽明顯不向上生長，植株矮小，葉片變小，色澤不綠，大部分頂芽褐死，葉片嚴(yán)重發(fā)黃萎蔫。隨著濃度的升高抑制越強，劑量效應(yīng)越明顯，從而導(dǎo)致植株死亡，保存240 d時，ABA濃度為0.2 mg/L的存活情況相對最好，為65.2%。因此，ABA濃度0.2～2.0 mg/L均不利于GR891木薯試管苗的離體保存。

3 小結(jié)與討論

離體保存成功的關(guān)鍵因素之一是使用合適的植物生長抑制劑[14]。植物生長抑制劑具有很強的抑制細(xì)胞生長的生理活性。添加植物生長抑制劑，不僅能延長培養(yǎng)物在試管中的保存時間，而且能提高試管苗質(zhì)量和再次繼代成活[15]。在種質(zhì)資源離體保存過程中，緩慢生長法是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度和改變培養(yǎng)基成分來抑制保存材料的生長和延緩材料衰老從而延長繼代時間的一種保存方法[16]。因此探索適用于試管苗的高效節(jié)能保存方法，對開辟植物種質(zhì)保存的新途徑非常有意義。

本研究結(jié)果表明，PP333、B9和S3307均能有效地延長保存時間和提高存活率，且培養(yǎng)基上試管苗的長勢都明顯較對照好，在培養(yǎng)基中添加1.0～1.5 mg/L PP333對木薯試管苗保存效果最好，能夠有效延長木薯試管苗繼代間隔時間，保存240 d的存活率達(dá)90%以上，試管苗生長緩慢，生長量較少，葉色濃綠、葉片寬大、肥厚，這與李鋒等[8]在巴戟天上的研究結(jié)果一致。

有學(xué)者曾對馬鈴薯[17]和獼猴桃[18]的種質(zhì)保存試驗中，應(yīng)用較低濃度的ABA能明顯提高保存效果。但在研究中添加ABA后明顯降低保存中試管苗的存活率，植株均表現(xiàn)最先出現(xiàn)葉片黃化、早衰等癥狀。這與付傳明等[14]研究結(jié)果一致，綜合生長和存活情況，ABA濃度0.2～2.0 mg/L均不利于木薯試管苗的離體保存，其機理有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，在常溫培養(yǎng)條件下，常規(guī)培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長抑制PP333（1.0～1.5 mg/L）、B9和S3307（0.5～1.0 mg/L）可以有效地延長木薯試管苗保存時間，提高存活率，是一種對木薯種質(zhì)資源離體保存方法之一，該方法可節(jié)省費用，且安全、可靠、無病蟲害危害，尤其適用于無性繁殖作物，達(dá)到了延長保存時間和提高存活率的目的，對實現(xiàn)資源離體保存中節(jié)能高效的目標(biāo)，具有顯著的經(jīng)濟和生態(tài)效益。

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