青海大通三種小檗的小檗堿含量動態(tài)變化

向前勝　王寧　趙越　鄒林有　孫奎　王凱月

摘要：通過采用2010年版《中華人民共和國藥典》中“三顆針”中的鹽酸小檗堿含量測定方法，對青海省大通縣3種小檗屬（Berberis L.）植物不同時期、不同部位小檗堿的含量進行測定。結(jié)果顯示，各部位中根部的含量最高；各季節(jié)中，10月份的含量最高；3個種內(nèi)，直穗小檗（B. dasystachya Maxim.）的含量高于其他2個種。試驗結(jié)果可為綜合開發(fā)青海省小檗屬植物資源、擴大小檗堿的藥材來源和藥用部位、合理利用野生藥用植物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小檗；小檗堿；含量；動態(tài)變化；大通縣

中圖分類號：Q949.746.8（444DT） 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2045-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.031

Abstract： Using the determination method of berberine content in Sankezhen according to “Pharmacopoeia of People's Republic of China”， the berberine content in different organs of three Berberis Species in Datong county of Qinghai province during different periods was tested. Result shows that the berberine content is the highest in root among different organs， and is the highest in October among different period. The berberine content in B. dasystachya Maxim. is higher than in the other two species. This research could provide scientific basis for comprehensive development and reasonable utilization of Berberis resources in Qinghai， as well as for the expansion of medicinal plants resources and medicinal parts.

Key words： Berberis L.； berberine； contents； dynamic changes； Datong county

小檗屬（Berberis L.）為小檗科（Berberidaceae）中的大屬之一，業(yè)內(nèi)習(xí)稱為“三顆針”[1]，又名銅針刺、刺黃連、小檗等；其種類繁多，分布范圍廣，喜生于高海拔山區(qū)的山坡、林緣、灌叢、溝邊[2]。小檗屬植物所含的小檗堿是一種重要的醫(yī)藥原料，應(yīng)用領(lǐng)域較廣，在體外對抑制結(jié)腸癌、肝癌[3，4]、白血病[5]、鼻咽癌等多種癌細(xì)胞以及抗病原微生物方面均有顯著的作用[6，7]。青海省是小檗屬植物的重要分布區(qū)，有13種及1個變種，主要分布在青海省的大通、門源、循化、祁連、互助、尖扎、囊謙縣等地[8]。其中鮮黃小檗（B. diaphana Maxim.）、直穗小檗（B. dasystachya Maxim.）、西北小檗（B. vernae Schneid）在省內(nèi)分布范圍廣，資源蘊藏量大，開發(fā)利用前景廣闊。大通縣地處青海省東部，海拔2 280～4 622 m，全縣森林覆蓋率達(dá)38.1%，居青海省之首，水資源總量6.9億m3，是全省重要的水源涵養(yǎng)基地。其地處青藏高原，地形復(fù)雜多變，具有較強的代表性，因此試驗以大通縣為采樣基地，通過比較3種小檗屬植物在不同生長時期中不同部位的小檗堿含量差異變化，為青海省小檗資源的有效開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 野外樣品采集 分別于2013年10月、2014年5月和2014年7月在青海省大通縣寶庫鄉(xiāng)拉塄溝等地進行秋季、春節(jié)和夏季采樣，經(jīng)青海省農(nóng)林科學(xué)院野生植物資源研究所鑒定為鮮黃小檗、直穗小檗和西北小檗。樣品為經(jīng)自然干燥的根、莖稈和枝梢。采樣點情況見表1。

1.1.2 試劑 乙腈，色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司生產(chǎn)；甲醇，色譜純，美國fisher公司生產(chǎn)；磷酸二氫鈉，分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；鹽酸小檗堿（Berberine hydrochloride）標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC測得含量≥98%），批號110713-201402，中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 Waters ELSD 2424 高效液相色譜儀（美國Waters公司），Welchrom C18色譜柱（月旭材料科技上海有限公司），BS214S 電子天平（德國Sartorius公司），微量移液器（德國艾本德公司），pH計（上海大普儀器有限公司），KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 測試樣品制備 將采集到的新鮮小檗屬植物根部泥土處理干凈，自然干燥，按單株分別將根部、莖稈、枝梢、葉、果實分開，將5株同種植物同部位材料分別稱取10 g混合，經(jīng)粉碎機處理，過65目篩，保存，待測。

1.2.2 鹽酸小檗堿的含量測定方法 小檗堿的含量測定方法采用2010年版《中華人民共和國藥典》的“三顆針”中鹽酸小檗堿含量的測定方法[9]，每樣品重復(fù)測定3次，取均值。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氫鈉（24∶76）；流速1.0 mL/min，檢測波長345 nm，柱溫30 ℃。

1.2.4 對照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇分別制成10、20、30、40、50 μg/mL的母液，用帶有0.45 μm過濾膜的微孔針頭取濾液20 μL進樣。精確吸取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣各20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=4.99e+0.04X-1.08e+0.05，R=0.999 277。該方程表明，鹽酸小檗堿在此條件下呈良好的線性關(guān)系。其標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1，5次進樣峰面積值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.2.5 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過65目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.6 樣品測定 用帶有0.45 μm過濾膜的微孔針頭取供試樣品續(xù)濾液20 μL進樣，保留時間為16 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計分析軟件及Microsoft Office Excel 2007 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對不同時期、不同種、不同部位小檗屬植物中小檗堿含量進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株各部分小檗堿含量測定

取西北小檗根、莖稈、枝梢、葉、果實部分，按照供試品溶液制備法制備供試品溶液，每處理3次重復(fù)，經(jīng)0.45 μm針筒過濾器過濾，精密吸取20 μL進樣，每樣品重復(fù)進樣3次，將峰面積按外標(biāo)法計算，被測樣品中小檗堿的含量測定結(jié)果見表2。由表2可見，5個部位均含有小檗堿，其中根部、莖稈、枝梢部位小檗堿的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片、果實部位。因此，后續(xù)試驗選取有效部位為根部、莖稈和枝梢。

2.2 有效部位的含量測定

按照根部、莖稈、枝梢部位小檗堿的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片、果實部位的結(jié)果進行不同時期、不同部位3種小檗屬植物小檗堿含量的測定，結(jié)果見表3，高效液相色譜結(jié)果見圖3。從表3和圖3可見，不同時期產(chǎn)自青海省大通縣的3種樹齡相同的小檗屬植物中不同部位的小檗堿含量都不相同，可見不同時期對3種小檗屬植物體內(nèi)各部位小檗堿的含量影響是明顯的。其中10月份各部位小檗堿的含量除鮮黃小檗枝梢外，其他都高于7月份和5月份。尤其是根部含量最高，如鮮黃小檗的小檗堿含量為28.245 μg/mL，直穗小檗達(dá)到了49.682 μg/mL，西北小檗為29.015 μg/mL。都大大高于莖稈和枝梢部?？傮w來看，直穗小檗根部的小檗堿含量高于另2個種。

3 小結(jié)與討論

3.1 不同時期小檗堿含量的差異

在植物的年生長周期內(nèi)，5月份的植株正處于枝葉生長階段，光合同化產(chǎn)物主要供給植物營養(yǎng)生長，次生代謝的底物濃度較低，影響其生物合成過程，因而次生代謝物含量較低。7月份，植株體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)主要是供給莖部加粗，次生代謝合成途徑占主要地位，次生代謝物合成較多。到了10月份，植株基本停止生長，體內(nèi)生理活動減弱，呼吸代謝減慢，生長抑制劑等增多，由于內(nèi)源和外源因素的調(diào)節(jié)，次生代謝物更多處于代謝不活潑的庫中，沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移，就在各器官中積累下來，從而使次生代謝產(chǎn)物含量較高[10-12]。不過由于青藏高原特殊的地理條件和自然環(huán)境，小檗堿并不是次生代謝的最終產(chǎn)物，它會經(jīng)過進一步的代謝轉(zhuǎn)化為藥根堿[13]。

3.2 不同部位小檗堿含量的差異

試驗里同種小檗屬植物其不同部位小檗堿含量是不一樣的，植物不同部位次生代謝物的差異性表現(xiàn)在兩個方面，即不同部位次生代謝物種類的差異性和不同部位同種次生代謝產(chǎn)物含量的差異性；但同一部位又表現(xiàn)為次生代謝物的相似性。次生代謝物的形成和儲藏位點都嚴(yán)格限制在植物的一定發(fā)育期、特殊的器官、組織和特化的細(xì)胞內(nèi)[14-16]。雖然生物堿合成水平受基因控制，但環(huán)境的影響也使生物堿在植物體內(nèi)產(chǎn)生不均勻分布[17]。因而在小檗屬植物的根、莖稈、枝梢部小檗堿的含量分布出現(xiàn)了差異。

3.3 不同種小檗堿含量的差異

樹齡、生長時期、立地條件相同的不同種植物，其次生代謝物含量在不同個體間的變化是不同的，主要取決于該物種的遺傳基因。所以3種小檗屬植物各自的遺傳因素影響著體內(nèi)小檗堿的含量分布。

根據(jù)試驗結(jié)果，在青海省小檗屬植物資源深度利用開發(fā)上，利用時期建議以春、夏季為主；鮮黃小檗的利用建議以根為主；直穗小檗的利用以根和主莖稈為主，可嘗試培育一、二年生植株根、莖作為藥材來源；西北小檗的利用則建議利用主莖稈和枝梢，可專門培育地上主莖稈和枝梢部位，通過平茬等方式來利用。

試驗為綜合開發(fā)利用青海省小檗屬植物資源奠定了理論基礎(chǔ)，為擴大小檗屬植物的藥材來源和藥用部位提供了科學(xué)依據(jù)。特別是改變了傳統(tǒng)上認(rèn)為全部小檗屬植物根部小檗堿含量高于其他部位的觀念，這將改變西北小檗挖根式的利用方式，減輕原有的利用方式所帶來的生態(tài)環(huán)境和資源破壞力度，有助于實現(xiàn)資源的可持續(xù)合理利用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉曄瑋，王 勤，馬志剛，等.甘肅產(chǎn)三顆針植物中生物堿的測定及分布狀態(tài)的研究[J].分析測試學(xué)報，2004，23（3）：54-57.

[2] 林長松，左經(jīng)會，廖 雯.六盤水小檗屬植物資源及其開發(fā)利用前景[J].六盤水高等師范?？茖W(xué)校學(xué)報，2007，19（6）：6-8.

[3] 潘天春.四川攀西地區(qū)小檗屬植物資源及利用價值[J].技術(shù)與市場，2013，20（5）：314-315.

[4] HWANG J M，KOU H C，TSENG T H， et al. Berberine induces apoptosisthrough a mitochondria/caspases pathway in human hepatoma cells[J].Arch Toxicol，2006，80（2）：62-67.

[5] SONA J， LUBOS C，SILVIA L. Berberine induces apoptosis through a mitochondrial/caspase pathway in human promonocytic U937 cells[J].Toxicol In Vitro，2007，21（1）：25-31.

[6] 丁南南，童珊珊，丁麗霞，等.小檗堿的分析方法及藥理作用研究進展[J].藥物分析雜志，2012，32（7）：1298-1299.

[7] 中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典：二部[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[8] 李耀階.青海木本植物志[M].西寧：青海人民出版社，1987.201.

[9] 中華人民共和藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[10] 邱 剛，芮亞培，白 曲，等.HPLC法測定暗紅小檗中小檗堿含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：299-300.

[11] 張康健，馬希漢，馬 梅，等.杜仲次生代謝物生長積累動態(tài)的研究[J].林業(yè)科學(xué)，1999，35（2）：15-20.

[12] 張春霞，楊立新，余 星，等.種源、產(chǎn)地及采收樹齡對厚樸藥材質(zhì)量的影響[J].中國中藥雜志，2009（19）：127-129.

[13] 張玉紅，徐麗嬌，邱靜珺，等.不同植被地區(qū)天然黃檗生物堿含量對季節(jié)的響應(yīng)[J].植物研究，2014，34（3）：415-416.

[14] 張康健，王亞琴，馬希漢.杜仲葉次生代謝物生態(tài)學(xué)研究初報[J].林業(yè)科學(xué)，1999，35（6）：28-34.

[15] WIN K M. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecolar phylogenetic perspective[J]. Phytochemistry，2003，64：3-19.

[16] FERREIRA J F S，SIMON J E，JANICK J. Developmental studies of Artemisia annual flowering and artemisinin production under green house and field conditio[J].Planta Med， 1995， 61：167-174.

[17] GOEL D，SINGH V，ALI M，et al. Essential oils of petal，leaf and stem of the antimalarial plant Artemisia annual[J]. J Nat Med，2007，61：187-191.