人發(fā)角蛋白凝膠對(duì)L-929細(xì)胞的增殖作用研究*

陳劍斌，許少波

(廣東省醫(yī)療器械研究所/國(guó)家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510500)

1 引 言

角蛋白具有良好的生物相容性、可在體外和動(dòng)物體內(nèi)生物降解、可促進(jìn)成纖維細(xì)胞粘附和分化、具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、可自組裝等優(yōu)點(diǎn)，而且源于人發(fā)的角蛋白還具有高生物活性、低免疫排異性、來(lái)源幾乎不受限制等特點(diǎn)，尤其適合應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究[1]。對(duì)人發(fā)角蛋白的研究，包括作為神經(jīng)植入材料、皮膚敷料、涂層材料、人工肌腱、止血材料、支架基材等方面的研究證明，人發(fā)角蛋白對(duì)包括人角膜上皮、肺上皮、真皮成纖維細(xì)胞、成骨及成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等都具有明顯的增殖促進(jìn)作用，可以加速多種組織再生[2-3]。使用角蛋白用于軟組織填充的研究報(bào)道較少，多直接使用人發(fā)顆粒進(jìn)行[4]。為此，我們提取了人發(fā)角蛋白，制備成可注射的角蛋白凝膠，并進(jìn)行了動(dòng)物皮下植入的實(shí)驗(yàn)[5]。本研究評(píng)價(jià)了該凝膠的吸水性能及對(duì)L-929細(xì)胞的增殖作用，進(jìn)一步探討該材料作為軟組織填充材料應(yīng)用前景。

2 材料和方法

2.1 角蛋白溶解

從理發(fā)店收集的人發(fā)，經(jīng)除雜后，使用堿性洗滌劑進(jìn)行浸泡清洗3次、在50℃下烘干、烘干后的頭發(fā)按照頭發(fā)∶三氯甲烷100∶300的比例，在70攝氏度下回流2 h進(jìn)行脫脂。按照雙氧水和氨水1∶3的比例混合后，將頭發(fā)浸入進(jìn)行脫色，清洗烘干后剪成1～2 cm的長(zhǎng)度備用。

脫色后的頭發(fā)，按照頭發(fā)4%，脲45%，SDS2%，巰基乙醇3%的比例在55℃下提取12 h。將反應(yīng)液在2 500 g下離心(JW1024，安徽嘉文儀器裝備有限公司)20 min后，取上層清液置于MWCO 8000-14000Da透析袋(Solarbio)中，按照1∶200的比例采用去離子水透析48 h，期間去離子水每6 h更換一次。透析液置于透析袋中，埋置于聚乙烯醇粉末中進(jìn)行濃縮，濃縮后稀釋成20%的角蛋白溶液在4℃下冷藏備用。

2.2 角蛋白可注射凝膠的制備

20%的角蛋白溶液，經(jīng)室溫開(kāi)放放置24 h后，可形成角蛋白膜，該膜經(jīng)研磨過(guò)200目篩，取適量粉末裝入注射器備用。注射器在使用前，連接過(guò)濾孔徑為2 um的一次性過(guò)濾膜，吸入75%乙醇進(jìn)行滅菌，反復(fù)吸入生理鹽水清洗后，排除多余的生理鹽水。注射器內(nèi)粉末呈凝膠狀態(tài)的微粒，易于直接注射植入。

2.3 SDS-PAGE

采用MiniProtein II 垂直電泳系統(tǒng)(MiniProtein II， BIO-RAD公司)對(duì)角蛋白進(jìn)行分離標(biāo)記。20%的角蛋白溶液先用純水稀釋至1 mg/ml，然后取100 ul與等量SDS緩沖液混合，煮沸5 min使角蛋白變性，隨后放置于冰上。取20 ul冷卻的的變性溶液加入預(yù)先配置好的5～12%的梯度tris-HCL凝膠中，恒壓80 v 30 min后，再調(diào)至120 v 100 min。電泳分離后，用純化水沖洗凝膠5 min，重復(fù)兩次，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較。

2.4 傅立葉變換紅外光譜

其中：當(dāng)頂?shù)装逋队懊娣e相對(duì)差<40%時(shí)，V=(S1+S2)×H/2；當(dāng)頂?shù)装逋队懊娣e相對(duì)差>40%時(shí)，

金華寺湯溪鎮(zhèn)寺平古村主要的保護(hù)模式為劃歸為文物，售票觀覽。單一的盈利方式導(dǎo)致未來(lái)面臨的困境是可以預(yù)見(jiàn)的，如何打開(kāi)瓶頸投入活化更新項(xiàng)目，促進(jìn)傳統(tǒng)村落可持續(xù)發(fā)展是值得思考的問(wèn)題。但還要防止進(jìn)入另外一個(gè)誤區(qū)，即在中國(guó)的許多傳統(tǒng)村落，由沿街商鋪的商戶(hù)構(gòu)成的多以游客市場(chǎng)篩過(guò)“經(jīng)得起市場(chǎng)檢驗(yàn)”的特色小食、區(qū)域特產(chǎn)、文藝小鋪以及飾品首飾為主流的產(chǎn)業(yè)［1］。這些所謂的“主流”沒(méi)有地域特色，很難成長(zhǎng)為支撐傳統(tǒng)村落持續(xù)發(fā)展的產(chǎn)業(yè)。

2.5 吸水性能

由于注射器中的角蛋白粉末測(cè)試吸水率有一定的難度，實(shí)驗(yàn)測(cè)試角蛋白膜的吸水率反映可注射凝膠的吸水率，如圖3(A)是制備的角蛋白膜經(jīng)過(guò)干燥后的吸水率變化曲線(xiàn)，其最大吸水率只能達(dá)到320%左右，而未干燥的角蛋白膜B，其含水率為142%左右，對(duì)純水的吸水率可以達(dá)到850%左右。A1和A2是A在吸水后重復(fù)測(cè)試的吸水率變化曲線(xiàn)，B1和B2則是B在吸水后重復(fù)測(cè)試的吸水率變化曲線(xiàn)，可以看出他們整體上與A的吸水率變化和最大吸水率較為接近。

實(shí)驗(yàn)在Shindai 法[6]基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)一定的修改，同樣采用巰基乙醇還原人發(fā)角蛋白的方法，為避免角蛋白的降解，實(shí)驗(yàn)溫度控制在55℃，還原12 h，提取率相比Shindai 法的61%～65%稍有降低，接近58%，基本保持了人發(fā)角蛋白的三種組分：構(gòu)成頭發(fā)中間絲的α-角蛋白(50～65 KD)以及填充中間絲之間的基質(zhì)蛋白(30KD)[7]。

上述2組吸水后的材料重復(fù)2次進(jìn)行干燥、吸水，測(cè)試材料吸水率的變化。

S%=(Swet-S)/ Sx 100%,其中S為膜干燥后的重量,對(duì)于組1，S=S1；對(duì)于組2，S=S2×W%。

2.6 細(xì)胞增殖性能

Mtt比色法可用來(lái)定量測(cè)量體外細(xì)胞的增殖，活力和材料的細(xì)胞毒性。小鼠成纖維細(xì)胞系l-929(南方醫(yī)科大學(xué))復(fù)蘇后置入含血清(杭州四季青生物工程有限公司)的DMEM(美國(guó)GIBCOBRL公司)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，凝膠的提取按照標(biāo)準(zhǔn)iso 10993-5的方法，提取液選用純DMEM培養(yǎng)基，2 g凝膠使用20 ml提取液浸提24 h。陰性對(duì)照為純DMEM培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照為5%二甲基亞砜DMSO溶液。以浸提液和2%體積比的血清為培養(yǎng)介質(zhì)，每樣品各5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。各觀察期，在細(xì)胞拍照后，每孔加入20 ulMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，小心吸去液體，加入二甲基亞砜DMSO 150 ul/孔，避光振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上以570 nm波長(zhǎng)測(cè)其OD570值。相對(duì)細(xì)胞增殖率(RCV%)可以從下面公式計(jì)算。

從圖2中可以看出，人發(fā)角蛋白與角蛋白膜的紅外光譜均有明顯的酰胺Ⅰ帶(分別在1656cm-1及1650cm-1處，代表C=O的伸縮振動(dòng)峰)、酰胺Ⅱ帶(分別在1541cm-1及1543cm-1處，代表N-H的變角振動(dòng)峰)、酰胺Ⅲ帶(分別在1215cm-1及1233cm-1處，代表C-N的伸縮振動(dòng)峰)，表現(xiàn)為典型的蛋白質(zhì)物質(zhì)[8]。此外，角蛋白中625 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅳ帶O=C-N的變形振動(dòng)峰，角蛋白膜中687 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅴ帶N-H的變形振動(dòng)峰。

RCV%=(ODTEST/ODCONTROL)×100%

將角蛋白溶液放置表面皿中，-40℃冷凍后凍干(SCIENTZ-10N,寧波新芝)，與人發(fā)、角蛋白膜分別研磨后，分別與溴化鉀混合壓片，在400 到 4000 cm-1之間測(cè)試紅外(布魯克BRUKER TENSOR 27)

3 結(jié)果與討論

3.1 SDS-PAGE分析

圖1為提取的角蛋白SDS-PAGE圖，中間2條為樣品角蛋白溶液的條帶，左右兩側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過(guò)對(duì)照，提取的人發(fā)角蛋白的三條普帶，分別對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的30、50和 65 KD三部分，其中65 KD的角蛋白分布較窄，其余兩個(gè)組分的條帶相對(duì)較寬，而50 KD位置的顏色相對(duì)較深。

2014年7月以來(lái)本科室共接收新入科護(hù)士20人,年齡20歲~24歲,其中本科14人,大專(zhuān)6人。男性:9人 女性:11人,全部為應(yīng)屆畢業(yè)生。

基于對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究成果的深入分析，課題組自1998年起就聚焦創(chuàng)新學(xué)習(xí)內(nèi)涵、特征與策略等理論問(wèn)題的研究，初步建構(gòu)出創(chuàng)新學(xué)習(xí)理論框架。以更新教師教學(xué)觀念為主要目標(biāo)，課題組組織了數(shù)百場(chǎng)次的教師培訓(xùn)。

圖1 人發(fā)角蛋白SDS-PAGE圖

3.2 紅外

隨著生活水平的不斷提高，人們?cè)絹?lái)越講究均衡營(yíng)養(yǎng)，一些高脂肪食物已在市場(chǎng)銷(xiāo)售中遭遇冷淡，而一些“素”、“粗”、“雜”的蔬菜、野果與五谷卻日益受到青睞，野菜、野果、人造植物肉、蔬菜制品、高梁、玉米、大豆等已成為人們飲食中必不可缺少的食物。吃粗防病、吃雜亦補(bǔ)，吃素益壽的觀念正在流行起來(lái)。

對(duì)比人發(fā)的紅外譜圖發(fā)現(xiàn)，酰胺Ⅱ帶特征峰和酰胺Ⅲ帶特征峰的位置變化不大，說(shuō)明這兩處的分子基團(tuán)及其振動(dòng)種類(lèi)未發(fā)生變化。而人發(fā)紅外譜圖中2876 cm-1和2962 cm-1處的紅外吸收峰在角蛋白中則變化為2962 cm-1和2924 cm-1處，發(fā)生該變化的主要原因是因?yàn)槿税l(fā)角蛋白提取過(guò)程中，頭發(fā)中的二硫鍵(-CH2-S-S-CH2-)發(fā)生斷裂，C-H中C的電子云密度降低，使C-H的伸縮振動(dòng)譜帶向低波數(shù)移動(dòng)。另外，角蛋白中985 cm-1處的吸收峰代表了胱氨酸殘基C-S的特征吸收峰，1043 cm-1處的吸收峰為S=O的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，這兩處吸收峰在人發(fā)紅外譜圖中均未出現(xiàn)，說(shuō)明了人發(fā)中的一部分二硫鍵基團(tuán)轉(zhuǎn)化成了磺酸根[9]。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)從頭發(fā)中提取的人發(fā)角蛋白溶液，仍具有多肽特征。

圖2 人發(fā)和人發(fā)角蛋白的紅外譜圖

3.3 吸水性能

實(shí)驗(yàn)對(duì)角蛋白膜進(jìn)行吸水性能的測(cè)試，用于間接反映角蛋白水凝膠的水合性能。將直接制備的角蛋白膜分成2組，組1在40℃真空下烘干，計(jì)算含水率W%， 組2 則不經(jīng)烘干處理，兩組均在稱(chēng)重(S1,S2)后室溫下浸入純水中，在不同時(shí)間后取出，去除多余的水分后再次稱(chēng)重(Swet)。吸水率S%的計(jì)算按照以下公式:

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為控制人發(fā)角蛋白凝膠的吸水率提供依據(jù)，制備的膜或粉末在未完全干燥的狀態(tài)下，會(huì)保持較高的吸水率或膨脹率。若控制干燥程度，勢(shì)必影響凝膠的吸水率，從而為凝膠的應(yīng)用提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于A在20～30 min接近最大吸水率，B膜只需要10 min即可接近最大吸水率，說(shuō)明完全干燥的角蛋白材料，吸水溶脹的速率要小于完全干燥的材料。相對(duì)于報(bào)道的角蛋白海綿吸水率(367%～554%)[10]，不干燥角蛋白膜有著更高的吸水率，而且所有膜的吸水速率均大于海綿，海綿材料需要20 h以上的時(shí)間能達(dá)到溶脹平衡。

圖3 角蛋白膜的吸水過(guò)程

3.4 細(xì)胞增殖

小鼠成纖維細(xì)胞系L-929在對(duì)照溶液、角蛋白提取液以及陽(yáng)性對(duì)照中的細(xì)胞生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖4，總體來(lái)看細(xì)胞在對(duì)照溶液、角蛋白提取液中的數(shù)量逐步增加，且細(xì)胞形態(tài)正常，少量的死亡細(xì)胞呈現(xiàn)圓形且亮度明顯，符合細(xì)胞的正常代謝。而陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞幾乎全部死亡，呈現(xiàn)出規(guī)則圓形和少量細(xì)胞碎片。利用測(cè)試的OD570值經(jīng)過(guò)計(jì)算，角蛋白浸提液的RCV%在三個(gè)測(cè)試期的平均增值率分別達(dá)到119%、122%和123%。

FeOx摻雜對(duì)CeO2納米晶催化甲烷選擇氯氧化反應(yīng)性能的影響 …………………何潔麗，嚴(yán) 亞，楊 蓉，李婧煒（48）

圖4 不同實(shí)驗(yàn)階段L-929細(xì)胞形貌

人發(fā)角蛋白的細(xì)胞相容性和對(duì)細(xì)胞的增殖已經(jīng)被很多研究證實(shí)，F(xiàn)rancesca T等[11]分別制備了人發(fā)角蛋白的涂層和水凝膠，采用L929小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)該角蛋白水凝膠(涂層)和膠原I型水凝膠(涂層)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，角蛋白比膠原成倍的提高了細(xì)胞的粘附、增殖和細(xì)胞的生存能力。Stephan[12]通過(guò)對(duì)12種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，受角蛋白膜材料作用的細(xì)胞中，有9種表現(xiàn)出優(yōu)異的增殖現(xiàn)象。

作為動(dòng)物植入實(shí)驗(yàn)的前提，我們對(duì)自行制備的角蛋白凝膠的細(xì)胞毒性進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅僅72 h的培養(yǎng)，人發(fā)角蛋白已表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用?？紤]到該實(shí)驗(yàn)是在37℃下對(duì)角蛋白凝膠只進(jìn)行了24 h的浸提，由于角蛋白的交聯(lián)作用，浸提液在受凝膠作用較弱的狀態(tài)下，可達(dá)到對(duì)L929 10%左右的促進(jìn)增殖作用，可以預(yù)見(jiàn)該材料與細(xì)胞的長(zhǎng)期作用將會(huì)更加明顯。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用一種新的方式，制備的人發(fā)角蛋白可注射凝膠，具有較高吸水率，良好的細(xì)胞相容性，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖。由于未使用其他交聯(lián)劑，該材料可在體內(nèi)快速降解。作為一種同種異體材料，人發(fā)角蛋白凝膠有望在皮膚創(chuàng)傷及其他軟組織缺陷修復(fù)方面獲得進(jìn)一步研究和應(yīng)用。