甘藍型油菜BnFAD2-C5基因啟動子及內含子在表達水平的功能分析

劉睿洋劉 芳張振乾 官春云

湖南農業(yè)大學農學院 / 國家油料改良中心湖南分中心， 湖南長沙 410128

甘藍型油菜BnFAD2-C5基因啟動子及內含子在表達水平的功能分析

劉睿洋**劉 芳**張振乾 官春云*

湖南農業(yè)大學農學院 / 國家油料改良中心湖南分中心， 湖南長沙 410128

富含油酸的菜籽油具有重要的經濟價值， 使得高油酸育種及油酸形成機制成為熱點。油酸脫氫酶基因（FAD2基因）是控制油酸含量的關鍵酶基因。本文針對BnFAD2-C5基因展開研究， 根據(jù)油菜和甘藍的同源性， 克隆了1257 bp啟動子序列， 利用 GUS和 GFP作為報告基因分別構建含有不同片段長度的啟動子和內含子的缺失載體并轉化擬南芥， 經GUS染色檢測發(fā)現(xiàn)-319 ～-1 bp為該研究中最小啟動子； 采用Western blot技術分析啟動子和內含子不同區(qū)域的功能， 發(fā)現(xiàn)BnFAD2-C5啟動子區(qū)域-1257 ～-1020 bp和-319 ～-1 bp能夠誘導報告基因在轉基因擬南芥種子發(fā)育中期高效表達， BnFAD2-C5內含子具有增強啟動子轉錄水平的功能， 該功能主要由+631～ +1033 bp區(qū)域調控。

甘藍型油菜； BnFAD2-C5基因； 內含子增強效應； 擬南芥

菜籽油在我國食用成品油市場占有重要地位，高油酸菜籽油不容易被氧化， 保鮮更持久［1-3］， 具有重要的商業(yè)價值［4］。因此， 油酸含量的高低也成為評判油菜品質的重要指標， 同時， 高油酸育種及形成相關機理也成為目前各油料作物研究的熱點［5-6］。

目前在高油酸育種方面， 通過傳統(tǒng)育種的手段，官春云等［7］用60Co輻射誘變獲得油酸含量高達93.5%的材料， 和江明等［8］利用 EMS誘變油菜小孢子獲得油酸含量為80.34%的材料。油酸脫氫酶基因（fatty acid desaturase， FAD2）作為控制油酸、亞油酸和亞麻酸含量的主要基因［9-10］， 其功能主要是將油酸磷脂膽堿去飽和成亞油酸磷脂膽堿。Stoutjesdijk等［10］通過共抑制法沉默甘藍型油菜 FAD2基因， 將油酸含量提高至89%； Peng等［11］通過RNAi技術將甘藍型油菜FAD2基因和FAE1基因共同沉默， 使油酸含量提高至85.34%。然而， 與高油酸油菜育種相比， 油酸形成機制的研究則比較落后。詳細探究脂肪酸代謝路徑中的關鍵酶基因（FAD2基因）的調控機制， 將有助于充分利用 FAD2基因為高油酸育種提供參考。2006年， Kim等［12］通過缺失分析的手段，對芝麻FAD2基因（SeFAD2）上游調控序列分析研究，發(fā)現(xiàn)在上游5′端非翻譯區(qū)（untranslated region， UTR）內部存在一個1131 bp長度的內含子， 并且具有增強啟動子功能的效應， 而啟動子區(qū)域則主要含有一些起到負調控作用的順式作用元件。同時證實脫落酸（abscisic acid， ABA）可以促進芝麻FAD2啟動子的啟動轉錄功能， 增強SeFAD2基因的表達， 并確定了ABA應答元件在啟動子上的大致區(qū)域。Xiao等［13］通過對甘藍型油菜 BnFAD2-A5基因研究， 預測并分析了該啟動子及內含子上的順式作用元件，通過檢測轉基因擬南芥中 GUS活力， 證明BnFAD2-A5啟動子屬于組成型啟動子， 其內含子同樣具有增強基因表達的功能。BnFAD2-A5啟動子的活性受 ABA的誘導出現(xiàn)高表達現(xiàn)象， 并且定位到ABA在啟動子上的順式作用結合位點 ABRE所處的位置。

本實驗室前期已克隆到甘藍型油菜 BnFAD2基因的4個拷貝（BnFAD2-A5、BnFAD2-C5、BnFAD2-A1 和BnFAD2-C1）， 初步分析了BnFAD2-A5［13］和BnFAD2-C1［14］在轉錄水平的功能， 而BnFAD2-A1則是假基因（待發(fā)表）， 因此本研究針對 BnFAD2-C5基因展開研究， 克隆 BnFAD2-C5啟動子， 采用生物信息學分析啟動子及內含子的順式作用元件， 通過PCR技術構建啟動子及內含子的缺失載體并轉化擬南芥， 分析BnFAD2-C5啟動子和內含子的功能， 旨在為高油酸油菜分子育種在表達水平提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜湘油15和擬南芥（Arabidopsis thaliana Col）由國家油料改良中心湖南分中心提供。大腸桿菌 trans-T1購自北京全式金公司， pCAMBIA1303載體和農桿菌 GV3101均由湖南省作物基因工程重點實驗室陳信波教授贈予。

1.2 克隆BnFAD2-C5啟動子區(qū)域

本實驗室已通過RACE技術克隆了BnFAD2-C5基因的全長序列， 確定轉錄起始位點及轉錄終止位點， 且發(fā)現(xiàn)在5′UTR內部含有一個內含子序列（圖1）。在此基礎上， 本研究根據(jù)油菜與甘藍的同源性， 依據(jù)甘藍數(shù)據(jù)庫信息（http：//ocri-genomics.org/bolbase），在轉錄起始位點上游約 1700 bp處設計正向引物PBn-F1 （5′-AAATGAAATGAAAATCATGGTAGGTG-3′）， 在該基因編碼區(qū)內部設計反向引物CDS-R （5′-GCTTGATGTTGTGTCGGTTTCAGACTT-3′）， 通過PCR技術從甘藍型油菜基因組DNA中擴增BnFAD2-C5啟動子區(qū)域， 然后轉化到大腸桿菌并測序。

圖1 BnFAD2-C5序列結構示意圖Fig.1 Model of BnFAD2-C5 gene structure

1.3 生物信息學分析

利用 PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/ PLACE）和PlantCARE （http：//www.intra.psb.ugent.be：8080/PlantCARE）網站對 BnFAD2-C5啟動子及內含子序列預測分析。

1.4 啟動子及內含子缺失表達載體構建及擬南芥的轉化

缺失載體構建過程中所用引物見表1。采用PBn-F1和IBn-r引物從基因組中克隆啟動子+內含子片段， 經 Hind III/Nco I雙酶切處理， 連接到pCAMBIA1303載體， 構建表達載體 Bn-1， 導入大腸桿菌保存。以含有Bn-1載體的大腸桿菌菌液為模板， 分別以引物 PBn-F1/PBn-R、PBn-F2/PBn-R、 PBn-F3/PBn-R、PBn-F4/PBn-R、PBn-F5/PBn-R克隆啟動子缺失片段， 經 Hind III/Nco I雙酶切處理后，按照上述方法， 將其連接到 pCAMBIA1303載體，構建啟動子缺失表達載體 BnP-1、BnP-2、BnP-3、BnP-4和BnP-5 （圖2）。

同樣以含有 Bn-1載體的大腸桿菌菌液為模板，以IBn-F/IBn-r引物進行擴增； 以IBn-R1、IBn-R2、IBn-R3和IBn-R4為反向引物， IBn-F1為正向引物，進行 PCR擴增， 各取 3 μL PCR產物與 3 μL IBn-F/IBn-r產物進行融合 PCR， 反應體系含緩沖液4 μL、dNTPs 2 μL、HS Taq聚合酶0.5 μL、ddH2O 7.5 μL； 反應條件為95 ℃ 5 min ； 95 ℃ 50 s， 58℃ 50 s，72 ℃ 4 min， 15個循環(huán)。取2 μL融合產物作為模板，以IBn-F1/IBn-r為引物進行PCR擴增， 擴增程序為95℃ 5 min； 95 ℃ 50 s， 58℃ 50 s， 72 ℃ 4 min， 25個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。將融合產物克隆到大腸桿菌并測序。選擇測序正確的菌株搖菌， 提取質粒并進行Hind III/Nco I雙酶切， 然后將酶切后的產物純化并連 接 到經 Hind III/Nco I 雙酶 切 處理 的pCAMBIA1303載體， 構建內含子缺失載體BnI-1、BnI-2、BnI-3和BnI-4 （圖2）。以含有CaMV35S啟動子的 pCAMBIA1303載體為陽性對照， 去除CaMV35S啟動子的作為陰性對照。

表1 不同長度BnFAD2-C5啟動子片段和引物序列Table1 Different fragments of the BnFAD2-C5 promoter and the primer sequences

圖2 缺失載體構建模式圖Fig.2 Construction pattern diagram of deleted vector

將構建好的表達載體通過凍融法導入農桿菌GV3101， 將轉化后的農桿菌菌液涂到含有慶大霉素（GM）和卡那霉素（Kan）的YEB固體平板篩選， 挑選單菌落進行PCR檢測， 并將陽性菌液保存于-80℃。在轉化擬南芥前， 將含有目的表達載體的農桿菌畫線接種于含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB固體平板， 28℃倒置培養(yǎng)2 d， 挑取單菌落于10 mL含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB液體培養(yǎng)基搖過夜， 取2 mL接種于50 mL含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB液體培養(yǎng)基， 待其OD600為0.4～0.6時， 收集菌體（5000轉 min-1， 5 min）， 用5 mL 10 mmol L-1MgSO4溶液重懸， 加入5 μL乙酰丁香酮（200 μmol L-1）于暗光下靜置 1.5 h。隨后加入100 mL滲透培養(yǎng)基， 通過花序浸染法轉化擬南芥。

1.5 GUS染色及GFP蛋白相對表達量分析

參照 Jefferson等［15］GUS組織化學檢測的方法檢測轉基因擬南芥種子不同發(fā)育時期（4、7、10和13 d） GUS表達情況。以GFP為報告基因， 以Actin為內參， 通過Western blot技術對GFP和Actin顯影，利用 Quality One軟件將 Western雜交斑點數(shù)字化，以GFP含量比Actin含量所得的數(shù)值表示GFP蛋白的相對含量， 以此確定不同缺失載體啟動報告基因GFP的功能大小。

2 結果與分析

2.1 啟動子區(qū)域的克隆及 BnFAD2-C5基因上游序列的生物信息學分析

根據(jù)油菜和甘藍的同源性， 同源克隆了1257 bp啟動子序列， 與甘藍基因組序列僅有 2個堿基的差異。利用PLACE和PlantCARE網站對BnFAD2-C5基因啟動子和內含子區(qū)域預測分析（圖3）， 發(fā)現(xiàn)在啟動子區(qū)域存在核心啟動子必備的元件 TATA box （-139 bp）和CAAT box （-61 bp）， 同時還存在一些控制基因高效轉錄的元件（CCAATT box， GATA， 5′UTR Py-rich）， 激素應答元件（TCA motif、CGTCA motif、ABRE、MYB、MYC和GARE）， 根毛特異性元件（root hair specific element， RHE）， 光調控元件（GAG，G-boxGT-1 consensus合Dof）， 花粉特異性表達元件（GTGA）， 胚乳特異性表達元件（ACGT）， 以及具有正、負調控功能的元件CACA。

在內含子區(qū)域， 同樣存在 TATA box和 CAAT box， 分別位于+1241 bp和+1040 bp處。另外， 內含子區(qū)域也包含一些順式作用元件， 如胚乳特異性表達原件（ACGT， Skn-1motif）， 激素應答原件（MYB、MYC、GARE）， 分生組織特異性原件（CAT box）， 抗性原件（W-box）， 光控原件（G-box、GT-1consensus），熱激蛋白原件（heatshockprotein element， HSE）以及Dof和E-box。

2.2 BnFAD2-C5啟動子功能分析

由GUS染色結果（圖4）可知， 當BnFAD2-C5啟動子缺失掉大部分區(qū)域， 僅保留-136 ～ +137 bp區(qū)域時（BnP-5）， GUS染色結果與陰性對照相同， 該部分序列不能發(fā)揮啟動子功能， 而 BnP-1、BnP-2、BnP-3和BnP-4均有不同程度的著色。將含有BnP-1、BnP-2、BnP-3和BnP-4的轉基因擬南芥發(fā)育中的種子進行蛋白相對定量檢測， 將 Western blot結果經Quality軟件數(shù)字化后， 以GFP含量比Actin含量所得的數(shù)值表示 GFP蛋白的相對含量， 結果如圖5。BnP-1和BnP-4的GFP蛋白相對含量高于BnP-2和BnP-3， 而BnP-2和BnP-3的相對蛋白含量較為接近，說明在缺失的-1257 ～-1020 bp區(qū)間存在調控基因高表達的正調控元件， 在-581 ～-319 bp區(qū)間存在抑制基因表達的負調控元件， 且主要是抑制-319 ～-1 bp區(qū)間的順式作用元件的功能發(fā)揮。BnP-1和BnP-4在種子發(fā)育中期出現(xiàn)表達高峰， 而 BnP-2和 BnP-3在整個種子發(fā)育過程中表達量變化較為平緩， 說明在-1257～-1020 bp和-319～-1 bp區(qū)間存在某些調控元件誘導報告基因GFP在種子發(fā)育中期高效表達。

2.3 BnFAD2-C5內含子功能分析

由圖5-A中BnP-1轉基因擬南芥種子GFP蛋白相對含量與圖6-A中Bn-1比較可知， BnFAD2-C5內含子具有增強啟動子功能的效應， 為了研究發(fā)揮這一增強效應的內含子區(qū)域， 本研究將內含子區(qū)間缺失并轉化擬南芥驗證。分別采用GUS染色和Western blot方法檢測轉基因擬南芥不同發(fā)育時期（4、7、10 和13 d）種子中報告基因GUS/GFP的含量。GUS染色結果顯示， 隨著內含子片段的逐步缺失， 染色有不同程度的變化（圖7）， 說明內含子不同區(qū)域發(fā)揮著一定的功能。利用Quality One軟件將Western雜交斑點數(shù)字化后繪制曲線（圖6）， 發(fā)現(xiàn)當缺失+631～+1033 bp區(qū)域后， GFP蛋白相對含量大幅下降， 當繼續(xù)缺失+526 ～ +631 bp時， GFP相對蛋白含量幾乎降至零， 但下降幅度減小， 說明在+631 ～ +1033 bp區(qū)域存在正調控元件促進基因的高效表達， 在+526 ～+631 bp區(qū)域也存在正調控元件， 但功能較弱。隨著進一步的缺失， BnI-3和BnI-4 GFP蛋白相對含量逐漸上升， 說明在缺失掉的+266 ～ +526 bp區(qū)間， 含有負調控元件抑制啟動子的功能。因此， 推測內含子的增強效應主要取決于+631 ～ +1033 bp區(qū)域順式作用元件的功能發(fā)揮。

圖5 轉基因擬南芥種子中BnFAD2-C5啟動子的功能分析Fig.5 Functional analysis of BnFAD2-C5 promoter in transgenic Arabidopsis seed

圖6 轉基因擬南芥種子中BnFAD2-C5內含子功能分析Fig.6 Functional analysis of BnFAD2-C5 intron in transgenic Arabidopsis seed

3 討論

圖7 含有BnFAD2-C5內含子片段的轉基因擬南芥種子GUS染色結果Fig.7 Histochemical staining of GUS in transgenic Arabidopsis seed with BnFAD2-C5 intron

3.1 內含子具有增強BnFAD2-C5表達水平的功能

BnFAD2-C5基因的全長序列已克隆， 發(fā)現(xiàn)長度為1123 bp的內含子位于5′UTR內部。類似的序列特征在玉米［16］、大豆［17］、擬南芥［12］、芝麻［12］和油菜［13］中均有報道， 且發(fā)現(xiàn)這些內含子通常具有增強效應。本文也證實該內含子具有增強BnFAD2-C5基因表達水平的功能。一般而言， 內含子增強效應由內含子剪切模式［18］、內含子的長度［19］以及內含子的特殊元件決定， 但是Parra等［20］認為內含子剪切模式不足以對啟動子功能產生增強效應， Carola等［21］證實內含子的長度越長其增強效應越強。在本研究中， 缺失掉大部分內含子序列的BnI-4其GFP蛋白相對含量卻比BnI-3和BnI-4有所增加， 那么， 認為內含子的長度并不是導致該內含子發(fā)揮增強效應的原因，該內含子的增強效應極有可能是特殊的調控元件與啟動子區(qū)域互作引起的。當內含子+631～ +1033 bp區(qū)域缺失后， GFP蛋白相對含量明顯下降， 而隨著進一步缺失并沒有再次引起GFP蛋白相對含量的大幅下降（圖5-A）， 說明內含子增強效應區(qū)域主要存在于+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 而不是整個內含子區(qū)間。Parra等［20］認為， 內含子的增強效應元件主要存在于內含子的5′端， 而不是內含子的3′端， 在5′UTR和編碼區(qū)也會大量出現(xiàn)。如果內含子含有大量 CGATT拷貝， 則會大幅增加基因的表達量。在油菜BnFAD2-C5內含子的5′端+262 ～ +266 bp處存在一個CGATT，并且BnI-4 GFP蛋白相對含量高于BnI-1、BnI-2和BnI-3， 所以當+266 ～ +631 bp區(qū)間的負調控元件被解除后， CGATT元件極有可能增強了基因的表達水平， 導致BnI-4中GFP蛋白相對含量增加。Kim等［12］發(fā)現(xiàn)芝麻 FAD2基因的內含子增強效應區(qū)域為+791 ～+1517 bp， 處于遠離內含子5′端的位置， 并推測內含子中具有增強功能的元件與增強子的作用方式相近，并不受距離的影響， 可以在遠距離發(fā)揮增強作用。本研究中BnFAD2-C5內含子增強效應的主效元件位于+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 也遠離內含子 5′端， 推測該內含子功能的發(fā)揮不受距離的影響， 發(fā)揮功能的元件可以遠距離增強啟動子的轉錄水平。

Rose［22］研究發(fā)現(xiàn)， 內含子增強效應主要是富含U的序列導致， 內含子的 5′和 3′剪切位點和分支點突變時， 會影響內含子的剪切， 但不一定會引起內含子增強效應的減弱。我們分析了+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 其中存在 38.7%的 U序列， 同時還存在ABRE/MYB/MYC、E-box、GARE元件， 研究發(fā)現(xiàn)這些元件在油菜種子napA啟動子和擬南芥中， 當植物受到干旱刺激和病原菌危害時能夠增強相應啟動子的功能， 誘導基因的高表達［23-24］。

3.2 BnFAD2-C5啟動子具有誘導基因表達的功能

從圖4-C可知， 含有BnP-1和BnP-4的轉基因擬南芥種子發(fā)育至7 d時， 出現(xiàn)高表達現(xiàn)象， 具有典型誘導表達的特點， BnP-2和BnP-3則呈現(xiàn)組成型表達的特點， 在種子發(fā)育的各個時期蛋白含量變化微弱。因此我們認為-1020 ～-319區(qū)域存在控制基因組成型表達的相關元件。在BnP-1的-1257 ～-1020 bp和BnP-4的-319 ～-1 bp中存在某些元件在種子發(fā)育至7 d時可以被激活， 誘導該基因的表達， 通過PLACE和 PlantCARE網站預測可知， 在-1257～-1020 bp和-319～-1 bp分別含有 2 Dof， 3 GT-1consensus、BoxII、TCA motif、GAG和GATA、G-box、3GT-1consensus、4 Dof、GAG、GC-motif、CGTCA motif、TATA-box和CAAT-box。GT-1consensus在病原菌和NaCl的誘導下會促進SCaM-4基因啟動子轉錄［25］， TCA motif是水楊酸應答元件， 抑制iMyAP基因啟動子的轉錄［26］。Dof、BoxII、GAG是光誘導調控元件， 感受光刺激誘導基因的表達， Dof蛋白結合Dof調控位點增強cyPPDK基因和PEPC基因的轉錄［27］。CGTCA motif是茉莉酸應答元件，當植物體內茉莉酸含量上升時， 誘導相關基因的表達［26，28］。GATA元件， 具有增強cab基因啟動子轉錄水平的功能［29］。CAAT-box能提高轉錄起始頻率， 并且參與基因表達量的調控［30］。因此， 下一步工作可以針對-1257 ～-1020 bp和-319 ～-1 bp區(qū)域展開研究， 探索對BnFAD2-C5基因發(fā)揮誘導功能的主效區(qū)域及主效元件。

4 結論

克隆了 BnFAD2-C5啟動子序列， 其-1257～-1020 bp和-319～-1 bp區(qū)域具有誘導基因表達的功能； BnFAD2-C5內含子具有增強轉錄水平的效應，這一功能主要由+631～ +1033 bp區(qū)域調控。

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Functional Analysis of BnFAD2-C5 Promoter and Intron at Expression Level in Brassica napus

LIU Rui-Yang**， LIU Fang**， ZHANG Zhen-Qian， and GUAN Chun-Yun*

College of Agriculture， Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan， Changsha 410128， China

High oleic rapeseed breeding and the formation mechanism of oleic acid have become a central issue after finding the important economic value of rapeseed oil with high oleic acid.The fatty acid dehydrogenase gene （FAD2） is a key enzyme gene to control oleic acid content， but the regulation of FAD2 gene is not well understood.According to the homology between rapeseed and oleracea， the BnFAD2-C5 promoter sequence of 1257 bp was cloned.Promoter and intron of BnFAD2-C5 gene were analyzed using β-glucuronidase （GUS） reporter and green fluorescent protein （GFP） reporter system to construct deleted vectors and transform Arabidopsis thaliana.Deletion analysis of BnFAD2-C5 promoter through GUS stainning revealed that-319 to-1 bp was the minimum promoter region.And deletion analysis of BnFAD2-C5 promoter and intron through GFP reporter system using western technique showed that-1257 to-1020 bp and-319 to-1 bp regions of BnFAD2-C5 promoter could induce expression of reporter genes effectively in transgenic Arabidopsis seed in the mid stage of seed development， while BnFAD2-C5 intron could confer the enhancement of promoter’s function and the intron-mediated enhancement region was mainly located in +631 to +1033 bp.

Brassica napus； BnFAD2-C5 gene； Intron-mediated enhancement； Arabidopsis thalina

10.3724/SP.J.1006.2016.01471

本研究由湖南省科技創(chuàng)新項目（CX2013A012）和國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目（2015CB150200）資助。

This study was supported by the Science and Technology Innovation Project of Hunan Province （CX2013A012） and the National Basic Research Program of China （2015CB150200）.

（Corresponding author）： 官春云， E-mail： guancy2011@aliyun.com

聯(lián)系方式： E-mail： ruiyang_liu2007@126.com**同等貢獻（Contributed equally to this work）

Received（）： 2016-02-16； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-06-06.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160606.0855.002.html