血漿miR-21和TGF-β1水平在心肌梗死后與心室重構的關系*

何鳳屏，徐　新,張社兵,陳寶峰,馬占忠,袁書國,黃秀顏,劉鳳蓮,范世平,肖　政,吳東南

(汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院：1.心血管研究所；2.中醫(yī)科　512026)

?

·論著·

血漿miR-21和TGF-β1水平在心肌梗死后與心室重構的關系*

何鳳屏1，徐新1,張社兵1,陳寶峰1,馬占忠1,袁書國1,黃秀顏1,劉鳳蓮1,范世平2,肖政2,吳東南2

(汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院：1.心血管研究所；2.中醫(yī)科512026)

目的探討心肌梗死患者 microRNA-21(miR-21)和轉化生長因子(TGF)-β1的表達水平，以及調(diào)控心肌梗死后心室重構發(fā)生的作用機制。方法選取200例臨床和心電圖確診為心肌梗死患者血漿和100例健康體檢人群血漿，分別采用熒光定量PCR檢測各組血漿miR-21和TGF-β1的表達水平。結果與健康對照組比較，心肌梗死患者血漿miR-21的表達在心肌梗死后第3天、第7天、第14天，分別為0.74±0.21vs. 2.62±0.23,vs. 3.67±0.25,vs. 4.13±0.27，P<0.05；心肌梗死患者血漿TGF-β1的表達在心肌梗死后第3天、第7天、第14天，分別為0.98±0.18vs.2.35±0.24，vs. 3.67±0.25，vs. 4.13±0.27,P<0.05。心肌梗死患者血漿miR-21和TGF-β1隨著心肌梗死后心功能變化表達上調(diào)。血漿miR-21和TGF-β1mRNA與左心室舒張末內(nèi)徑呈正相關(r=0.757、0.701，P<0.05)。結論心肌梗死患者血漿miR-21和TGF-β1表達上調(diào)，miR-21和TGF-β參與調(diào)控心肌梗死后的心室重構。

心肌梗死；心室重構；microRNA-21；轉化生長因子-β1

心力衰竭是急性心肌梗死(AMI)最嚴重的并發(fā)癥之一，發(fā)病兇險，致殘率和致死率均高，目前認為心肌梗死后發(fā)生心室重構是具有一定臨床意義的。miRNA(miR)是一類非編碼的小分子RNA，通過抑制靶基因的翻譯過程，參與許多重要的生物學過程[1]。miR具有組織特異性，并在循環(huán)血中穩(wěn)定表達，越來越多的miR已成為疾病早期診斷、監(jiān)測復發(fā)的標志物和治療靶點。有研究表明，在miR心肌梗死后的病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。過表達miR-21通過調(diào)節(jié)信號傳導通路誘導的心肌細胞凋亡，促進心室重構[3]。本研究以本院患心肌梗死的住院患者為研究基礎，觀察心肌梗死過后心室重構過程中血漿miR-21和TGF-β1表達水平，并探討其發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年5月至2015年9月在本院心血管內(nèi)科住院患者200例，其中，男130例，女70例，年齡48～68歲。根據(jù)心肌梗死全球統(tǒng)一定義的第1條診斷標準[4]：心臟生化標志物(最好是肌鈣蛋白)增高或增高后降低，至少有1次數(shù)值超過參考值上限的99百分位值，并有以下至少1項心肌缺血證據(jù)：缺血癥狀；提示新的心肌缺血的心電圖變化，即新的ST段改變或左束支傳導阻滯；心電圖出現(xiàn)病理性Q波；影像學證據(jù)提示，新的活力心肌喪失或新的區(qū)域性心壁運動異常。對照組選擇100例本院健康體檢人群，其中，男50例，女50例，年齡45～65歲。

1.2儀器與試劑RNA反轉錄試劑盒和SYBR試劑(日本TAKARA公司)；化學修飾的miR-21 mimic(上海吉瑪生物有限公司)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國BIO公司)；蛋白提取試劑盒(碧云天)；TGF-β1檢測試劑盒(上海生工生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1血漿中miR的提取和檢測心肌梗死患者在發(fā)病入院后第3天、第7天、第14天采血3 mL(EDTA抗凝)離心后，應用mircute miR提取分離試劑盒(北京天根公司)提取血漿中miR。應用美國BIO公司的實時熒光定量PCR儀檢測血漿中miR-21的表達量，用TAKARA反轉錄試劑盒，利用莖環(huán)結構引物特異性反轉miR-21和U6。第一步引物退火，去2 g RNA與1 L miR-21(100 mg/L)和1 L U6(100 mg/L)特異性莖環(huán)結構引物混合，反應條件為70 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。第二步合成cDNA第1鏈，在混合物中分別加入10×buffer、2 L MgCl2(20.8 mol/L)、1 L反轉錄酶，補水至20 L，充分混勻，反應條件為37 ℃ 1 h，4 ℃ 10 min。生成的cDNA取1 L，與10 L×SYBR混合，再加入7 L水和1 L上、下游引物，混勻為20 L反應體系，反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。miR-21的表達水平用Cq值(熒光信號達到設定閾值所經(jīng)的循環(huán)數(shù))表示，U6作為內(nèi)參。引物序列，見表1。

表1　　目的基因莖環(huán)引物及PCR引物序列

1.3.2實時熒光定量PCR檢測外周血中TGF-β1mRNA心肌梗死患者在發(fā)病入院后第3天、第7天、第14天采血3 mL(EDTA抗凝)離心后，應用RNA提取分離試劑盒(北京天根公司)提取血漿中TGF-β1mRNA。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。引物設計：根據(jù)GeneBank提供的TGF-β1mRNA序列(GeneBank號：AF277993)和GAPDH 序列(GeneBank號：AY399813)由上海生工生物科技有限公司設計并提供。目的基因TGF-β1引物：上游(5′～3′)F：GACGCTGAAT GGCTCTCAGA，下游(5′～3′)R：GGACCTGC TAACCAGGCT，擴增片段長度為176 bp；內(nèi)參基因GAPDH引物：上游(5′～3′)F：ACCACCATGG AGAAGGCCGG，下游(5′～3′)R：ACAACTTTGG CATTGTG，擴增片段長度為205 bp。

1.3.3總RNA的提取取3 mL(EDTA抗凝)離心后放置于1.5 mL離心管(RNase-Free)中，然后加入1 mL Trizol，顛倒混勻后，室溫放置5 min，使其充分裂解，最后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粚⑺斜淅锏臉吮救〕鍪覝亟鈨龊螅?2 000 r/min離心5 min，棄沉淀；加入200 μL氯仿(4 ℃預冷)，顛倒混勻后室溫放置15 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相至另一離心管(RNase-Free)中，加入0.5 mL異丙醇(-20 ℃預冷)顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，RNA沉于管底；加入75%乙醇(-20 ℃預冷)，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，盡量棄上清；室溫晾干或真空干燥5～10 min，最后加入50 μL DEPC處理的H2O，適當混勻，離心備用。

1.4心肌梗死患者左心室功能的臨床資料采用心臟超聲心動圖檢查各組的左心室射血分數(shù)、左心室舒張末內(nèi)徑、左心室舒張末容積、左心室后壁厚度、舒張末室間隔厚度、左心室質(zhì)量指數(shù)的變化以及與心肌梗死后不同時間段變化的相關性，證實在不同時期MI后重構演變的表達及影響心功能異常變化，筆者采用心臟超聲心動圖檢查各組左心室功能變化，見表2。

表2　　各組心肌梗死后左心室功能變化±s)

注：與健康對照組比較，*△#P<0.05。

表2顯示，在心肌梗死后發(fā)生的第3天心肌嚴重缺血，發(fā)生左心室射血分數(shù)減少，左心室舒張末內(nèi)徑擴大，左心室舒張末容積升高；在心肌梗死后第7天心肌嚴重缺血略有改善，左心室射血分數(shù)仍顯示減少，左心室舒張末內(nèi)徑仍擴大，左心室舒張末容積升高，左心室后壁厚度和舒張末室間隔厚度顯示增厚;在心肌梗死后發(fā)生的第14天，心肌缺血有明顯改善，左心室射血分數(shù)有所升高，左心室舒張末內(nèi)徑仍顯示擴大，左心室舒張末容積升高，左心室后壁厚度和舒張末室間隔厚度顯示明顯增厚，左心室質(zhì)量指數(shù)明顯增加。

2　結　　果

2.1心肌梗死患者左心室功能的變化入選心肌梗死患者左心室功能的臨床資料見表2。心肌梗死后在不同的時間段心功能發(fā)生變化。在心肌梗死后發(fā)生的第3天心肌嚴重缺血，發(fā)生左心室射血分數(shù)明顯減少、左心室舒張末內(nèi)徑擴大、左心室舒張末容積升高，與健康對照組比較，心肌梗死后第3天的心功能變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在心肌梗死后發(fā)生的第7天心肌嚴重缺血略有改善，但是左心室射血分數(shù)減少、左心室舒張末內(nèi)徑擴大、左心室舒張末容積升高、左心室后壁厚度和舒張末室間隔厚度與第3天比較顯示增厚(P<0.05)，與健康對照組比較，心肌梗死后第7天的心功能變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在心肌梗死后發(fā)生的第14天心肌缺血有明顯改善，左心室射血分數(shù)仍未達到正常水平、左心室舒張末內(nèi)徑擴大、左心室舒張末容積升高，左心室后壁厚度和舒張末室間隔厚度分別與第3天和第7天比較顯示明顯增厚(P<0.05)，與健康對照組比較，心肌梗死后第14天的心功能變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2心肌梗死后第3天、第7天和第14天血漿miR-21和TGF-β1mRNA表達miR-21和TGF-β1mRNA在心肌梗死后發(fā)生的第3天、第7天、第14天表達上調(diào)(詳見表3)，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與健康對照組比較，心肌梗死后發(fā)生的第3天miR-21表達上調(diào)(0.74±0.21vs. 2.62±0.23，P<0.05)、心肌梗死后發(fā)生的第7天miR-21表達上調(diào)(0.74±0.21vs. 3.67±0.25，P<0.05)、心肌梗死后發(fā)生的第14天miR-21表達上調(diào)(0.74±0.21vs. 4.13±0.27，P<0.05)。TGF-β1mRNA在心肌梗死后發(fā)生的第3天、第7天、第14天表達與健康對照組比較，心肌梗死后發(fā)生的第3天TGF-β1mRNA表達上調(diào)(0.98±0.18vs. 2.35±0.24，P<0.05)、心肌梗死后發(fā)生的第7天TGF-β1mRNA表達上調(diào)(0.98±0.18vs. 3.12±0.28，P<0.05)、心肌梗死后發(fā)生的第14天TGF-β1mRNA表達上調(diào)(0.98±0.18vs. 3.96±0.31，P<0.05)。

表3　　兩組心肌梗死患者血清miR-21、TGF-β1 mRNA表達水平比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與急性心肌梗死后第3天組比較，#△P<0.05。

2.3心肌梗死患者左心室舒張末內(nèi)徑與血漿miR-21表達的相關性血漿miR-21表達水平與左心室舒張末內(nèi)徑呈正相關(r=0.757，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1　血漿miR-21表達水平與左心室舒張末內(nèi)徑關系散點圖

2.4心肌梗死患者左心室舒張末內(nèi)徑與血漿TGF-β1mRNA表達的相關性血漿TGF-β1mRNA表達水平與左心室舒張末內(nèi)徑呈正相關(r=0.701，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2　血漿TGF-β1 mRNA表達水平與左心室舒張末內(nèi)徑關系的散點圖

3　討　　論

miRNAs是一類長度約22個核苷酸的非編碼小RNA，作為基因轉錄和表達的調(diào)節(jié)者，參與眾多疾病的發(fā)病過程。microRNA是近幾年研究的熱點，已有大量研究表明，miRNAs在不同疾病及病理進程中具有特定的表達譜，并可穩(wěn)定表達于外周循環(huán)血液中，這些特點使miRNAs可作為腫瘤、自身免疫性疾病、炎性反應等多種疾病診斷及預后判斷的重要生物指標[5]。miRNAs在心血管疾病診療中的作用也逐漸受到人們的重視，血漿/血清中miRNA在心血管疾病有望成為早期診斷的重要標志物[6]。在心血管領域miR-21與心肌細胞肥厚、血管平滑肌細胞增殖及心肌梗死后重構相關[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在健康成年人中miR-21的表達與年齡呈負相關，未成年人及嬰兒心臟中miR-21的表達水平要高于成年人[9]。本文觀察到miR-21在心肌梗死后的第3天、第7天、第14天的表達均顯著增高，明顯高于健康對照組(P<0.05)，提示與心肌梗死后發(fā)生心室重構可能存在相關關系[8-9]。Roy等[10]心肌缺血再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21的靶基因是人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)miR-21在心肌成纖維細胞內(nèi)通過轉錄后下調(diào)PTEN表達水平，進而通過TEN-Akt途徑，介導TGF和金屬基質(zhì)蛋白酶的表達上調(diào)，參與心肌梗死后梗死區(qū)域膠原代謝及心室重構。Yin等[11]發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死24 h后，心肌梗死區(qū)miR-21表達顯著上調(diào)。Cheng等[12]在心肌梗死的小鼠模型中證實miR-21也參與調(diào)控心肌細胞肥大，促進心室重構。

TGF-β是一類多功能的細胞因子，包括3種不同亞型(TGF-β1、β2和β3)，其中TGF-β1生物學功能最重要。TGF-β1在心肌梗死后的不同時相的作用是不同的。心肌梗死后，非梗死區(qū)的TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ和TAK1表達水平顯著升高，可能是心肌梗死后心肌細胞肥大的刺激作用，導致心肌肥厚和心室重構的發(fā)生。新的研究表明，miR-21在心室重構的病理生理過程中可能起著十分重要的作用，miR-21可通過調(diào)節(jié)TGF-β受體Ⅲ(TGF-βRⅢ)的表達調(diào)控心臟結構重構[9]。本文中TGF-β1表達在心肌梗死后的不同時期均高于健康對照組(P<0.05)，提示TGF-β1在心肌梗死后的心肌代償性肥厚和心室重構中起到重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21、TGF-β1在心肌梗死后發(fā)生的第3天、第7天、第14天表達上調(diào)，分別高于健康對照組(P<0.05)；隨著心肌梗死發(fā)病后的時間延長，各組的心功能也發(fā)生變化。在心肌梗死后發(fā)生的第3天心肌嚴重缺血，以左心室射血分數(shù)明顯減少為主、在心肌梗死后第7天是以左心室舒張末內(nèi)徑擴大等變化為主；在心肌梗死后第14天左心室舒張末內(nèi)徑擴大、左心室后壁和舒張末室間隔增厚為主。提示miR-21、TGF-β1在心肌梗死后表達上調(diào)，與心肌梗死后發(fā)生心功能變化，包括與NYHA心功能分級和超聲心動圖指標之間存在著明顯的相關性。其病理生理機制十分復雜，存在著神經(jīng)內(nèi)分泌的激活和心室重構，心室容量和壓力負荷增加，血液動力學異常，心室壁張力增加。由于交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素、血管緊張素系統(tǒng)及循環(huán)內(nèi)分泌激活，水鈉潴留，心肌受損和心室肌細胞數(shù)量和心肌間質(zhì)組織細胞數(shù)量、質(zhì)量和排列方式的改變，肌漿網(wǎng)Ca2+通道活性及數(shù)目減少，心肌收縮耦聯(lián)過程發(fā)生變化，心肌收縮性和順應性下降，心腔擴大，導致心肌梗死后患者存在著心室重構[13]。本文對miR-21、TGF-β1在心肌梗死后發(fā)生的心功能變化進行相關分析，miR-21、TGF-β1分別與左心室舒張末內(nèi)徑呈正相關(相關系數(shù)分別為r=0.757、0.701，P<0.05)，且調(diào)整了心肌梗死相關危險因素(如性別、年齡、高血壓、糖尿病等因素)后，血漿miR-21、TGF-β1水平分別與左心室舒張末內(nèi)徑呈正相關，提示血漿miR-21、TGF-β1參與心肌梗死后患者心室重構，可作為心肌梗死后患者心室結構重構標志物，與現(xiàn)有miR-21、TGF-β1可調(diào)控心室重構進展等研究結果具有一致性。以上結果還體現(xiàn)miR-21和TGF-β1參與心肌梗死后心臟損傷和修復過程，TGF-β信號通路是調(diào)控成纖維細胞的增殖與分化的主要信號通路，提示成纖維細胞的增殖與分化在心肌梗死后的心臟重構過程中扮演重要角色[14]。

綜上所述，筆者的試驗結果證實，miR-21和TGF-β1mRNA在不同時期心肌梗死后重構演變的表達及影響心功能異常變化，可作為監(jiān)測心室重構進展的一種新的危險生物標志物，為有效預防心肌梗死后心室重構提供了新的思路和治療新靶點[15-16]。

[1]Vogel B,Keller A.Refining diagnostic microRNA signatures by whole-miRNome kinetic analysis in acute myocardial infarction[J].Clin Chem,2013,59(2):410-418.

[2]Small EM,Frost RJ,Olson EN.MicroRNAs add a new dimension to cardiovascular disease[J].Circulation,2010,121(8):1030-1032.

[3]唐艷，王夢洪．微小RNA-21對乳鼠心肌細胞凋亡及磷酸脂酶-張力蛋白同源物/絲氨酸/蘇氨酸激酶/叉頭蛋白3a信號傳導通路的影響[J].中華心血管病雜志，2013，41(2)：135-142．

[4]中華心血管病雜志編輯委員會．推薦在我國采用心肌梗死全球統(tǒng)一定義[J]．中華心血管病雜志，2008，36(10)：867-869．

[5]Mc Manus DD,Tanriverdi K,Lin H,et al.Plasma microRNAs are associated with atrial fibrillation and change after catheter ablation(the miRhythm study) [J].Heart Rhythm,2015,12(1):3-10.

[6]Liang J,Bai S,Su L,et al.A subset of circulating microRNAs is expressed differently in patients with myocardial infarction[J].Mol Med Rep,2015,12(1):243-247.

[7]Toldo S,Das A,Mezzaroma E,et al.Induction of microRNA-21 with exogenous hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemic and inflammatory injury in mice[J].Circ Cardiovasc Genet,2014,7(3):311-320.

[8]Liu X,Dong Y,Chen S,et al.Circulating MicroRNA-146a and MicroRNA-21 predict left ventricular remodeling after ST-Elevation myocardial infarction[J].Cardiolog,2015,132(4):233-241.

[9]Liang H,Zhang C,Ban T,et al.A novel reciprocal loop between microRNA-21 and TGFβRⅢ is involved in cardiac fibrosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(12):2152-2160.

[10]Roy S,Khanna S,Hussain SR,et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:microRNA-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue[J].Cardiovasc Res,2009,82(1):21-29.

[11]Yin C,Salloum FN,Kukreja RC.A novel role of microRNA in late preconditioning:upregulation of endothelial nitric oxide synthase and heat shock protein 70[J].Circ Res,2009,104(5):572-575.

[12]Cheng Y,Zhu P,Yang J,et al.Ischaemic preconditioning-regulated miR-21 protects heart against ischaemia/reperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4[J].Cardiovasc Res,2010,87(3):431-439.

[13]Dong S,Ma W,Hao B,et al.microRNA-21 promotes cardiac fibrosis and development of heart failure with preserved left ventricular ejection fraction by up-regulating Bcl-2[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(2):565-574.

[14]Dobaczewski M,Chen W,Frangogiannis NG.Transforming growth factor (TGF)-β signaling in cardiac remodeling[J].J Mol Cell Cardiol,2011,51(4):600-606.

[15]Li S,Fan Q,He S,et al.MicroRNA-21 negatively regulates Treg cells through a TGF-β1/Smad-independent pathway in patients with coronary heart disease[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(3):866-878.

[16]Yang Q,Yang K,Li A.MicroRNA-21 protects against ischemia-reperfusion and hypoxia-reperfusion-induced cardiocyte apoptosis via the phosphatase and tensin homolog/akt-dependent mechanism[J].Mol Med Rep,2014,9(6):2213-2220.

The expression levels of miR-21 and TGF-β1in cardiac remodelin affer myocardial infarction*

HEFengping1,XUXin1,ZHANGShebing1,CHENBaofeng1,MAZhanzhong1,YUANShuguo1,HUANGXiuyan1,LIUFenglian1,FANShiping2,XIAOZheng2,WUDongnan2

(1.TheCardiovascularResearchInstitute，AffiliatedYuebeiPeople′sHospitaloftheShantouUniversity,Guangdong512026,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,AffiliatedYuebeiPeople′sHospitaloftheShantouUniversity,Shaoguan，Guangdong512026,China)

ObjectiveTo detect the change of exoression level of plasma microRNA-21(miR-21) and TGF-β1in cardiac remodelin affer acute myocardial infarction(AMI) of the pateins.Methods200 pateints with AMI and 100 normal controls(age,sex matched) were enrolled.Blood samples were obtained from the normal controls and patients with AMI on the 3 days,7 days and 14 days.Real-time PCR was developed to detect the expression of miR-21 and TGF-β1in plasma.ResultsThe expression of miR-21 was significantly up-regulation in the 3 days,7 days and 14 days in MI group than that cntrol group,0.74±0.21vs. 2.62±0.23,vs. 3.67±0.25,vs. 4.13±0.27 up-regulation in the 3 days,7 days and 14 days in MI group than that cntrol group,0.98±0.18vs. 2.35±0.24,vs. 3.67±0.25,vs.4.13±0.27,P<0.05,respectively.The expression of miR-21 and TGF-β1were up-regulation with the change of cardiac function.Positive relationship between miRNA-21 expression and LVDd (r=0.757,P<0.05);Positive relationship between TGF-β1mRNA expression and LVDd(r=0.701,P<0.05).ConclusionThe expression of miR-21 and TGF-β1were up-regulation in cardiac remodelin affer AMI of the pateins,which involved in regulation in cardiac remodelin affer AMI.

myocardial infarction;cardiac remodeling;microRNA-21;TGF-β1

廣東省自然科學基金資助項目(S2013010014642)；廣東省中醫(yī)藥局科研課題(20151106)。

何鳳屏，女，教授，主要從事分子生物學方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.004

A

1673-4130(2016)18-2513-04

2016-03-16

2016-05-24)