2型糖尿病患者自體血細(xì)胞葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究*

黃中偉，葛才保

(江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　211200)

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·論著·

2型糖尿病患者自體血細(xì)胞葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究*

黃中偉，葛才保

(江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科211200)

目的對2型糖尿病(T2DM)患者自體血細(xì)胞葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究。方法T2DM組(40例)、T2DM前期組(前期組，34例)、對照組(40例)抗凝全血分別加入同體積生理鹽水和ATP，37 ℃水浴3 h，觀察葡萄糖水平變化，計算葡萄糖下降值和下降比例。結(jié)果組內(nèi)比較，加ATP管葡萄糖下降值高于鹽水管(P<0.01)。組間比較，鹽水管葡萄糖下降比例，T2DM組、前期組、對照組依次增加，T2DM組低于對照組(P<0.01)，T2DM組低于前期組(P<0.05)。ATP管葡萄糖下降比例，T2DM組低于對照組(P<0.05)。T2DM患者加ATP后葡萄糖下降值由鹽水管的(2.81±0.52)mmol/L增加到(4.73±0.69)mmol/L。結(jié)論T2DM患者存在葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，與病程進(jìn)展相關(guān)，ATP能夠改善葡萄糖的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

2型糖尿?。籄TP；細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)；葡萄糖

細(xì)胞外三磷酸腺苷(eATP)作為細(xì)胞外信號分子調(diào)控細(xì)胞并參與細(xì)胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，eATP不足影響細(xì)胞內(nèi)能量代謝[1]。2型糖尿病(T2DM)糖代謝紊亂，其組織細(xì)胞的葡萄糖攝取利用能力下降，形成細(xì)胞外高糖、細(xì)胞內(nèi)低糖、能量代謝障礙。骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血細(xì)胞等組織細(xì)胞依賴eATP進(jìn)行葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，eATP不足成為T2DM的關(guān)鍵因素[2]。本文通過將T2DM患者組(下稱T2DM組)、糖尿病前期組(下稱前期組)、對照組全血樣本放置37 ℃水浴3 h，觀察葡萄糖水平變化，并外加ATP分析eATP對T2DM患者自體血細(xì)胞葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料T2DM組，40例初診T2DM患者，其中，男27例，女13例，平均年齡(59.3±12.0)歲。前期組34例，其中男22例，女12例，平均年齡(57.9±11.8)歲；6.1 mmol/L≤空腹血糖(FBG)<7.0 mmol/L，7.8 mmol/L≤餐后2 h血糖<11.1 mmol/L。對照組為健康體檢者，共40例，其中男25例，女15例，平均年齡(53.3±10.6)歲；無心血管、高血壓史及近期用藥史?？崭共杉o脈血5～6 mL，3 mL以枸櫞酸鈉抗凝，剩余分離血清作常規(guī)生化檢測。

1.2儀器與試劑HITACHI 7600全自動生化分析儀，Abbott i2000化學(xué)發(fā)光分析儀；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和葡萄糖(GLU)，Di Lab試劑；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，日本協(xié)和試劑；游離脂肪酸(FFA)，北京華宇億康生物試劑；胰島素(INSULIN)，Abbott試劑。三磷酸腺苷(ATP)注射液(20 mg/2 mL)，徐州萊恩藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1301211。

1.3方法3組人員抗凝血離心測定血漿GLU后，輕輕混勻，各吸1 mL抗凝全血于A管和B管。A管加0.2 mL生理鹽水(NS)，B管加0.2 mL ATP (eATP)，37 ℃水浴3 h，其間每30 min輕輕混勻1次，避免溶血。3 h后低速離心，檢測各管血漿GLU水平，比較各組間加NS后血漿葡萄糖(NS-GLU)和加ATP后血漿葡萄糖(eATP-GLU)下降的絕對值及下降比例。

2　結(jié)　　果

2.13組患者血清檢測一般資料，見表1。TC:T2DM組高于對照組(P<0.05)；TG:T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.05)，前期組高于對照組(P<0.05)；HDL-C:T2DM組低于對照組(P<0.01)，前期組低于對照組(P<0.05)；LDL-C:T2DM組高于對照組(P<0.05)；FFA:T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.01)，前期組高于對照組(P<0.01)。

2.2全血樣本加生理鹽水和ATP，37 ℃ 3 h，測定鹽水管葡萄糖(NS-GLU)和ATP管葡萄糖(eATP-GLU)，計算下降值和下降比例，見表2。組內(nèi)比較，eATP管顯著低于鹽水對照管(P<0.01)。組間比較，鹽水管葡萄糖下降值，T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.05)，前期組高于對照組(P<0.05)；葡萄糖下降比例，T2DM組、前期組、對照組依次增加，T2DM組低于對照組(P<0.01)，T2DM組低于前期組(P<0.05)。ATP管葡萄糖下降值，T2DM組顯著高于對照組和前期組(P<0.01)，前期組高于對照組(P<0.05)；葡萄糖下降比例，T2DM組低于對照組(P<0.05)。

表1　　3組一般資料比較

注：與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與T2DM前期組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

表2　　各組間鹽水管和ATP管37 ℃ 3 h后葡萄糖下降值和下降比例±s)

注：同組間加ATP管和鹽水對照管比較,#P<0.01;組間比較,T2DM組與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01;T2DM組與前期組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

3　討　　論

本文以枸櫞酸鈉抗凝全血樣本，在短時間內(nèi)完成試驗(yàn)，保證了試驗(yàn)過程中全血細(xì)胞的活體能量代謝，通過37 ℃水浴孵育3 h，測定葡萄糖水平的變化，觀察葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)帶來的細(xì)胞外葡萄糖改變。本文ATP以外加方法加入試驗(yàn)體系中，表現(xiàn)為eATP的作用。通過加同體積生理鹽水和ATP的試驗(yàn)管比較，分析eATP對葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。本文一般資料顯示，T2DM組、前期組、對照組符合T2DM診斷篩選標(biāo)準(zhǔn)，TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA等組間差異也符合T2DM脂代謝紊亂規(guī)律。

本文觀察到全血樣本經(jīng)37 ℃ 3 h孵育后的葡萄糖水平變化，T2DM組、前期組、對照組加ATP管都顯著低于同樣條件下的生理鹽水管(P<0.01)，充分說明外加ATP促進(jìn)了細(xì)胞外葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，即eATP促進(jìn)了葡萄糖的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。加鹽水管，對照組、前期組、T2DM組葡萄糖下降比例依次下降，表明T2DM疾病進(jìn)展中葡萄糖的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率不斷下降，T2DM患者存在葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。有學(xué)者測定健康者、糖耐量異常者、糖尿病患者37 ℃水浴1～3 h的血糖下降速率，結(jié)果平均每小時分別為0.080、0.051、0.038，也使T2DM患者葡萄糖下降速率明顯減低。全血樣本加ATP后進(jìn)一步增加了T2DM患者的葡萄糖下降值，由鹽水管的(2.81±0.52)mmol/L增加到(4.73±0.69)mmol/L，前期組也是同樣效應(yīng)；葡萄糖下降比例T2DM組與對照組的差異由P<0.01縮小到P<0.05，T2DM和前期組的差異由P<0.05縮小到無差異，外加ATP改善了T2DM組和前期組的葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。數(shù)據(jù)表明，T2DM患者存在葡萄糖的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，并與疾病進(jìn)展相關(guān)，eATP對葡萄糖的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)具有促進(jìn)作用，能夠部分緩解T2DM患者的葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，eATP通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)與T2DM的相關(guān)性值得深入研究。

病因?qū)W研究表明，腸道菌群影響機(jī)體能量代謝，與T2DM的發(fā)生密切相關(guān)[3]。通過eATP測定、腸道菌群定量分析、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究建立的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙發(fā)病機(jī)制研究表明，食品防腐劑等因素使腸道菌群數(shù)量下降，導(dǎo)致血漿eATP下降，葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，形成細(xì)胞外高糖、細(xì)胞內(nèi)低糖；葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，使胰島素效應(yīng)下降，表現(xiàn)為胰島素抵抗；葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，使細(xì)胞內(nèi)能量供給不足，特別是餐后2 h血漿eATP最低點(diǎn)，形成細(xì)胞即時分泌功能障礙，導(dǎo)致胰島素等多激素、多細(xì)胞因子分泌缺陷[4-5]。本文結(jié)果進(jìn)一步論證了細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙發(fā)病機(jī)制。

胃腸道調(diào)節(jié)血糖因素、改善β細(xì)胞功能是T2DM基礎(chǔ)研究中的難點(diǎn)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者中性粒細(xì)胞和正常血漿孵浴后的吞噬功能得到改善[7-8]。Marchetti等[9]研究表明，β細(xì)胞的糖代謝異常導(dǎo)致ATP生成不足和胰島素分泌缺陷。Bajpeyi等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，線粒體能量代謝障礙是細(xì)胞功能障礙的主要原因。這些研究表明，β細(xì)胞等機(jī)體細(xì)胞功能障礙的原因在細(xì)胞外，細(xì)胞外因素使細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞分泌功能缺陷，eATP不足和細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙都是需要研究的重點(diǎn)，本文eATP促進(jìn)了T2DM患者的葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，能否改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝和細(xì)胞功能值得探討。

有研究顯示，eATP不足與胰島素分泌缺陷相關(guān)。Na+-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、K-Na、ATPase等膜蛋白能感受細(xì)胞膜電位的變化，并與ATP消耗相關(guān)[11]。胰島素分泌研究表明，儲存池囊泡胰島素的分泌需要消耗ATP[12]。Rosenthal[13]進(jìn)一步研究證實(shí)，囊泡運(yùn)輸伴隨著eATP的下降。通過全內(nèi)反射顯微術(shù)和一種ATP敏感熒光記錄儀進(jìn)行了人和小鼠β細(xì)胞細(xì)胞膜離子通道的ATP動力學(xué)試驗(yàn)，當(dāng)葡萄糖水平升高到11～20 mmol/L時，相鄰β細(xì)胞的ATP出現(xiàn)波動，ATP PM濃度級波動與Ca2+內(nèi)流形成負(fù)反饋，ATP水平下降促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胰島素的分泌；該試驗(yàn)ATP能夠被測定，結(jié)合ATP水平下降和Ca2+內(nèi)流的特點(diǎn)，表明eATP促進(jìn)了胰島素分泌。IL-1、IL-6等炎性因子水平異常與T2DM患者的細(xì)胞功能相關(guān)[14]。Bustamante等[15]研究顯示，通過eATP促進(jìn)了骨骼肌細(xì)胞的IL-6表達(dá)，eATP能否改善β細(xì)胞的胰島素分泌缺陷，值得研究。

熱休克蛋白72(eHSP72)是重要逆境蛋白，有研究顯示，eHSP72與胰島素抵抗指數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，在ROS形成、β細(xì)胞功能障礙發(fā)生中具有一定作用[16]。說明T2DM發(fā)生機(jī)制中存在逆境因素，細(xì)胞膜K、Na-ATPase活性下降、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常表達(dá)等可能與此相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，eATP不足形成逆境損害，并進(jìn)一步形成逆境適應(yīng)，導(dǎo)致受損環(huán)節(jié)的適應(yīng)性過度表達(dá)[17]。所以，通過eATP促進(jìn)葡萄糖細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝逆境，進(jìn)一步改善細(xì)胞功能，可能是實(shí)現(xiàn)β細(xì)胞胰島素分泌缺陷逆轉(zhuǎn)的途徑之一。本文結(jié)果也顯示，eATP體外降血糖試驗(yàn)獲得成功，對T2DM患者的治療具有一定指導(dǎo)意義。因此，通過糞菌移植(FMT)、活菌制劑改善T2DM患者腸道菌群狀況，通過eATP等改善胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，通過苯甲酸鈉等食品防腐劑建立食源性、腸道菌群抑制、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的T2DM模型以及減少食品防腐劑使用抑制T2DM流行等都將是筆者的工作方向，期望T2DM的最終克服。

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Glucose membrane transport studies of blood cells in type 2 diabetes*

HUANGZhongwei,GECaibao

(LishuiDistrictPeople′sHospital,Jiangsu,Nanjing211200,China)

ObjectiveTo explore the transport capacity of glucose membrane with blood cells in type 2 diabetes.MethodsThe anticoagulated blood of T2DM(40 cases),Pre-diabetes(34 cases),control group(40 cases) were added to the same volume of saline and ATP,37 ℃ 3 h.The changes of glucose was observed,he level and Rate of glucose decreased were calculated.ResultsThe drop-out value in the groups of ATP was higher than which of salt water(P<0.05).In salt groups,the drop ratio in the T2DM,Pre-diabetes,control groups were increaseed in turn.the value of glucose in T2DM was lower than which in control group and in Pre-diabetes(P<0.05).In the ATP groups,the drop-out value in T2DM was lower than which in control group(P<0.05).To T2DM patients,the drop-out value was (2.81±0.52)mmol/L in salt grops,which was (4.73±0.69)mmol/L,respectively.ConclusionThe glucose membrane transporters for T2DM were obstacles,the obstacles associated with progression of T2DM,ATP can improve membrane transporter of glucose.

type 2 diabetes；ATP；membrane transport；glucose

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(JLY20140084)。

黃中偉，男，副主任技師，主要從事臨床生化及流式細(xì)胞術(shù)檢測分析。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.006

A

1673-4130(2016)18-2520-03

2016-04-04

2016-06-11)