葡萄糖激酶基因4個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病的相關(guān)性研究*

孫各琴,張秀明,羅楚君,李晶晶,韓　慧,陳　瓊

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東中山 528403)

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·論著·

葡萄糖激酶基因4個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病的相關(guān)性研究*

孫各琴,張秀明,羅楚君,李晶晶,韓慧,陳瓊

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東中山 528403)

目的探討葡萄糖激酶(GCK)基因4個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNPs)位點(diǎn)rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891與2型糖尿病(T2D)的關(guān)系。方法選取中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院住院的中國(guó)南方漢族T2D患者499例(T2D組)，同時(shí)選擇漢族健康人499例作為對(duì)照組，對(duì)GCK基因的4個(gè)tagSNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型并檢測(cè)樣本代表性。比較T2D組和對(duì)照組基因型和等位基因頻率的差異，并在3種遺傳模型下對(duì)各SNP位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析。構(gòu)建GCK基因4個(gè)tagSNPs位點(diǎn)的單體型，分析是否存在連鎖不平衡(LD)及不同的GCK單體型與T2D易感性的關(guān)系。結(jié)果rs2268573、rs2268569、rs1476891的基因型和等位基因頻率在T2D組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs12702070的基因型和等位基因分布在D2M組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在顯性遺傳模式下以及在加性遺傳模式下其基因型分布在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GCK基因4個(gè)位點(diǎn)中rs2268569、rs12702070和rs1476891有1個(gè)LD域，其中共存四種主要單體型，均與個(gè)體患T2D的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性。結(jié)論在漢族人群中，GCK基因區(qū)域的rs12702070位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性密切相關(guān)，而rs2268573、rs2268569、rs1476891位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性無(wú)明確相關(guān)性。rs2268569、rs12702070、rs1476891 LD域四種主要單體型均與個(gè)體患T2D的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性。

2型糖尿病；基因；葡萄糖激酶；多態(tài)性，單核苷酸

糖尿病是一組由胰島素分泌不足或新陳代謝紊亂所導(dǎo)致的高血糖病。據(jù)估計(jì)，2013年在中國(guó)就有9 800萬(wàn)糖尿病患者，居世界首位[1]。遺傳因素在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)和候選基因方法已被廣泛用于解釋糖尿病的遺傳基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與糖尿病相關(guān)的基因[2-3]。但是，糖尿病相關(guān)的基因數(shù)目和特性、潛在的遺傳模型以及與環(huán)境因素的相互作用還不清楚[4]。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解的關(guān)鍵酶，也是通過(guò)β細(xì)胞維持葡萄糖自身穩(wěn)定的傳感器[5]。GCK基因位于7號(hào)染色體上(7p15.3～p15.1)，由12個(gè)外顯子組成，編碼由465個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[6]。通過(guò)對(duì)GCK基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNPs)網(wǎng)上系統(tǒng)分析和文獻(xiàn)查閱，與糖尿病相關(guān)的GCK基因4個(gè)tagSNPs位點(diǎn)rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891引起了筆者的關(guān)注。因此，本研究對(duì)GCK基因上的這4個(gè)位點(diǎn)與中國(guó)漢族人2型糖尿病(T2D)易感性的關(guān)系進(jìn)行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年8月至2014年12月在本院診治的T2D患者499例(T2D組)，均符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男257例，女242例，年齡28～93歲，平均58.6歲[7]。另取同期體檢健康者499例作為對(duì)照組，其中男290例，女209例，年齡27～86歲，平均55.7歲。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(項(xiàng)目名稱(chēng)：糖尿病HbA1c相關(guān)的遺傳易感基因研究)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑DU800核酸檢測(cè)儀、5415D高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendof公司)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))，UVP 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP 公司)，血液基因組提取試劑盒(Gentra Puregene Blood Kit，美國(guó)Qiagen公司)。

1.3標(biāo)本采集入選者知情同意后簽字，分別抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫放置15 min，2 000 r /min(400 g)離心10 min，吸取上層血漿，有核細(xì)胞層經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后，置-70 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4基因組DNA提取采用Gentra Puregene Blood Kit基因組提取試劑盒，提取樣本外周血白細(xì)胞基因組DNA，DNA樣本經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行完整度檢查，核酸檢測(cè)儀測(cè)定濃度，并將樣本DNA稀釋到工作濃度(5～10 ng/L)。

1.5基因檢測(cè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)使用改良多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)(iMLDR)，所需PCR擴(kuò)增引物和多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物(表1)均由上海天昊生物科技有限公司設(shè)計(jì)，上海生工生物科技有限公司合成，按要求稀釋到指定濃度。由于待測(cè)的SNP附近有其他高頻的SNP，設(shè)計(jì)連接引物時(shí)因?yàn)楸仨毦o挨目的位點(diǎn)，所以必定要覆蓋到這些附近的SNP。因此，在設(shè)計(jì)連接引物時(shí)兩種堿基都合成，這樣才不會(huì)由于只設(shè)計(jì)其中一種，而另一種多態(tài)的染色體因?yàn)楹鸵锎嬖阱e(cuò)配而效率低，甚至不出現(xiàn)堿基峰，從而導(dǎo)致基因型判讀錯(cuò)誤。分型試驗(yàn)委托上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行。反應(yīng)體系(10 μL)包含：1×GCI buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStar Taq polymerase，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95 ℃ 2 min；11個(gè)循環(huán)(94 ℃ 20 s，65 ℃和0.5 ℃/cycle 40 s，72 ℃ 90 s)；24個(gè)循環(huán)(94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)；4 ℃ 60 min；在PCR產(chǎn)物中加入試劑盒中的ExoⅠ/SAP酶1 μL，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min；取10×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產(chǎn)物3 μL、ddH2O 3.8 μL，混勻。連接程序：38個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)；4 ℃ 60 min；取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD 9 μL HiDi混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3130 XL測(cè)序儀；收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)分析并輸出結(jié)果。

1.6相關(guān)定義如果雙親的性狀同時(shí)在F1個(gè)體上表現(xiàn)出來(lái)，這種顯性表現(xiàn)稱(chēng)為共顯性，或叫并顯性。顯性就是表現(xiàn)出來(lái)的特征，隱性是沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)但是自身攜帶。比如rs2235321(G>A)，G為野生型、A為突變型。共顯性模型假設(shè)等位基因G和A均顯性表達(dá)，致病基因型為GA、AA型；顯性模型假定突變型A為顯性致病基因，致病基因型為GA、AA型；隱性模型假定突變型A為隱性致病基因，致病基因型為AA型；超顯性模型假定純合子不發(fā)病而雜合子發(fā)病，致病基因型為GA型。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用病例對(duì)照研究。運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律檢測(cè)樣本代表性；采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理基因型和等位基因頻率結(jié)果，計(jì)數(shù)資料各百分率比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行GCK的4個(gè)位點(diǎn)tagSNPs單體型的構(gòu)建；http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm在線(xiàn)分析LD，分析是否存在LD及不同的GCK單體型與T2D風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

表1　　擴(kuò)增SNPs的引物序列

2　結(jié)　　果

2.1候選SNPs基因型與等位基因頻率采用iMLDR多重SNP分型試劑盒對(duì)998例樣本的4個(gè)SNP 進(jìn)行分型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg檢驗(yàn)平衡定律，提示所選人群具有較好代表性。通過(guò)多變量回歸分析，rs2268573、rs2268569、rs1476891的基因型(χ2值分別為3.361、0.582、0.918，P>0.05)和等位基因頻率(χ2值分別為0.222、0.590、0.851，P>0.05)在T2D組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。rs12702070的基因型(χ2值為7.990，P<0.05)和等位基因分布(χ2值為5.979，P<0.05)在T2D組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，提示此位點(diǎn)SNP多態(tài)性與T2D相關(guān)。在顯性遺傳模式下(OR=1.54，95%CI=1.17～2.04，P<0.05)以及在加性遺傳模式下(OR=1.26，95%CI=1.04～1.52，P<0.05)rs12702070的基因型分布在D2M組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)，提示此位點(diǎn)在顯性和加性遺傳模式下與T2D的易感性相關(guān)。

表2　　SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因分布在2組的分析

續(xù)表2　　SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因分布在2組的分析

表3　　不同遺傳背景下各SNP位點(diǎn)分析

表4　　rs12702070C/T、rs1476891G/A和rs2268569T/G位點(diǎn)配對(duì)單體型頻率比較

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2GCK單體型的構(gòu)建及與T2D風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行單體型構(gòu)建。GCK基因4個(gè)位點(diǎn)的3個(gè)位點(diǎn)組成LD域，即為rs2268569、rs12702070和rs1476891。GCK的rs2268569、rs12702070和rs1476891 3個(gè)位點(diǎn)共存在TAG、TGG、TAT、CGG四種主要單體型(表4)，均與個(gè)體患T2D的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性(χ2=2.718，P>0.05)。

3　討　　論

近年來(lái)，探討遺傳因素在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中的作用倍受關(guān)注。已有研究表明，鈣蛋白酶10(Calpain-10)基因、KIR6.2基因、HNF-4α基因、TCF7L2基因等與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[8]。本研究通過(guò)對(duì)GCK基因的tagSNP網(wǎng)上系統(tǒng)分析和文獻(xiàn)查閱，選取GCK基因4個(gè)tagSNP位點(diǎn)rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891，探討其與中國(guó)漢族人T2D風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。本研究在挑選位點(diǎn)時(shí)，基于以下兩點(diǎn)：(1)在疾病相關(guān)基因中，基因編碼區(qū)、5′非編碼區(qū)(5′ UTR)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)、5′附近的基因(5′ near gene)、3′附近的基因(3′near gene)的SNP位點(diǎn)，最小等位基因頻率(MAF)一般大于5%，進(jìn)入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，輸入目的基因，找出MAF頻率大于0.05的多態(tài)性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在基因的編碼區(qū)、5′ UTR、3′UTR、5′ near gene、3′near gene。同時(shí)，注意選擇人種，因?yàn)椴煌娜朔N各SNP的頻率是不同的。(2)1個(gè)基因上有很多個(gè)SNP 位點(diǎn)，并且基因上位點(diǎn)間往往是有關(guān)聯(lián)的，可以用1個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)的組合代表另外的位點(diǎn)或單體型，所以，可以挑選有代表性的位點(diǎn)來(lái)代表基因上其他的位點(diǎn)或人群中存在的常見(jiàn)單體型。在選取tagSNP時(shí)主要考慮序列范圍(一般常用基因前5k和后2k)、SNP入選頻率標(biāo)準(zhǔn)(MAF≥0.05)和r2標(biāo)準(zhǔn)(r2≥0.8)。

在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)得到：rs12702070位點(diǎn)的MAF值C在歐洲和中國(guó)南方漢族人群分別占0.08和0.076。有文獻(xiàn)報(bào)道，南斯拉夫高加索白單基因糖尿病患者出現(xiàn)rs12702070位點(diǎn)突變，而對(duì)照組未見(jiàn)該位點(diǎn)突變[9]。本研究結(jié)果顯示，GCK位點(diǎn)rs12702070與T2D有關(guān)，在對(duì)背景、年齡和性別做出調(diào)整后，仍與T2D相關(guān)。在顯性遺傳模式和加性遺傳模式下，rs12702070 tagSNPs位點(diǎn)的基因型分布在D2M組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)，提示此位點(diǎn)在顯性和加性遺傳模式下與T2D的易感性密切相關(guān)，可能增加個(gè)體患T2D的風(fēng)險(xiǎn)，支持上述文獻(xiàn)的研究結(jié)論。此外，有文獻(xiàn)還報(bào)道，印第安人群rs2268573突變與T2D有相關(guān)性，而rs2268569突變?cè)谖靼嘌廊恕W洲裔美國(guó)人、非裔美國(guó)人、中國(guó)人群與空腹血糖的水平有關(guān)，rs1476891則與空腹血糖的水平無(wú)關(guān)[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，GCK位點(diǎn)rs2268569、rs2268573、rs1476891等位基因及基因型分布頻率與健康人群相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，與上述研究不完全一致，提示這些基因與糖尿病及糖代謝的關(guān)系尚需深入研究。單體型研究結(jié)果顯示，rs12702070、rs1476891和rs2268569形成了LD域，表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，表明在這3個(gè)SNP位點(diǎn)中有基因-基因相互作用。

總之，本研究初步驗(yàn)證了在漢族人群中，GCK基因區(qū)域的rs12702070位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性密切相關(guān)，而rs2268573、rs2268569、rs1476891位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性無(wú)明確相關(guān)性。rs12702070、rs1476891和rs2268569的LD域有基因-基因相互作用。但這些突變基因的具體作用機(jī)制仍不明確，值得深入研究，可在今后結(jié)合更多臨床資料及數(shù)據(jù)進(jìn)一步對(duì)比分析。

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The relationship between glucokinase gene 4 tag single nucleotide polymorphism sites and type 2 diabetes mellitus*

SUNGeqin,ZHANGXiuming,LUOChujun,LIJingjing,HANHui,CHENQiong

(DepartmentofExaminationMedicalcenter,ZhongshanAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

ObjectiveTo investigate the relationships between Glucokinase(GCK) gene 4 tag single-nucleotide polymorphisms,tagSNPs)sites which named rs12702070,rs2268569,rs2268573 and rs1476891 polymorphisms and type 2 diabetes in Chinese Southern Han Population．MethodsThis study was designed as a case-control.499 type 2 diabetes patients and 499 healthy controls were chosen.4 GCK tagSNPs sites were analyzed by improved multiple ligase detection reaction(iMLDR),and genotype and allele frequency between T2D group and healthy controls could be determined by chi-square test,logistic regression analysis,and tagSNPs were further analyzed under three genetic modes(dominant,recessive and additive).What′s more,Haploview software was used to construct the haplotype of 4 GCK tagSNPs and the linkage disequilibrium(LD) and relationship between various GCK haplotype and T2D susceptibility could be analyzed.ResultsGenotype distribution of rs2268573,rs2268569 and rs1476891 and allele frequency in T2D group were no significant differences with health controls.Significant differences in genotype distribution of rs12702070 and allele frequency were observed between T2D group and health controls.Under dominant model and additive model,genotype distribution of rs12702070 in T2D was significantly different from health controls.One LD domain was observed in 3 tagSNPs among those 4 sites of GCK gene.There are 4 main haplotypes(TAG,TGG,TAT,CGG)in rs2268569,rs12702070 and rs1476891,but all these haplotypes have no relevance to the individual risk of T2D(P>0.05).ConclusionThe results indicated that the GCK gene tagSNPs site rs12702070 imparts susceptibility to T2D in Han Chinese,but not rs2268573,rs2268569 and rs1476891.Four main haplotypes in rs2268569,rs12702070 and rs1476891 have no relevance to T2D.

type 2 diabetes；gene；glucokinase；polymorphism,single nucleotide

廣東省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2013B02180012)。

孫各琴，女，副主任技師，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.002

A

1673-4130(2016)18-2507-04

2016-03-12

2016-05-20)