ERCC1基因多態(tài)性與肝癌患者易感性分析*

李艷秋，趙惠柳，歐　超，李美琴，利基林，朱　波

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

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·論著·

ERCC1基因多態(tài)性與肝癌患者易感性分析*

李艷秋，趙惠柳#，歐超，李美琴，利基林，朱波△

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

目的探討切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)-4533/8092位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與廣西壯族人群肝癌易感性之間關(guān)系。方法通過聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測88例原發(fā)性肝癌患者和82例健康對(duì)照者的ERCC1-4533/8092基因多態(tài)性。結(jié)果ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型在病例組和對(duì)照組的頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型在病例組和對(duì)照組的頻數(shù)分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與攜帶ERCC1-8092 CC基因型的個(gè)體相比，攜帶ERCC1-C8092 CA/AA基因型的個(gè)體具有更高的肝癌易感性(CA：OR=2.556，95%CI：1.345～4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以攜帶ERCC1-8092 C等位基因作為參照，攜帶ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。結(jié)論ERCC1-8092位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群肝癌易感性有關(guān)。

ERCC1；原發(fā)性肝癌；基因多態(tài)性；易感性

原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展是1個(gè)長期并且復(fù)雜的過程，原發(fā)性肝癌不但是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤，且初期的臨床癥狀不明顯，因此很多患者在確診的時(shí)候已經(jīng)處于原發(fā)性肝癌晚期，只有30%患者通過如手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)皮消融等方法治愈。近年在我國發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，因此原發(fā)性肝癌的早期診斷變得越來越重要[1-2]。許多研究表明，基因多態(tài)性可能和某些DNA修復(fù)基因的功能有關(guān)，這些不同的基因多態(tài)性可能與不同癌癥的易感性有關(guān)，所以，分子水平的疾病診斷可能對(duì)腫瘤的早期診斷及腫瘤的個(gè)性化治療和預(yù)后判斷做出一定的貢獻(xiàn)[2]。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)是核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)的關(guān)鍵酶，其與特異性核酸內(nèi)切酶DNA修復(fù)缺乏互補(bǔ)酶F(XPF)結(jié)合形成異源性二聚體結(jié)構(gòu)，具有識(shí)別損傷并切除5′端的雙重作用[3-4]。有研究表明，ERCC1基因多態(tài)性可以影響核苷酸切除修復(fù)過程使其功能異常，基因組的不穩(wěn)定性增加，這可能導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生[5]。因此，本研究將對(duì)ERCC1-4533/8092的多態(tài)性與廣西壯族人群的原發(fā)性肝癌易感性之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料病例組選取2015年7～12月在本院病理組織學(xué)及影像學(xué)確診未經(jīng)治療的原發(fā)性肝細(xì)胞癌88例，其中女16例，男72例；平均年齡(51.375±11.243)歲。對(duì)照組選自同醫(yī)院同期住院的非腫瘤患者82例(臨床檢查、檢驗(yàn)結(jié)果均無異常)，其中，女15例，男67例；平均年齡(53.341±15.912)歲。病例組和對(duì)照組在年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有入選研究對(duì)象均為廣西壯族人。

1.2儀器與試劑小量全血基因組DNA快速提取試劑盒、dNTPs由北京艾德萊生物科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、PmaCⅠ、Mbo Ⅱ由日本TaKaRa公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖由西班牙Biowest公司提供；ProFlex PCR儀(美國Life Techonlogies公司)；Universal Hood Ⅲ凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；DYCP-31DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1全血DNA提取抽取受檢者外周靜脈血2～3 mL置于EDTA 抗凝管中，按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作，使用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取標(biāo)本中的DNA。經(jīng)核酸濃度測定儀測量濃度后，A260/A280比值在1.8～2.0視為DNA純度合格，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2ERCC1 4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系共25 μL，含5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，滅菌雙蒸水17 μL。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[6-7]。4533位點(diǎn)：上游引物：5′-AGA TGT CCT CTG CTC ACC CC-3′，下游引物：5′-GGG AGA ACA AAG TGG CTG GA-3′，PCR反應(yīng)過程為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。目的產(chǎn)物長379 bp。8092位點(diǎn)：上游引物：5′-ACA GTG CCC CAA GAG GAG AT-3′，下游引物：5′-AGT CTC TGG GGA GGG ATT CT-3′，PCR反應(yīng)過程為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，目的產(chǎn)物長204 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下確認(rèn)為目的條帶，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物分別與10 U限制性內(nèi)切酶PmaCⅠ(ERCC1-4533)/Mbo Ⅱ(ERCC1-8092)混勻后置于37 ℃水浴箱中過夜進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下分析結(jié)果。為保證基因多態(tài)性分型的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取20%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果與第1次試驗(yàn)一致。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分別分析計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料。對(duì)照組ERCC1-4533/8092基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用非條件Logistic回歸計(jì)算ERCC1-4533/8092基因型分布的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)評(píng)價(jià)不同基因型和等位基因與肝癌易感性之間的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件錄入和分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)　　果

2.1ERCC1-4533/8092位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分析ERCC1-4533位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為379 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PmaC Ⅰ酶切后可出現(xiàn)3種情況?；蛐蜑榧兒献覩G時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)174、205 bp 2條帶，基因型為雜合子GA時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)74、205、379 bp 3條帶，基因型為純合子AA時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)379 bp 1條帶。ERCC1-8092位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為204 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mbo Ⅱ酶切后可出現(xiàn)3種情況?；蛐蜑榧兒献覥C時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)204 bp 1條帶，基因型為雜合子CA時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)204、116、88 bp 3條帶，基因型為純合子AA時(shí)電泳結(jié)果出現(xiàn)116、88 bp 2條帶。見圖1、2。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)為了檢驗(yàn)ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對(duì)對(duì)照組的ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布的觀察數(shù)和預(yù)期數(shù)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對(duì)照組標(biāo)本具有群體代表性。見表1。

2.3ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較和肝癌易感性分析ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對(duì)照組兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，以ERCC1-8092 CC基因型作為參照，ERCC1-C8092 CA基因型可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)性(OR=2.556，95%CI：1.345～4.855)，ERCC1-C8092 AA基因型可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)性(OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以ERCC1-8092 C等位基因作為參照，ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。見表2。

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-4533 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2表示純合子AA基因型：379 bp；3表示雜合子GA 基因型：174、205、379 bp；4表示純合子GG基因型：174、205 bp。

圖1ERCC1-4533基因多態(tài)性2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-8092 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2表示純合子AA基因型：116、88 bp；3表示雜合子CA基因型：204、116、88 bp；4表示純合子CC基因型：204 bp。

圖2　ERCC1-8092基因多態(tài)性2%

表2　　病例組與對(duì)照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

續(xù)表2　　病例組與對(duì)照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

注：與對(duì)照組相比，*P>0.05，#P<0.05。

3　討　　論

正常細(xì)胞主要通過核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，而ERCC1是核苷酸切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵基因。ERCC1基因最初是由HeLa細(xì)胞克隆得到，位于人類第19號(hào)(19q13.2-3)染色體上，編碼含297個(gè)氨基酸的ERCC1蛋白[8-9]。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是指基因水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率大于1%[10]。ERCC1基因多態(tài)性可能影響ERCC1 mRNA表達(dá)或穩(wěn)定及蛋白質(zhì)功能，可能使核苷酸切除修復(fù)途徑功能受影響，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性增加，進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤或其他疾病發(fā)生的惡性表型行為。有研究表明，ERCC1基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制、對(duì)鉑類等抗腫瘤藥物的反應(yīng)性及預(yù)后有密切關(guān)系[11-13]。

目前關(guān)于ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌易感性關(guān)系的報(bào)道還比較少，其位點(diǎn)是否存在多態(tài)性且與原發(fā)性肝癌易感性是否有關(guān)尚不能確定。藍(lán)永洪等[8]的研究表明，海南人群中人類ERCC1-4533G/A存在多態(tài)性。鄭霄雁[14]的研究結(jié)果顯示， ERCC1-4533/8092位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，并且這2個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性均與原發(fā)性肝癌的發(fā)生可能有關(guān)。在本次病例對(duì)照研究中，作者分析了ERCC1-4533/8092 2個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群原發(fā)性肝癌易感性之間的關(guān)系，結(jié)果表明ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型和等位基因的頻數(shù)分布在病例組和對(duì)照組兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ERCC1-8092位點(diǎn)的A等位基因可能是廣西壯族人群原發(fā)性肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，攜帶ERCC1-8092 A等位基因的個(gè)體患原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)性是ERCC1-8092 C等位基因的2.387倍(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。然而，由于本次研究收集的對(duì)象數(shù)量偏少并僅限于廣西壯族人群且只針對(duì)原發(fā)性肝癌這1種腫瘤進(jìn)行探討，因此，ERCC1-4533/8092基因多態(tài)性是否對(duì)原發(fā)性肝癌的易感性產(chǎn)生影響，是否與肝臟其他相關(guān)性疾病有關(guān)，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，擴(kuò)大疾病范圍，在不同地區(qū)、不同人群中進(jìn)行更深一步的探討。

原發(fā)性肝癌在世界腫瘤相關(guān)死亡中排名第2位，有數(shù)據(jù)顯示目前中國發(fā)病人數(shù)約占全球的原發(fā)性肝癌50%[15]。廣西是中國原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，同時(shí)也是壯族人群聚集地[16]。而ERCC1基因多態(tài)性又與鉑類化療藥物的耐藥性有關(guān)，因此對(duì)廣西壯族人群的ERCC1基因多態(tài)性進(jìn)行研究將對(duì)原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制、基因水平的疾病診斷和個(gè)性化治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

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The relationship on polymorphisms of ERCC1-4533/8092 and the susceptibility of hepatocellular carcinoma*

LIYanqiu，ZHAOHuiliu#，OUChao，LIMeiqin，LIJilin，ZHUBo△

(DepartmentofLaboratory，AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

ObjectiveTo investigate the relationship on the excision repair cross complementing gene 1(ERCC1)-4533/8092 site single nucleotide polymorphisms(SNPs) and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in Guangxi Zhuang population.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to detect the ERCC1-4533/8092 gene polymorphism in 88 cases with primary liver cancer and 82 cases of normal controls.ResultsThere was no difference in the frequency distribution of ERCC1-4533 in the case group and the control group,the frequency distribution of the ERCC1-8092 in the case group and the control group was different(P<0.05).Compared with ERCC1-8092 CC，ERCC1-C8092 CA/AA had higher risk of primary hepatocellular carcinoma(CA：OR=2.556，95%CI：1.345-4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000-75.092).ERCC1-8092 C allele as a reference，ERCC1-8092 A allele can increase the risk of primary liver cancer(OR=2.387，95%CI：1.428-3.992).ConclusionThe genetic polymorphisms of ERCC1-8092 sites are associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang population.

ERCC1；primary hepatocellular carcinoma；polymorphisms；susceptibility

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053170)。

李艷秋，女，廣西醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，主要從事血清腫瘤標(biāo)志物檢驗(yàn)、腫瘤基金分型等方面的研究。#共同第一作者：趙惠柳，女，副主任技師，主要從事腫瘤的診斷、發(fā)生、發(fā)展等方面的研究。△

，E-mail：bozhu196@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.007

A

1673-4130(2016)18-2523-03

2016-04-03

2016-06-11)