質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體1～4的剪接體在新生大鼠前庭器官的表達(dá)△

羅蜜　褚漢啟　陶雁玲　周良強(qiáng)　陳金　劉云　潘春晨　陳請(qǐng)國(guó)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體1～4的剪接體在新生大鼠前庭器官的表達(dá)△

羅蜜1,2褚漢啟1陶雁玲1周良強(qiáng)1陳金1劉云1潘春晨1陳請(qǐng)國(guó)1

目的研究質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體(plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms，PMCAs)1～4(PMCA1～4)的A端和C端剪接變異體在新生大鼠前庭器官的表達(dá)。方法取出生2天的健康SD大鼠10只, 斷頭后分離出前庭器官(橢圓囊斑和球囊斑)，提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，檢測(cè)PMCA1～4的A端和C端剪接變異體的表達(dá)。結(jié)果在新生大鼠的橢圓囊斑和球囊斑PMCA1～4表達(dá)的剪接體分別為PMCA1x/b, PMCA2w/(a、b)，PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4 (x、z)/b。結(jié)論在新生大鼠前庭器官，PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4之間表達(dá)的A端和C端剪接變異體類型均不同, 這可能是由于橢圓囊斑和球囊斑對(duì)這些PMCA亞型有著不同的Ca2+調(diào)節(jié)需求。

質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體1～4；剪接體；橢圓囊斑；球囊斑

在內(nèi)耳，精準(zhǔn)地控制毛細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度對(duì)維持正常的聽覺和平衡覺十分關(guān)鍵。質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體(plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms，PMCAs)是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度平衡的重要蛋白質(zhì)之一，其主要作用是將細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而維持細(xì)胞內(nèi)低Ca2+水平，保證其發(fā)揮正常的生理功能。PMCAs存在4種亞型，分別是 PMCA1～4，由ATP2B1～4基因編碼，其結(jié)構(gòu)上存在兩個(gè)位點(diǎn)，分別是PMCAs胞質(zhì)區(qū)的第一個(gè)結(jié)構(gòu)環(huán)(A端)和PMCAs胞質(zhì)尾端的C末端(C端)[1]。PMCA1～4結(jié)構(gòu)序列的 A 端和C 端存在著不同形式的剪接體[2]，這些剪接體可以通過調(diào)節(jié)調(diào)控元件來影響PMCA1～4的排鈣能力[3]。已證實(shí)PMCA2突變的小鼠出現(xiàn)平衡功能障礙，主要是由于前庭毛細(xì)胞內(nèi)的Ca2+不能有效地進(jìn)入內(nèi)淋巴液，導(dǎo)致球囊和橢圓囊中的耳石無法形成[4]，從而無法感受直線加速度運(yùn)動(dòng)的刺激。目前有關(guān)PMCAs在內(nèi)耳的研究主要集中在耳蝸，其在前庭的研究甚少[4]。因此，本研究擬通過檢測(cè)新生大鼠前庭器官(橢圓囊斑和球囊斑)PMCA1～4的A端和C端剪接體的表達(dá)，為更深入地研究其在前庭器官的功能提供參考，同時(shí)為治療與PMCAs有關(guān)的內(nèi)耳疾病(如PMCA2基因突變所致的耳聾)提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇出生后第2天的健康SD大鼠10只，無中耳感染、耳毒性藥物應(yīng)用及強(qiáng)噪聲暴露史。所有動(dòng)物由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物委員會(huì)同意，具備實(shí)驗(yàn)合格證書。

1.2主要試劑和儀器Trizol (Invitrogen，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO， 日本)，PCR 引物(上海生工公司)，GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，顯微解剖鑷(瑞士Dumont公司)，解剖顯微鏡(日本Nikon 公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1球囊及橢圓囊取材取10只新生大鼠頸椎脫臼法處死，打開前庭窗，用分離針沿前庭窗后下緣挑開前庭外側(cè)骨壁，充分暴露前庭池內(nèi)的球囊。用微細(xì)分離針首先在球囊的前緣劃開骨膜，沿球囊背側(cè)與前庭內(nèi)側(cè)壁之間緊貼骨壁直至分離，直至整個(gè)球囊游離，用微細(xì)分離針挑開球囊的囊壁并輕輕挑除耳石膜取出球囊斑。同法取橢圓囊斑。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)Trizol法提取總RNA，按照 TOYOBO 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后以cDNA為模板，行聚合酶鏈反應(yīng)。PMCA1～4的A端和C端剪接體引物見引文[2，5，6]。PMCA1～4的A端剪接體引物如下。PMCA1：F，5′-TAGGCACCTTTGTGGTGCAG-3′，R，5′-CGGCTCTGAATCTTCTATCC-3′；PMCA2：F，5′-GAAAGCTCGCTCACAGGGGAG-3′, R,5′-ACCCATGGTCTCACAGGCG-3′；PMCA3：F，5′-CATGTCATGGAAGGTTCTGG-3′，R ,4′-GTTATTGTCCTTCATCATTTTCTT-3′；PMCA4：F，5′-GTGACTGCTGTG GGAATCAA-3′，R，5′-GTTGTTGTCCTTCATCATTTTCTT-3′；PMCA1～4的C端剪接體引物如下。PMCA1: F, 5′-TAGGCACCTTTGTGG TGCAG-3′,R，5′-CGGCTCTGAATCTTCTATCC-3′; PMCA2: F, 5′-AAGATCCACGGCGAGCGTAAC-3′, R, 5′-GCTCG AGTTCTGCTTGAGCGC-3′;PMCA3: F, 5′-GTCCAATTTGGAGGGAAGCC-3′, R, 5′-CGTTGTTGTTCTGGTT AGGG-3′; PMCA4, F, 5′-ATGCCGA GATGGAGCTTCGC-3′, R, 5′-CAGCATCCGACAGGCGCTTG-3′。內(nèi)參為β-actin: F, 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3, R, 5′-TCTGCTGGAAGGTGGACAGT-3′。PCR循環(huán)條件：預(yù)變性95 ℃5分鐘，變性94 ℃45秒，退火55～60 ℃45秒，延伸72 ℃45秒，終末延伸72 ℃10分鐘(變性、退火、延伸共計(jì)30個(gè)循環(huán))；所得產(chǎn)物5 μl在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，在GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)下成像。

2　結(jié)果

2.1PMCA1～4的A端和C端剪接變異體在新生大鼠橢圓囊斑的表達(dá)在橢圓囊斑(U)樣本，PCR引物在PMCA1的A端和C端分別擴(kuò)增出519 bp和430 bp大小的條帶(圖1)，分別稱為剪接體x和b；在PMCA2的A端和C端分別擴(kuò)增出762 bp和552 bp、325 bp大小的條帶(圖2)，分別稱為剪接體w和a、b，其中b的表達(dá)較弱；在PMCA3的A端和C端分別擴(kuò)增出521 bp和646 bp、492 bp、579 bp大小的條帶(圖3)，分別稱為剪接體z和a、b、c；在PMCA4的A端和C端分別擴(kuò)增出524 bp、488 bp和260bp大小的條帶(圖4)，分別稱為剪接體x、z和b。

2.2PMCA1～4的A端和C端剪接變異體在新生大鼠球囊斑的表達(dá)在球囊斑(S)樣本，PCR引物在PMCA1的A端和C端分別擴(kuò)增出519 bp和430 bp大小的條帶(圖1)，分別稱為剪接體x和b；在PMCA2的A端和C端分別擴(kuò)增出762 bp和552 bp、325 bp大小的條帶(圖2)，分別稱為剪接體w和a、b，其中b的表達(dá)較弱；在PMCA3的A端和C端分別擴(kuò)增出521 bp和646 bp、492 bp、579 bp大小的條帶(圖3)，分別稱為剪接體z和a、b、c；在PMCA4的A端和C端分別擴(kuò)增出524 bp、488 bp和260 bp大小的條帶(圖4)，分別稱為剪接體x、z和b。

3　討論

在內(nèi)耳，前庭系統(tǒng)的生理功能對(duì)維持身體平衡非常重要，而Ca2+參與維持前庭平衡功能[4]。PMCA在未激活狀態(tài)下對(duì)Ca2+的親和力很低(平衡解離常數(shù)Kd約為10 μM)，不具備清除細(xì)胞內(nèi)Ca2+的能力，因此，需要啟動(dòng)一些機(jī)制來提高它與Ca2+的親和性。通過調(diào)節(jié)PMCA結(jié)構(gòu)上的兩個(gè)位點(diǎn)可激活其鈣泵功能，其中一個(gè)位點(diǎn)位于PMCA胞質(zhì)尾端的C末端(C端)[7]，通過它可以調(diào)節(jié)PMCA與鈣調(diào)節(jié)蛋白(calmodulin)的親和性，而鈣調(diào)節(jié)蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的激活劑[8,9]，能將Ca2+的Kd從10 μM降到200 nM；另一個(gè)位點(diǎn)是位于PMCA胞質(zhì)區(qū)的第一個(gè)結(jié)構(gòu)環(huán)(A端)[10]，磷脂類物質(zhì)對(duì)它的激活作用甚至強(qiáng)于鈣調(diào)節(jié)蛋白，能將Ca2+的Kd從10 μM降到100 nM[11]。PMCA1～4的A端和C端均存在不同的剪接方式[2]，其中A端由含33、36、39、42和60個(gè)核苷酸的外顯子以不同的組合形式剪接而成，產(chǎn)生剪接體w、x、y和z；C端的剪接方式更復(fù)雜，由含55、68、87、88、114、154、172和178個(gè)核苷酸的外顯子以不同的組合形式剪接而成，產(chǎn)生剪接體a、b、c、d、e和f。PMCA1～4的A端和C端的剪接形式影響其排鈣能力。

圖1RT-PCR方法檢測(cè)PMCA1在新生大鼠前庭橢圓囊斑(U)和球囊斑(S)表達(dá)電泳圖

在PMCA1的A端，U和S均擴(kuò)增出一條 519 bp大小的條帶，稱為剪接體x；在PMCA1的C端，U和S均擴(kuò)增出一條430 bp大小的條帶，稱為剪接體b。左側(cè)條帶為標(biāo)記物Marker。β-actin為內(nèi)參條帶

圖2RT-PCR方法檢測(cè)PMCA2在新生大鼠前庭橢圓囊斑(U)和球囊斑(S)表達(dá)電泳圖

在A端, U和S均擴(kuò)增出一條762 bp大小的條帶，稱為剪接體w；在C端， U和S均擴(kuò)增出兩條 552 bp和325 bp 大小的條帶，分別稱為剪接體a和b，其中b的表達(dá)量較弱。左側(cè)條帶為標(biāo)記物Marker。β-actin為內(nèi)參條帶

圖3RT-PCR方法檢測(cè)PMCA3在新生大鼠前庭橢圓囊斑(U)和球囊斑(S)表達(dá)電泳圖

在A端, U和S均擴(kuò)增出一條521 bp大小的條帶，稱為剪接體z；在C端， U和S均擴(kuò)增出三條646 bp、492 bp和579 bp大小的條帶，分別稱為剪接體a、b和c。左側(cè)條帶為標(biāo)記物Marker。β-actin為內(nèi)參條帶

圖4RT-PCR方法檢測(cè)PMCA4在新生大鼠前庭橢圓囊斑(U)和球囊斑(S)的表達(dá)電泳圖

在A端, U和S均擴(kuò)增出兩條524 bp和488 bp大小的條帶，稱為剪接體x和z；在C端， U和S均擴(kuò)增出一條260 bp大小的條帶，分別稱為剪接體b。左側(cè)條帶為標(biāo)記物Marker。β-actin為內(nèi)參條帶

PMCA1和PMCA2是表達(dá)于前庭毛細(xì)胞的兩種主要PMCA亞型，其表達(dá)的剪接體類型也有報(bào)道[12,13]。由于前庭毛細(xì)胞缺少Na/Ca交換體，因此，其主要依靠PMCA1和PMCA2排出細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，保證前庭毛細(xì)胞發(fā)揮正常的生理功能。最新研究發(fā)現(xiàn)PMCA2的表達(dá)水平隨著聽覺系統(tǒng)的發(fā)育成熟逐漸升高[14]，PMCA2結(jié)構(gòu)上的一個(gè)新的突變位點(diǎn)dfwi5 聯(lián)合Cdh23突變可導(dǎo)致耳聾和平衡功能失調(diào)[15]，進(jìn)一步證實(shí)了PMCA2在耳蝸和前庭發(fā)揮重要的作用。有關(guān)PMCA3和PMCA4在前庭器官的表達(dá)也有少量報(bào)道[12]，但PMCA3和PMCA4的剪接體在哺乳動(dòng)物前庭器官的表達(dá)尚不明確，PMCA3可能參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)控，PMCA4可能參與協(xié)助其他PMCA亞型發(fā)揮作用[13]。

本研究結(jié)果顯示新生大鼠前庭器官的橢圓囊斑和球囊斑表達(dá)的PMCA1～4的A端和C端剪接體類型一致，均為PMCA1x/b, PMCA2w/(a、b)，PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4 (x、z)/b。有研究證實(shí)，在大鼠前庭器官，PMCA1主要表達(dá)在前庭毛細(xì)胞側(cè)膜，PMCA2主要表達(dá)在前庭毛細(xì)胞纖毛[16]。結(jié)合本研究，可以推測(cè)PMCA2w/(a、b)是表達(dá)于大鼠前庭毛細(xì)胞纖毛的剪接體，PMCA1x/b是表達(dá)于前庭毛細(xì)胞側(cè)膜的剪接體。為了探討不同類型的剪接體之間的功能差異，有學(xué)者將攜帶z/a、z/b、w/a和w/b的質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，然后觀察其對(duì)ATP所激發(fā)的短暫的胞內(nèi)Ca2+電流的峰值及Ca2+濃度恢復(fù)到正常水平速度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)z/a、z/b和w/b的排鈣能力無明顯差異，相比而言，w/a對(duì)Ca2+內(nèi)流的快速反應(yīng)能力較差，但它在基礎(chǔ)Ca2+水平時(shí)的排鈣能力較強(qiáng)[16]。值得注意的是，大鼠耳蝸毛細(xì)胞纖毛表達(dá)的主要剪接變異體是PMCA2 w/a[17]，而本研究發(fā)現(xiàn)前庭毛細(xì)胞纖毛表達(dá)的剪接體也以PMCA2w/a為主，w/a的這種功能特點(diǎn)符合毛細(xì)胞對(duì)Ca2+的需求，即在靜息狀態(tài)下毛細(xì)胞纖毛保持低Ca2+水平，從而保證其具有最佳的機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性。PMCA2突變的小鼠出現(xiàn)平衡功能障礙[4]，結(jié)合PMCA2w/a在基礎(chǔ)Ca2+水平時(shí)排鈣能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，推測(cè)w/a與大鼠發(fā)育中前庭囊斑耳石的形成有密切關(guān)聯(lián)。從本研究結(jié)果看新生大鼠前庭毛細(xì)胞表達(dá)的PMCA2的C端剪接體主要是a, 此外還有少許b, 這和Dumont 在成年牛蛙和大鼠感覺上皮毛細(xì)胞纖毛的發(fā)現(xiàn)相似[12]。毛細(xì)胞纖毛偏向“選擇”剪接體2a，可能是因?yàn)?a與2b在結(jié)構(gòu)上的CaM-BD氨基酸序列不同，2a自我抑制狀態(tài)較2b不穩(wěn)定，故2a與Ca2+-鈣調(diào)蛋白的親和力低于2b。毛細(xì)胞纖毛間不斷進(jìn)行著機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，纖毛內(nèi)Ca2+濃度變化頻繁，剪接體2a與鈣調(diào)蛋白的親和力低于2b，對(duì)鈣調(diào)蛋白的依賴性低，在鈣調(diào)蛋白缺如的情況下也可以起作用[18]。

PMCAs的剪接體與PMCAs在極性細(xì)胞的定位有一定的關(guān)系。剪接體PMCA1x參與其頂端定位，將PMCA1x/b的剪接體b剪切掉后，PMCA1由原來的側(cè)膜定位變成在頂膜、側(cè)膜表達(dá)[19]，從而可以解釋PMCA1x/b表達(dá)在毛細(xì)胞胞膜(頂膜和側(cè)膜區(qū)域)。PMCA1可以通過C末端(即剪接體PMCA1b)與細(xì)胞側(cè)膜區(qū)域PDZ-domain(PSD95/D1g/ZO-1的縮寫，PSD是突觸后致密蛋白，ZO-1是緊密連接蛋白-1，基因discs large編碼的蛋白稱D1g蛋白)結(jié)合從而介導(dǎo)其與多種蛋白作用，使之二聚化激活其活力，PDZ-protein有質(zhì)膜鳥苷酸激酶(MAGUK)家族、脅道相關(guān)蛋白(SAP)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶(CASK)、Na+/H+交換體調(diào)節(jié)因素2、PISP、Ania3/Homer protein(Homer蛋白Ania3)[20]。PMCA2 在極性細(xì)胞的頂膜定位由其A 端剪接體決定，與 C 端剪接體無關(guān)。剪接體w決定PMCA2 在極性細(xì)胞的頂膜定位，如毛細(xì)胞[12]以及乳腺上皮細(xì)胞[21]，而z 決定PMCA2 在細(xì)胞胞體側(cè)膜定位[1,19]。

目前有關(guān)PMCA1和PMCA2在內(nèi)耳的分布及功能方面的研究較多，但有關(guān)PMCA3和PMCA4在內(nèi)耳的研究很少。PMCA3的表達(dá)局限，主要分布在大腦脈絡(luò)膜血管叢[22]和骨骼肌[23]。在內(nèi)耳，有學(xué)者通過原位雜交方法檢測(cè)到PMCA3在出生至成年大鼠的耳蝸-前庭神經(jīng)元表達(dá)[6]，但PMCA3在前庭組織表達(dá)的剪接體類型尚不清楚。本文首次報(bào)道新生大鼠前庭上皮表達(dá)的PMCA3的A端和C端剪接體分別為z和a、b、c；而在新生大鼠耳蝸， PMCA3表達(dá)的C端剪接體也為a、b和c[6]，這說明PMCA3在耳蝸和前庭表達(dá)的剪接體類型一致。PMCA4是一種管家基因，表達(dá)于很多類型的細(xì)胞[24]，PMCA4除了發(fā)揮防止Ca2+超載的基本功能外，也在特定的組織發(fā)揮著特殊的功能，比如參與精子活性、平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)及B淋巴細(xì)胞和其他組織內(nèi)的Ca2+信號(hào)調(diào)控[4]。PMCA4在發(fā)育中的耳蝸組織中表達(dá)非常微弱，只在出生后第12天的耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞有短暫的高表達(dá)[6]；本研究首次發(fā)現(xiàn)PMCA4在新生大鼠橢圓囊斑和球囊斑表達(dá)的剪接體為PMCA4 (x、z)/b；膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族的成員通過PDZ區(qū)域介導(dǎo)的相互反應(yīng)與PMCA4b關(guān)聯(lián)[25]，PMCA4b是一氧化氮合酶1(NOS-1)的負(fù)調(diào)控因子，這種生理活動(dòng)的開始同時(shí)需要PMCA4的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)和介于PMCA4b和NOS-1之間的PDZ區(qū)域介導(dǎo)的反應(yīng)[26]。目前尚無研究發(fā)現(xiàn)PMCA3和PMCA4與前庭平衡功能直接關(guān)聯(lián)，但不排除它們協(xié)助PMCA2維持前庭平衡功能。

PMCA 的四種亞型在同一種屬中有75%～85%的同源性和85%～90%的相似性[27]，它們的主要功能基本相同，即將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子排到細(xì)胞外，這些PMCA 亞型共同的結(jié)構(gòu)是該鈣泵基本的組成部分，而PMCA不同的剪接體則可能與各個(gè)鈣泵的特異功能有關(guān)，從而滿足不同的組織或細(xì)胞的生理需求。盡管最近幾年有關(guān)PMCAs 的研究有了很大的進(jìn)展，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，PMCA 的3D結(jié)構(gòu)的闡明還沒有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展；隨著PMCAs 在不同組織、細(xì)胞甚至細(xì)胞某個(gè)區(qū)域中所發(fā)揮的作用引起越來越多的關(guān)注，相信以后有關(guān) PMCA 1～4及其剪接體在內(nèi)耳發(fā)揮的功能將得到更充分的認(rèn)知。

1Chicka MC, Strehler EE. Alternative splicing of the first intracellular loop of plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2 alters its membrane targeting[J]. J Biol Chem, 2003, 278:18464.

2Crouch JJ, Schulte BA. Identification and cloning of site C splice variants of plasma membrane Ca-ATPase in the gerbil cochlea[J]. Hear Res, 1996, 101: 55.

3Carafoli E. Plasma membrane calcium pump: structure, function and relationships[J]. Basic Res Cardiol, 1997, 92:59.

4Prasad V, Okunade G, Liu L, et al. Distinct phenotypes among plasma membrane Ca2+-ATPase knockout mice[J]. Ann NY Acad Sci, 2007, 1099:276.

5Kamagate A, Herchuelz A, Bollen A, et al. Expression of multiple plasma membrane Ca2+-ATPases in rat pancreatic islet cells[J]. Cell Calcium, 2000, 27：231.

6Furuta H, Luo L, Hepler K, et al. Evidence for differential regulation of calcium by outer versus inner hair cells: plasma membrane Ca-ATPase gene expression[J]. Hearing Res, 1998, 123:10.

7Brodin P, Falchetto R, Vorherr T, et al. Identification of two domains which mediate the binding of activating phospholipids to the plasma-membrane Ca2+pump[J]. Eur J Biochem, 1992, 204:939.

8Gopinath RM, Vincenzi FF. Phosphodiesterase protein activator mimics red blood cell cytoplasmic activator of (Ca2+-Mg2+) ATPase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1977, 77:1203.

9Jarrett HW, Penniston JT. Partial purification of the Ca2+-Mg2+ATPase activator from human erythrocytes: its similarity to the activator of 3':5' - cyclic nucleotide phosphodiesterase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1977, 77: 1210.

10Pinto Fde T, Adamo HP. Deletions in the acidic lipid-binding region of the plasma membrane Ca2+pump. A mutant with high affinity for Ca2+resembling the acidic lipid-activated enzyme[J]. J Biol Chem, 2002, 277:12784.

11Enyedi A, Flura M, Sarkadi B, et al. The maximal velocity and the calcium affinity of the red cell calcium pump may be regulated independently[J]. J Biol Chem, 1987, 262:6425.

12Dumont RA, Lins U, Filoteo AG, et al. Plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2a is the PMCA of hair bundles[J]. J Neurosci, 2001, 21:5066.

13Polimeni M, Prigioni I, Russo G, et al. Plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms in frog crista ampullaris: identification of PMCA1 and PMCA2 specific splice variants[J]. Hear Res, 2007, 228:11.

14Watson CJ, Lies SM, Minich RR, et al. Changes in cochlear PMCA2 expression correlate with the maturation of auditory sensitivity[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2014, 15:543.

15Watson CJ, Tempel BL.A new Atp2b2 deafwaddler allele, dfw(i5), interacts strongly with Cdh23 and other auditory modifiers[J]. Hear Res, 2013, 304:41.

16Ficarella R, Di Leva F, Bortolozzi M, et al. A functional study of plasma-membrane calcium-pump isoform 2 mutants causing digenic deafness[J]. Proc Natl Acad Sci, 2007, 104: 1516.

17Chen QG, Chu HQ, Wu XH, et al. The expression of plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2 and its splice variants at sites A and C in the neonatal rat cochlea[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2011, 75:196.

18Elwess NL, Filoteo AG, Enyedi A, et al. Plasma membrane Ca2+pump isoforms 2a and 2b are unusually responsive to calmodulin and Ca2+[J]. J Biol Chem, 1997, 272: 17981.

19Grati M, Aggarwal N, Strehler EE, et al. Molecular determinants for differential membrane trafficking of PMCA1 and PMCA2 in mammalian hair cells[J]. J Cell Sci, 2006, 119:2995.

20Vorherr T, Kessler T, Hofmann F, et al. The calmodulin-binding domain mediates the self-association of the plasma membrane Ca2+pump[J]. J Biol Chem, 1991, 266:22.

21Reinhardt TA, Filoteo AG, Penniston JT, et al. Ca2+-ATPase protein expression in mammary tissue[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2000, 279: C1595.

22Stahl WL, Eakin TJ, Owens JW Jr, et al. Plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms: distribution of mRNAs in rat brain by in situ hybridization[J].Brain Res Mol Brain Res, 1992,16 :223.

23Greeb J, Shull GE. Molecular cloning of a third isoform of the calmodulin-sensitive plasma membrane Ca2+-transporting ATPase that is expressed predominantly in brain and skeletal muscle[J]. J Biol Chem,1989，264:18569.

24Hammes A, Oberdorf S, Strehler EE, et al, Differentiation-special isoform mRNA expression of the calmodulin-dependent plasma membrane Ca2+-ATPase[J]. FASEB J, 1994, 8:428.

25Kim E, DeMarco SJ, Marfatia SM, et al. Plasma membrane Ca2+ATPase isoform 4b binds to membrane-associated guanylate kinase(MAGUK) proteins via their PDZ(PSD95/Dlg/ZO-1) domains[J]. J Biol Chem, 1998, 273: 1591.

26Schuh K, Uldrijan S, Telkamp M, et al. The plasma membrane calmodulin-dependent calcium pump: a major regulator of nitric oxide synthase I[J]. J Cell Biol, 2001, 155: 201.

27Strehler EE. Recent advances in the molecular characterization of plasma membrane Ca2+pumps[J]. J Membr Biol, 1991, 120: 1.

(2016-02-16收稿)

(本文編輯周濤)

The Expression of Plasma Membrane Ca2+-ATPase Isoforms 1～4 and the Splice Variants at Sites A and C in the Neonatal Rat Vestibular Organ

Luo Mi*, Chu Hanqi, Tao Yanling, Zhou Liangqiang, Chen Jin,Liu Yun, Pan Chunchen, Chen Qingguo

(*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030，China)

ObjectiveTo study the expression of plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 1-4 and the splice variants at sites A and C in the neonatal rat vestibular organ. MethodsTen rats at postnatal 2 days (P2) were decapitated and their vestibular organs (macula utriculi and macula sacculi) were isolated. The total proteins of the vestibular organs were extracted. The expression of PMCA1-4 splice variants at sites A and C was detected by RT-PCR. ResultsThe splice variants of PMCA1-4 at sites A and C in macula utriculi and macula sacculi of neonatal rat vestibular organs were PMCA1x/b, PMCA2w/(a，b)，PMCA3z/(a,b,c)and PMCA4 (x,z)/b.ConclusionThe splice variants at sites A and C among PMCA1, PMCA2, PMCA3 and PMCA4 were different in the vestibular organs of neonatal rats, which could be explained that macula utriculi and macula sacculi had different requirements of Ca2+turning for these PMCA isoforms.

Plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 1～4;Splice variants；Macula utriculi；Macula sacculi

△國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助(81300827)

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(武漢430030)；2湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

羅蜜，女，湖北人，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槁犛X生理。

陳請(qǐng)國(guó)(Email:cqg198292@126.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.05.013

R764.3

A

1006-7299(2016)05-0473-05

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-2916：16

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160629.1616.070.html