口腔與胃內(nèi)幽門螺桿菌感染的相關(guān)性研究

萬洋洋，陳　相，趙　枰，王　朔

(江蘇省南通市第一人民醫(yī)院　226001)

?

·論著·

口腔與胃內(nèi)幽門螺桿菌感染的相關(guān)性研究

萬洋洋，陳相，趙枰，王朔△

(江蘇省南通市第一人民醫(yī)院226001)

目的探討口腔與胃幽門螺桿菌感染的相關(guān)性。方法用幽門螺桿菌的特異性引物及特異Taqman探針進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測27例根除治療失敗患者牙菌斑和胃黏膜幽門螺桿菌DNA，并進一步運用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析技術(shù)分析口腔和胃內(nèi)幽門螺桿菌菌株DNA基因型。結(jié)果FQ-PCR：27例胃黏膜及牙菌斑標本采用FQ-PCR檢測幽門螺桿菌，胃黏膜均為陽性；牙菌斑25例陽性，2例陰性。SSCP：胃黏膜和牙菌斑幽門螺桿菌基因型相同者(SSCP帶型相同)19例，其余6例兩者至少有1種相同的SSCP帶型。結(jié)論同一個體牙菌斑和胃黏膜中的幽門螺桿菌屬同種菌株的可能性大。口腔幽門螺桿菌可能是胃幽門螺桿菌感染的重要來源。胃幽門螺桿菌感染與口腔幽門螺桿菌感染密切相關(guān)。

幽門螺桿菌;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng);多態(tài)性分析

目前，胃幽門螺桿菌在我國人群中的感染率為50%以上，感染后可產(chǎn)生不同的結(jié)局，多數(shù)有不同程度慢性胃炎，部分可發(fā)生消化性潰瘍，少數(shù)發(fā)生胃惡性腫瘤[1]。研究表明，幽門螺桿菌感染后胃癌發(fā)生率增加4～9倍，且60%胃癌患者有幽門螺桿菌感染，幽門螺桿菌感染在動物模型有直接的致突變作用[2-4]。在治療上，幽門螺桿菌對抗菌藥物的耐藥性是根除治療失敗的主要因素，其次，幽門螺桿菌胃黏膜外寄生可能是治療胃幽門螺桿菌根除率低下的又一原因。臨床醫(yī)生在用藥方面急需尋求一些用于輔助改進或完善現(xiàn)有的抗菌治療方案的新的檢測方法作為指導(dǎo)，以提高胃幽門螺桿菌治療后的根除率?；谏鲜銮闆r，作者依據(jù)幽門螺桿菌的特異性引物及特異Taqman探針進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)，檢測復(fù)發(fā)者牙菌斑和胃內(nèi)幽門螺桿菌，并用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析牙菌斑和胃內(nèi)幽門螺桿菌的基因型異同，探討口腔幽門螺桿菌感染與胃幽門螺桿菌感染的相關(guān)性，以指導(dǎo)臨床在制訂胃、口同步治療的新方案上提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014年8月至2015年6月在本院消化內(nèi)科就診的27例經(jīng)PPI三聯(lián)或四聯(lián)7 d療法、規(guī)范的抗幽門螺桿菌根除治療失敗患者，并取得患者知情同意提取胃黏膜及牙菌斑標本DNA。

1.2儀器與試劑幽門螺桿菌熒光定量檢測試劑盒由上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司提供，儀器采用Roche公司的Cobas z 480熒光定量PCR儀。上海萬達科技器材服務(wù)部DY-501電泳儀。美國Bio-Rad公司的凝膠圖像分析系統(tǒng)。

1.3方法QF-PCR操作過程：口腔牙菌斑標本提取由口腔科醫(yī)生完成，用無菌潔齒器刮取齦上、齦下多牙位菌斑3～5份標本，混合放置于含200 μL TE緩沖液的Ep管中，4 ℃冰箱保存。胃黏膜標本提?。夯颊咝须娮游哥R檢查的同時在胃竇距幽門2～4 cm范圍取胃黏膜2～3塊，大小一般直徑3 mm左右，置于1.5 mL離心管中，4 ℃保存不超過24 h，密閉送檢。所有樣本-70 ℃下長期保存不超過3個月，避免反復(fù)凍融。樣本處理：樣本解凍后加入200 μL生理鹽水振蕩5 s，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加50 μL核酸提取液(內(nèi)含固體沉淀顆粒物，混勻顆粒均態(tài)分布)，再加入5 μL蛋白酶K，劇烈振蕩1 min。55 ℃水浴30～60 min，其間每間隔10 min振蕩15 s；100 ℃水浴或干浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上清液供PCR擴增用。陰性對照直接提取50 μL，加入50 μL核酸提取液，混勻后100 ℃水浴或干浴10 min，12 000 r/min離心10 min，備用(目的：監(jiān)控提取液和提取過程是否存在污染)，也可以不做處理，直接作為已提取完成的樣本加樣。試劑配制：從試劑盒中取出幽門螺桿菌反應(yīng)混合液，在室溫下融化并振蕩混勻后，2 000 r/min離心10 s。計算需準備反應(yīng)試劑人份數(shù)(n=樣本數(shù)+陰性對照數(shù)+4管定量標準品)。將幽門螺桿菌PCR反應(yīng)液充分混勻后加入Ep管中，制備混合管，隨后按36 μL/管加樣量分裝到PCR反應(yīng)管中，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。加樣：分別加入4 μL的陰性對照、定量標準品(1#～4#)、樣品處理上清液，蓋緊反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移到檢測區(qū)。PCR擴增及熒光檢測：將各反應(yīng)管按照一定順序放入PCR儀上，按以下程序進行PCR擴增：步驟1，循環(huán)數(shù)1，溫度95 ℃，3 min；步驟2，循環(huán)數(shù)40，溫度94 ℃，15 s，溫度60 ℃，30 s。檢測熒光選擇：選擇FAM熒光檢測，反應(yīng)體系總體積：40 μL。Ct≤36.0者陽性，Ct>36.0者陰性。SSCP操作過程：取牙菌斑和胃黏膜標本FQ-PCR均為陽性的產(chǎn)物按以下過程試驗，5 μL PCR產(chǎn)物中加入變性液10 μL，37 ℃水浴10 min，變性為單鏈DNA片段，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(100 V，4 h)，硝酸銀染色30 min，加入顯色液顯色，直至條帶出現(xiàn)，封膠后利用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析。

2　結(jié)　　果

2.1FQ-PCR27例患者胃黏膜及牙菌斑標本采用FQ-PCR檢測幽門螺桿菌，胃黏膜均為陽性；牙菌斑陽性25例，陰性2例。見圖1、2。

圖1　部分患者標本及幽門螺桿菌標準品的FQ-PCR擴增曲線

圖2　　幽門螺桿菌的FQ-PCR標準品標準曲線

注：單數(shù)為胃黏膜標本，雙數(shù)為牙菌斑標本。

圖33例患者胃黏膜和牙菌斑的SSCP帶型配對分析

2.2SSCP結(jié)果表明，25例牙菌斑幽門螺桿菌陽性標本中胃黏膜和牙菌斑幽門螺桿菌基因型相同者19例，表現(xiàn)為SSCP帶型一致；其余6例兩者至少有1種相同的SSCP帶型。圖3中為3例患者胃黏膜和牙菌斑的SSCP帶型配對分析，前2例患者帶型基本一致，后1例患者有1個帶相同，1個帶不同。

3　討　　論

幽門螺桿菌感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，也是胃癌的誘發(fā)因素之一，被國際癌癥研究機構(gòu)認定為Ⅰ類致癌因子[5]。近年來，三聯(lián)、四聯(lián)療法的胃幽門螺桿菌根除率呈明顯下降趨勢，究其原因：幽門螺桿菌的耐藥性[6-7]；定植密度大，不易根除；宿主的免疫狀態(tài)及患者的依從性較差；胃黏膜外有其他的幽門螺桿菌儲存灶等?？谇蛔鳛橛拈T螺桿菌的另一個儲存灶，支持了幽門螺桿菌可經(jīng)口-口及胃-口傳播的學說。常規(guī)的三聯(lián)、四聯(lián)療法雖可殺滅胃內(nèi)幽門螺桿菌，卻不能有效地根除定植于牙菌斑中的幽門螺桿菌[8]。牙菌斑屏障使口腔中的幽門螺桿菌難以根除，而口腔中持續(xù)存在的幽門螺桿菌無疑會影響胃內(nèi)幽門螺桿菌的根除效果，且會不斷地隨吞咽而進入胃內(nèi)，給后續(xù)根除治療帶來困難，并誘發(fā)幽門螺桿菌耐藥菌產(chǎn)生。

口腔與胃內(nèi)再感染幽門螺桿菌的基因是否具有同源性，作者首先運用FQ-PCR對27例根除治療失敗患者的胃黏膜及牙菌斑標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)胃黏膜27例均為陽性，牙菌斑25例陽性。牙菌斑2例陰性可能是由于菌斑量微影響PCR檢測的結(jié)果，亦或存在幽門螺桿菌其他傳播途徑。然后作者運用SSCP分析法對25例FQ-PCR均陽性的擴增產(chǎn)物進行分析發(fā)現(xiàn)，SSCP帶型19例相同，其余6例SSCP帶型至少有1種相同，表明同一患者的胃黏膜和牙菌斑中檢測到的幽門螺桿菌可能屬于同種菌株，但也不能排除少數(shù)呈不同菌株的混合性感染。從比較結(jié)果來看，作者有理由認為，口腔不僅是幽門螺桿菌在人體內(nèi)的另一個聚集地，而且口腔中寄生的幽門螺桿菌可能是胃內(nèi)幽門螺桿菌感染的重要來源之一?？赏ㄟ^基因測序進一步加以確證。由此，作者得出由于口腔是幽門螺桿菌又一聚集地，臨床上常規(guī)治療幽門螺桿菌均為口服全身給藥，藥物很難將口腔中寄生的幽門螺桿菌殺滅，其原因可能是牙菌斑中的微生物具有獨特的“生物膜”結(jié)構(gòu)，藥物不易侵入，且藥物在唾液中的水平較低，幽門螺桿菌能借此逃避抗菌藥物的殺滅，故目前的給藥方式對其作用甚微；此外，菌斑的生物膜結(jié)構(gòu)又是幽門螺桿菌避難的一道屏障，幫其逃避藥物的殺害[9]。即使胃內(nèi)幽門螺桿菌經(jīng)初次治療被根除，定植于牙菌斑中的幽門螺桿菌可釋放入唾液中，可能不斷地伴隨著吞咽運動入胃，引起胃內(nèi)幽門螺桿菌的再感染。定植于口腔中的幽門螺桿菌，是胃幽門螺桿菌根除治療失敗或再感染的重要原因。因此，口腔與胃幽門螺桿菌感染的檢測和治療同樣重要，鑒于全身用藥效果不佳，口腔幽門螺桿菌局部治療也必須同步進行，才能真正提高幽門螺桿菌的根除率[10-11]。

綜上所述，口腔是除胃以外的幽門螺桿菌又一重要定植地，胃內(nèi)幽門螺桿菌再感染與口腔內(nèi)是否存在幽門螺桿菌感染密切相關(guān)，口腔內(nèi)是否定植幽門螺桿菌是影響胃幽門螺桿菌根除治療能否成功的關(guān)鍵。

[1]徐開生，施為民．幽門螺桿菌感染的檢測方法及臨床應(yīng)用選擇[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2010，25(1)：27-29．

[2]全俊，范學工．幽門螺桿菌感染與胃癌發(fā)生的實驗研究進展[J]．世界華人消化雜志，1999，7(12)：1068-1069．

[3]Kodama M,Murakami K,Sato R,et al.Helicobacter pylori-infected animal models are extremely suitable for the investigation of gastric carcinogenesis

[J].World Journal of Gastroenterology,2005,11(45):7063-7071.

[4]Watanabe T,Tada M,Nagai H,et al.Helicobacter pylori infection induces gastric cancer in mongolian gerbils[J].Gastroenterology,1998,115(3):642-648.

[5]Venerito M,Selgrad M,Malfertheiner P.Helicobacter pylori:gastric cancer and extragastric malignancies-clinical aspects[J].Helicobacter,2013,18(Suppl1):39-43.

[6]Selgrad M,Tammer I,Langner C,et al.Different antibiotic susceptibility between antrum and corpus of the stomach,a possible reason for treatment failure of Helicobacter pylori infection[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(43):16245-16251.

[7]Gisbert JP,Romano M,Molina-Infante J,et al.Two-week,high-dose proton pump inhibitor,moxifloxacin triple Helicobacter pylori therapy after failure of standard triple or non-bismuth quadruple treatments[J].Dig Liver Dis,2015,47(2):108-113.

[8]Czesnikiewicz-Guzik M,Loster B,Bielanski W,et al.Implications of oral Helicobacter pylori for the outcome of its gastric eradication therapy[J].J Clin Gastroenterol,2007,41(2):145-151.

[9]Scherübl H,Fischbach W,Glocker E,et al.What is new in treating Helicobacter pylori infection[J].Dtsch Med Wochenschr,2015,140(4):277-280.

[10]Ferreira J,Moss SF.Current paradigm and future directions for treatment of helicobacter pylori infection[J].Curr Treat Options Gastroenterol,2014,12(4):373-384.

[11]Bang CS,Baik GH.Attempts to enhance the eradication rate of Helicobacter pylori infection[J].World J Gastroenterol,2014,20(18):5252-5262.

The correlation between helicobacter pylori infection in oral cavity and stomach

WANYangyang,CHENXiang,ZHAOPing，WANGShuo△

(FirstPeople′sHospitalofNantong，JiangsuNantong226001,China)

ObjectiveTo explore relationship between helicobacter pylori(Hp) infection in oral cavity and stomach.MethodsA fluorogenic quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR) assay with specific primers and specific Taqman probe was used to detect Hp in dental plaque and gastric biopsy in 27 patients with eradication failure.Then the products were futher processed by single-strand conformation polymorphism(SSCP).Results(1)FQ-PCR:we detected Hp in 27 gastric biopsy samples and dental plaque using fluorogenic quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR) technique.As the results,positive results could be found in 27 gastric biopsy samples.25 of positive results and 2 of negative results could be found in 27 dental plaque samples.(2)SSCP:Hp can be detected both in gastric biopsy samples and denta plaque in 25 patients,and 19 of them have the same genotype of Hp,since the banding paterns detected by SSCP method were all same in Hp from gastric biopsy and denta plaque.At least one specific banding patern by SSCP was found to be same in the Hp from dental plaques and gastric biopsy of other 6 patients.ConclusionThe results suggest that the genotype in gastric biopsy samples and dental plaque in one person may be same.Oral Hp infection may be an important source of gastric Hp infection.The Hp infection in stomach might be closely relevant to the infection in oral cavity.

helicobacter pylori;fluorogenic quantitative polymerase chain reaction;single-strand conformation polymorphism

萬洋洋，女，技師，主要從事免疫學檢驗方面的研究?！?/p>

,E-mail：wangshuo932027@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.023

A

1673-4130(2016)18-2566-03

2016-04-08

2016-06-15)