干細(xì)胞移植治療噪聲性和藥物性聾的比較實(shí)驗(yàn)研究△

朱漢卿　張軍峰　徐偵

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·實(shí)驗(yàn)研究·

干細(xì)胞移植治療噪聲性和藥物性聾的比較實(shí)驗(yàn)研究△

朱漢卿1張軍峰2徐偵3

目的比較耳蝸干細(xì)胞移植治療噪聲性聾豚鼠和藥物性聾豚鼠模型的效果。方法選用清潔級(jí)健康成年純白紅目豚鼠120只，建立噪聲性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組、噪聲性聾模型空白對(duì)照組、藥物性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組、藥物性聾模型空白對(duì)照組，每組30只；向噪聲性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組和藥物性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組耳蝸分別注入耳蝸干細(xì)胞懸液10 μl，向噪聲性聾模型空白對(duì)照組和藥物性聾模型空白對(duì)照組耳蝸分別注入10 μl生理鹽水。于術(shù)后7、28、56 d進(jìn)行ABR檢測(cè)并進(jìn)行免疫熒光觀測(cè)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和MyosinⅦA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果在噪聲性聾和藥物性聾耳蝸干細(xì)胞移植組的耳蝸鼓階處觀測(cè)到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞和MyosinⅦA陽(yáng)性細(xì)胞，但噪聲性聾干細(xì)胞移植組的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞和MyosinⅦA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于藥物性聾干細(xì)胞移植組；耳蝸干細(xì)胞移植后噪聲性聾和藥物性聾組ABR反應(yīng)閾均下降，但術(shù)后28天和56天噪聲性聾干細(xì)胞移植組ABR閾值分別為52.61±5.14和40.39±4.59 dB SPL，低于藥物性聾干細(xì)胞移植組(分別為66.39±4.77和60.41±4.17 dB SPL)。結(jié)論耳蝸干細(xì)胞移植對(duì)于噪聲性聾豚鼠模型的治療效果優(yōu)于藥物性聾豚鼠模型。

耳蝸干細(xì)胞；移植；噪聲性聾；藥物性聾

Medicine,Nanjing， 210029, China)

感音性聾主要由多種因素引起的耳蝸毛細(xì)胞倒伏、萎縮和死亡導(dǎo)致[1]。由于人類耳蝸毛細(xì)胞的再生能力很弱，所以毛細(xì)胞的損傷不可逆，從而導(dǎo)致感音性聾的治療一直是一個(gè)難題[2]。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞移植分化研究的深入，感音性聾的治療研究取得了重大進(jìn)展，即利用耳蝸干細(xì)胞移植分化為有功能性的毛細(xì)胞來(lái)治療此類疾病[3～5]。導(dǎo)致感音性聾最常見(jiàn)的病因主要有噪聲性和中毒性兩類，選用何種原因?qū)е赂幸粜悦@的動(dòng)物模型觀察耳蝸干細(xì)胞移植治療感音性聾效果最佳，值得探討；本研究嘗試以耳蝸干細(xì)胞移植治療噪聲性聾和藥物性聾豚鼠模型，比較二者的療效，為后續(xù)藥物干預(yù)研究提供方向[6，7]，報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用耳廓反射靈敏、雙耳ABR反應(yīng)閾正常(4 kHz雙耳ABR反應(yīng)閾20～35 dB SPL)的健康成年純白紅目豚鼠(清潔級(jí)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室提供)120只，雌雄不分，體重220±30 g，均排除了中耳炎；將其分為噪聲性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組(第一組)，噪聲性聾模型空白對(duì)照組(第二組)和藥物性聾模型耳蝸干細(xì)胞移植組(第三組)，藥物性聾模型空白對(duì)照組(第四組)，每組30只。

1.2噪聲性聾模型的建立60只豚鼠(第一、二組)于清醒正常狀態(tài)下放入籠內(nèi)固定于消聲室自由聲場(chǎng)中，脈沖噪聲聲源(壓力峰值為180.0 dB SPL，脈寬0.25 ms，間隔時(shí)間20秒)距離豚鼠雙耳15 cm，連續(xù)暴露300 次。噪聲暴露后1 周進(jìn)行ABR 測(cè)試，選擇4、8、16、20 kHz各頻率雙耳ABR 閾值均≥60 dB SPL的豚鼠為備選動(dòng)物。

1.3藥物性聾模型的建立60只豚鼠(第三、四組)每日肌肉注射慶大霉素100 mg/kg,連續(xù)10 d，10 d后進(jìn)行ABR測(cè)試，選擇4、8、16、20 kHz各頻率雙耳ABR閾值均≥60 dB SPL的豚鼠為備選動(dòng)物。

1.4耳蝸干細(xì)胞培養(yǎng)取新生(P0)豚鼠10只，用10%水合氯醛2 ml腹腔注射麻醉后，取出耳蝸，去除表面結(jié)締組織及血管，分離出Corti器，用HBSS液多次沖洗后將其盡量剪碎，以0.125%胰蛋白酶37 ℃消化25分鐘后200目銅網(wǎng)過(guò)濾，將濾液1 000 rpm離心4分鐘，吸管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液，按1×105個(gè)/毫升的密度裝入培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每3天半量置換培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞濃度，7天左右傳代，以Nestin進(jìn)行免疫熒光染色鑒定和Brdu標(biāo)記細(xì)胞核[8]。

1.5耳蝸干細(xì)胞移植各組豚鼠麻醉后，在左耳后分層切開(kāi)，暴露聽(tīng)泡并在鏡下打開(kāi)，在耳蝸底周鼓階外側(cè)壁下方，電鉆一0.2 mm的小孔。第一、三組于造孔處用10 μl微量注射器在10 min時(shí)長(zhǎng)內(nèi)注入10 μl耳蝸干細(xì)胞懸液；第二、四組注入10 μl生理鹽水。注射完畢留針2 min，然后以結(jié)締組織和生物膠封堵鉆孔處，逐層縫合切口。為預(yù)防中耳感染，術(shù)后肌肉注射頭孢唑啉500 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7 d[9]。

1.6聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試各組分別于內(nèi)耳注射后7、28和56 d進(jìn)行ABR測(cè)試。10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠后固定，記錄電極置于顱頂，參考電極置于左耳乳突，接地電極置于右耳乳突，以0.10 ms短音刺激，測(cè)試頻率為20 kHz，刺激頻率10次/秒，帶通慮波80～3 000 Hz，掃描時(shí)程10 ms，疊加1 024次。聲刺激從90 dB SPL起始，5 dB步距遞減，記錄ABR閾值[10]。

1.7耳蝸取材及熒光染色四組豚鼠于內(nèi)耳注射后7、28和56 d分別隨機(jī)抽取5只，以過(guò)度麻醉處死，在顯微鏡下取出聽(tīng)泡，于4 ℃下4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣3 d后置于30%的蔗糖內(nèi)浸泡12 h，用OCT膠包埋后快速冰凍切片，片厚10 μm，PBS漂洗，避光操作。于各時(shí)間點(diǎn)用MyosinⅦA免疫熒光染色檢測(cè)分化的毛細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀測(cè)并用分格計(jì)數(shù)法(分100格，每格實(shí)際長(zhǎng)度0.01 mm)進(jìn)行鏡下視野毛細(xì)胞均值計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1噪聲及藥物性感音性聾豚鼠造模完成噪聲暴露及慶大霉素注射后，第一～四組豚鼠都不同程度地出現(xiàn)煩躁、體重下降、聽(tīng)力下降，一周后ABR反應(yīng)閾均大于80 dB SPL，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳毛細(xì)胞出現(xiàn)倒伏、萎縮，部分死亡(圖1)，建模成功[11，12]。

2.2耳蝸干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定P0豚鼠耳蝸干細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)良好，單細(xì)胞呈圓球形,3～4天后逐漸匯集成團(tuán)(圖2)，Nestin熒光染色檢測(cè)呈陽(yáng)性(圖3)，用Brdu標(biāo)記細(xì)胞核(圖4)證明培養(yǎng)的是干細(xì)胞，此干細(xì)胞具有良好的增殖特性。

2.3ABR反應(yīng)閾四組豚鼠于移植前1 d、移植后7、28和56 d左耳ABR反應(yīng)見(jiàn)表1。

圖1　感音性聾豚鼠模型內(nèi)耳毛細(xì)胞(熒光顯微鏡×100)

可見(jiàn)，術(shù)后28和56 d第一、三組ABR閾值較各自空白對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明耳蝸?zhàn)⑷攵伕杉?xì)胞后豚鼠聽(tīng)功能明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)；第一組術(shù)后28和56 d聽(tīng)功能恢復(fù)要明顯優(yōu)于第三組(P<0.05)。

2.4免疫熒光檢測(cè)結(jié)果熒光顯微鏡觀察到第一組和第三組豚鼠鼓階內(nèi)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞隨時(shí)間延續(xù)逐漸減少(圖5)，其中，第一組干細(xì)胞存活數(shù)量較第三組多(P<0.05)(表2)；術(shù)后28和56 d兩組豚鼠鼓階內(nèi)均可見(jiàn)MyosinⅦA陽(yáng)性的分化毛細(xì)胞(圖6)，其中，第一組毛細(xì)胞分化數(shù)量較第三組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1　四組豚鼠干細(xì)胞移植前后左耳ABR反應(yīng)閾值(dB ±s)

注：*與第二組比較，P<0.05；#與第四組比較，P<0.05；△與第三組比較，P<0.05

表2　第一、三組術(shù)后不同時(shí)間移植干細(xì)胞存活數(shù)和毛細(xì)胞分化數(shù)(個(gè)，±s)

注：*與第三組比較，P<0.05

圖4　Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞 (熒光顯微鏡×200)

3　討論

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可以有效改善感音性耳聾患者的聽(tīng)力，但是又出現(xiàn)了移植干細(xì)胞存活率和移植后的干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞比例不穩(wěn)定的問(wèn)題[13]，因此，有必要在干細(xì)胞移植治療感音性聾時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷募?xì)分選擇，找出適合干細(xì)胞移植治療的最佳模型，以便進(jìn)一步研究[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)耳蝸干細(xì)胞移植術(shù)后7、28、56 d的ABR閾值檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白對(duì)照組，無(wú)論是噪聲性聾干細(xì)胞移植組，還是藥物性聾干細(xì)胞移植組，其ABR閾值都有明顯的恢復(fù)，同時(shí)在術(shù)后28 d和56 d的免疫熒光檢測(cè)中觀測(cè)到其鼓階內(nèi)存在大量的分化毛細(xì)胞，再次證明了耳蝸干細(xì)胞移植治療噪聲性聾和藥物性聾都是有效的。術(shù)后7 d噪聲性聾和藥物性聾干細(xì)胞移植組ABR反應(yīng)閾相對(duì)于空白對(duì)照組雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與術(shù)后7 d干細(xì)胞移植完成不久，分化為毛細(xì)胞的數(shù)量較少有關(guān)，這也從術(shù)后7 d熒光顯微鏡下觀測(cè)到大量的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞而幾乎不見(jiàn)MyosinⅦA陽(yáng)性細(xì)胞得以證實(shí)，由此可以推斷移植干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞需要一段時(shí)間，該過(guò)程至少在7 d以上，即干細(xì)胞移植治療感音性聾的見(jiàn)效時(shí)間不少于7 d。

文中結(jié)果顯示耳蝸干細(xì)胞移植術(shù)后28 d和56 d噪聲性聾和藥物性聾干細(xì)胞移植組的ABR閾值持續(xù)下降，熒光顯微鏡下可見(jiàn)分化的毛細(xì)胞數(shù)量也在持續(xù)增加，但移植后7～28 d ABR閾值下降速度優(yōu)于28～56 d，同時(shí)，免疫熒光觀測(cè)中也發(fā)現(xiàn)術(shù)后7天幾乎未見(jiàn)鼓階內(nèi)有分化的毛細(xì)胞，而到第28 d分化的毛細(xì)胞增加數(shù)要遠(yuǎn)多于術(shù)后28～56 d，說(shuō)明兩種耳聾模型的聽(tīng)力恢復(fù)都是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，但干細(xì)胞移植后近期的毛細(xì)胞分化數(shù)量對(duì)于感音性聾的恢復(fù)具有重大影響，至于術(shù)后28 d是否是毛細(xì)胞分化速率的峰值點(diǎn)，則需要更加充分的實(shí)驗(yàn)證明，這將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

從文中結(jié)果看耳蝸干細(xì)胞移植術(shù)后28 d和56 d噪聲性聾干細(xì)胞移植組的ABR閾值均明顯低于藥物性聾干細(xì)胞移植組，同時(shí)，免疫熒光檢測(cè)也可以看到噪聲性聾干細(xì)胞移植組鼓階移植的干細(xì)胞存活數(shù)量要多于藥物性聾干細(xì)胞移植組，而噪聲性聾干細(xì)胞移植組在7～28 d和28～56 d的移植干細(xì)胞死亡速率(即干細(xì)胞減少速率)都要慢于藥物性聾干細(xì)胞移植組，同樣，分化的毛細(xì)胞數(shù)量也大大多于藥物性聾干細(xì)胞移植組。由此可見(jiàn)，相對(duì)于藥物性聾，干細(xì)胞移植治療噪聲性聾的干細(xì)胞成活率和毛細(xì)胞分化率都更穩(wěn)定，聽(tīng)力恢復(fù)效果更良好；因此，建議干細(xì)胞移植治療感音性聾研究中，應(yīng)該首選噪聲性聾動(dòng)物模型；本研究為進(jìn)一步研究干細(xì)胞移植治療感音性聾，提高移植干細(xì)胞存活率和移植后的干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的比例打下了一定的基礎(chǔ)，也為本課題組后續(xù)的藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究提供了方向。

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(2016-01-01收稿)

(本文編輯雷培香)

A Comparative and Experimental Study on the Treatment of Noise Induced Hearing Loss and Toxic Hearing Loss with the Stem Cells Transplantation

Zhu Hanqing*, Zhang Junfeng, Xu Zhen

(*Department of Anatomy and Histology,Nanjing University of Chinese

ObjectiveTo compare the effect of the cochlear stem cells transplantation in treating the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model.MethodsThe Experimental guinea pigs were divided into three groups: the group of the noise induced hearing loss model treated with the cochlear stem cells, the blank control group of toxic hearing loss model treated with the cochlear stem cells and noise induced hearing loss model and the blank control group of toxic hearing loss model. The cochlear stem cells suspension and physiological saline were transplanted into the cochlear inner ears of the three groups, respectively. ABR detection and immunofluorescence observation were implemented three times in 7 days, 28days and 56 days after the operation, respectively.ResultsNestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells were detected in both of the two models treated with cochlear stem cells, but the number of Nestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells detected in noise induced hearing loss model was higher than that in the toxic hearing loss model. The ABR responses decreased on the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model treated with cochlear stem cells transplantation, but the hearing recovery of guinea pigs in the noise induced hearing loss model was superior to the toxic hearing loss model at 28 days and 56 days after operation.ConclusionThe cochlear stem cells transplantation is more effective in treating noise induced hearing loss than toxic hearing loss model.

Cochlear stem cells;Transplantation;Noise induced hearing loss;Toxic hearing loss

△江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 12KJD360002)、江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)聯(lián)合資助

1南京中醫(yī)藥大學(xué)解剖與組胚教研室(南京210029)；2南京中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室；3南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

朱漢卿，男，江蘇人，講師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞。

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.05.014

R764.43+3

A

1006-7299(2016)05-0478-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160830.1108.004.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-8-3011:08